OPTIMASI BIOTRANSFORMASI TOTAL STEROL LIMBAH TAHU MENGGUNAKAN MYCOBACTERIUM PHLEI DSM 43286 MENJADI 1,4-ANDROSTADIEN-3,17-DION, DENGAN PENGARUH VARIASI KONSENTRASI INHIBITOR A, A’- DIPIRIDIL

  ISSN : 1693-9883 Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.1, A pril 2004, 47 - 57

OPTIM ASI BIOTRAN SFORM ASI TOTAL STEROL LIM BAH TAHU M EN GGUN AKAN DSM 43286 M YCOBACTERIUM PHLEI

  

M EN JADI 1,4-AN DROSTADIEN -3,17-DION ,

DEN GAN PEN GARUH VARIASI

KON SEN TRASI IN HIBITOR A, A’- DIPIRIDIL

  M ar yati Kur niadi, Usman Sumo Fr iend Tambunan, Har mita

  Depar temen Far masi, FM IPA Univer sitas Indonesia

ABSTRACT

  Isolation of total sterol from waste product of soy bean cake has been conducted,

followed by biotransformation to 1,4-androstadien-3,17-dione (A DD). The waste

product consist of; β -sitosterol, stigmasterol, kaemfesterol, which are isolated by

column chromatography technique using silica gel as stationary phase and chloro-

form as mobile phase. Biotransformation was conducted by using M ycobacterium

phlei DSM 43286 in the present of α , α ’ - dipiridil as an inhibitor with concentra-

tion of 0,5; 1; 1,5; 2,0 mM . The main product of biotransformation were A DD and

pregnenolon. The optimum yield of A DD 0,48% is achieved by adding 1,5 mM α ,

  α ’ - dipiridil are two hours after addition of substrate and 72 hours of incubation time.

   M ycobacterium phlei D SM 43286; α , α ’ - dipiridil concentra-

  Key Words: tions.

  PEN D A HULUA N

  hormon steroid, yang tersedia dalam Masalah peningkatan kesejah- jumlah yang banyak dengan harga teraan keluarg a tid ak lep as d ari yang murah. Suatu hasil antara yang masalah p engend alian kelahiran. penting dalam sintesis hormon ste- Meskipun jumlah penduduk terus roid dari senyawa sterol alam adalah bertambah, namun dalam kenyata- 1,4-and ro stad ien-3,17-d io n (A DD) annya angka pertumbuhan penduduk d an 4-and ro sten-3,17-d io n (A D). mengalami penurunan yang cukup A DD dan A D dapat disintesis me- berarti. Di balik keberhasilan ini lalui biotransformasi dari sitosterol, adalah peran kontrasepsi oral, yang yang didapat dari minyak kacang umumnya mengandung hormon ste- kedelai atau limbah tahu (Kim 1986).

  β-sitosterol yang mempunyai rantai roid (Anonim 2000). Fito stero l merup akan materi samping jenuh tidak dapat dihilang- aw al yang potensial untuk sintesis kan secara kimia tanpa fragmentasi

  Corresponding author : Fax.: (021) 7863433. dari cincinnya. A kan tetapi dengan cara biotransformasi rantai samping tersebut dapat dihilangkan. Novcha d an kaw an-kaw an (No vcha et al; 1978), melaporkan bahan β-sitosterol dapat dibiotransformasi dengan M y-

  cobacterium fortuitum A TCC 6842

  menghasilkan ADD dan AD. Knight dan Wovcha juga melaporkan bahwa

  M ycobacterium fortuitum

  UCC 9778 dapat mendegradasi kolesterol dan sterol lain dari tumbuhan menjadi campuran senyaw a fenol (A nonim 2001).

  Faktor yang penting pada bio- transformasi adalah seleksi bakteri, yang dapat mengkatalisis suatu re- aksi d eng an hasil semaksimum mungkin. Bakteri yang dapat digu- nakan untuk biotransformasi koles- terol dan β-sitosterol menjadi ADD dan A D adalah M ycobacterium phlei dan

  A rthrobacter simplex

  (Hockenhul 1971; Martin 1984). Agar proses biotransformasi da- pat berlangsung dengan baik, maka molekul substrat harus dapat ber- interaksi sedemikian rupa, sehingga kemampuan katalitik enzim tidak diinaktivasi oleh substrat ataupun produknya. Konsentrasi substrat dan w aktu penambahan substrat yang memberikan hasil bio transfo rmasi o ptimum harus ditentukan secara eksperimen (Leuenberger 1984). Jika substrat sukar larut dalam air, maka dapat diatasi dengan menambahkan suatu surfaktan misalnya tw een 80 (Crueger 1984).

  Produk yang diinginkan sering- kali terurai menjadi senyaw a lain.

  Untuk mencegah hal tersebut dapat ditambahkan inhibitor enzim yang bekerja dengan mengkhelat ion Fe ²⁺ yang terd apat pad a Sito kro m P ₄₅₀

  (Luenberger 1984). Zat penghambat enzim yang sering digunakan adalah α, α’ -d ipirid il, 8-hid ro ksiquino lin y ang merup akan seny aw a p eng - khelat ion Fe ⁺² dan senyawa tersebut relatif lipofilik sehingga dapat me- nembus membran sel d an meng- khelat ion Fe

• ⁺² (A rima 1980; Martin 1977).

  Dalam proses ini diperlukan juga penambahan inhibitor, yaitu untuk menghambat kerja enzim 9 α-hidrok- silase, yaitu enzim yang mengkata- lisis reaksi yang dapat mengakibat- kan pemecahan cincin steroid (Torrey 1984).

  Jumlah A DD y ang d ip ero leh p ad a p ro ses bio transfo rmasi ter- gantung pada konsentrasi dan waktu penambahan zat penghambat enzim. Bila konsentrasi penghambat enzim terlalu besar atau w aktu p enam- bahannya terlalu dini, maka reaksi hidroksilasi C ₂₇ juga akan terhambat, sehing g a A DD y ang berbentuk sedikit. Sebaliknya jika konsentrasi terlalu kecil atau w aktu p enam- bahannya terlalu lambat maka 9 α- hidroksilase tidak terhambat secara sempurna, sehingga substrat akan terdegradasi menjadi CO ₂ dan H ₂ O. Kedua hal ini mengakibatkan berku- rangnya jumlah ADD pada hasil akhir biotransformasi (A rchi 2001). Hasil penelitian terdahulu, menunjukkan waktu penambahan inhibitor enzim terbaik adalah 2 jam setelah substrat d itambahkan d an w aktu inkubasi 72 jam (Kurniadi 2003).

  Tujuan p enelitian ini ad alah memp ero leh A DD o p timum d ari hasil biotransformasi sterol total lim- bah tahu menggunakan M ycobacte-

  AMPAS TAHU Stero l to tal d ari amp as tahu diisolasi dengan cara kromatografi kolom (Skema 1). Sampel diperoleh dari pabrik tahu di daerah Rawasari,

  Penyiapan bakteri untuk biotrans- formasi

  Bakteri y ang d ip ero leh d ari PA U Bio tekno lo g i ITB Band ung , diremajakan setiap 2 minggu sekali d alam agar miring d engan med ia Low enstein-Jensen.

  Peremajaan bakteri

  CARA KERJA Skema d an cara kerja iso lasi ekstrak lipid dari ampas tahu dapat dilihat pada Skema 1. Sterol dianalisis secara kuantitatif. meng g unakan spektrofotometer visibel dengan pe- reaksi Lieberman – Burchad seba- nyak 6 mL.

  Neraca analitis (Shimadzu Libror A EG-225), p enggerak p utar (Shi- mad zu), sentrifuse (Kubo ta 5100), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-265), ultrasonik (Branson 3200), KLT-d ensito meter (Shimad zu CS 9301), kolom kromatografi dengan diameter dalam 2,4 cm dan panjang 30 cm serta GC - MS.

  Jakarta pada bulan Februari 2002. A LA T

  BAHAN KIMIA Bahan kimia yang d igunakan yaitu Stigmasterol (Merck), β-Sito- stero l (Merck), Metano l (Merck), Etanol (Merck), Etilasetat (Merck), ADD (Sigma), α, α’-dipiridil (Sigma), CHCl ₃ (Ridel-de Haen), n-Heksana (Merck).

  rium phlei DSM 43286. Penelitian

  Bahan yang d igunakan yaitu Nutrient broth (Merck), nutrient agar (o xo id ) serta med ia Lo w enstein- Jensen.

  diperoleh dari PAU Institute Tekno- logi Bandung. MEDIA

  M y cobacterium phlei DSM 43286

  BA HA N BIA KA N Biakan yang d igunakan yaitu

  BA HA N DA N CA RA KERJA

  dititik beratkan pada pengaruh kon- sentrasi inhibitor α, α’-dipiridil ter- hadap produksi ADD.

  Media pembenihan dibuat de- ng an m enim bang 3,75 N utrien bro o th o xo id, lalu dimasukkan ke dalam labu 500 mL.Gliserol ditam- bahkan sebanyak 7,5 mL ke dalam labu 500 mL, air ditambahkan sampai 150 mL, kemudian dimasukkan ke dalam 3 Erlenmeyer, masing-masing 50 mL dan disterilkan dalam autoklaf Ampas tahu kering + 250 g

  

Diekstraksi dua kali dengan kloroform : metanol (2 : 1, v/v) 600 mL

  (ekstrak lipid)

• 135 mL 0,88% larutan KCl Ekstrak lipid (lapisan bawah)
• air : metanol (1 : 1, v/ v), 85 mL didiamkan semalam labu takar dicukupkan 250,0 ml dengan kloroform

  1,0 mL sisa

  SKEM A CA RA KERJA ISOLA SI EKSTRA K LIPID D A N PEN ETA PA N KA D A R STERO L

• Liebermann Burchard 6,0 mL diuapkan di atas penangas air hingga kering di ukur serapannya dengan spektrofotometri visibel pada λ= 614,6 nm kolom kromatografi preparatif diuapkan cairan kental kadar sterol total dalam ampas tahu Skema 1.

selama 20 menit dengan pemanasan 121°C.

  Ke dalam tiap Erlenmeyer yang berisi med ia p embenihan d iino - kulasikan 1 loop ose bakteri

  M ycobac- terium phlei DSM 43286 lalu dikocok,

  diinkubasi di atas rotary shaker (alat penggerak putar dengan kecepatan 100 rpm) pada suhu kamar hingga di- p ero leh p ertumbuhan bakteri se- besar 10 ⁹ / mL. Perkembangan jumlah bakteri d iamati secara sp ektro - fotometri pada panjang gelombang, λ= 600 nm. Suspensi bakteri dalam med ia bio transfo rmasi yang telah hampir mencapai fase statis dituang ke d alam Erlenmeyer yang berisi substrat yang steril. Inkubasi dilaku- kan di atas penggerak putar pada suhu kamar. Untuk kontrol hanya d igunakan med ia bio transfo rmasi dan substrat.

  Pengaruh variasi konsentrasi in- hibitor α, α’-dipiridil yaitu 0,5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mM, 2 jam setelah sub- strat d itambahkan d engan w aktu inkubasi 72 jam. pH diukur sebelum dan sesudah biotransformasi.

  Ekstraksi hasil biotransformasi

  Sebelum analisis dilakukan, hasil biotransformasi diekstraksi dua kali masing-masing dengan 12,5 mL klo- ro fo rm. Lap isan klo ro fo rm y ang membentuk emulsi d ikump ulkan dan disentrifus dengan kecepatan 2500 rp m selama 20 menit. Fase organik diambil dan disaring dengan kertas saring ke d alam labu ukur 25 mL dan ditambahkan kloroform hingga 25 mL.

  Analisis hasil biotransformasi Analisis kualitatif Spektrum serapan uv Untuk mengetahui, apakah se- lama proses biotransformasi suspensi

  Stigmasterol dan β-Sitosterol telah diubah menjadi senyawa lain, maka dibuat spektrum serapan dari ekstrak n-heksana yang diperoleh dari hasil biotransformasi dan dibandingkan dengan spektrum serapan Stigmas- terol, β-Sitosterol, dan ADD standar.

  Harga R _f pada KLT Ko nd isi p erco baan KLT yang digunakan yaitu : Fase diam : lapisan tipis ketika silika gel F ₂₅₄ tebalnya 0,25 mm

  Fase gerak : siklo heksana-eti- lasetat-air (60:40:0,1).

  A nalisis kuantitatif

  A nalisis d engan KLT-d ensito - meter Hasil elusi yang diperoleh dari hasil analis kualitatif d ianalisis dengan KLT-densitometer. Pengu- kuran dilakukan pada panjang ge- lombang maksimum dari baku pem- banding dan hasil biotransformasi. Data yang d ip ero leh berup a luas puncak.

  HA SIL D A N PEM BA HA SA N

  HA SIL Hasil penetapan kadar terhadap sterol hasil pemurnian dari sampel ampas tahu seberat 18,20 d engan pelarut teknis, menunjukkan bahwa sampel tersebut mengandung sterol sebesar 0,14% b/ b terhad ap berat kering sampel.

  Kurva kalibrasi

  Data hasil kalibrasi susp ensi bakteri dengan spektrofotometer uv- vis dapat dilihat pada Tabel 1 berupa garis lurus dengan persamaan garis y =0,1847+0,4818x d eng an fakto r regresi, r ² = 0,9918. Hasil kalibrasi

  A DD stand ar d ap at d ilihat p ad a Tabel 2. Kurva berupa garis lurus dengan persamaan garis y = -16,7353

• 0,0478x dengan faktor (koefisien) regresi, r
² = 0,9876

  Pengukuran pH

  pH med ia bio transfo rmasi se- belum proses dimulai adalah 7,0 – 8,0 dan setelah proses biotransformasi selesai, pH berkisar antara 5,4 – 5,7.

  Analisis kualitatif hasil biotrans- formasi Spektrum serapan uv Spektrum serapan A DD mem- berikan serapan maksimum pad a panjang gelombang, λ = 243,0 nm, β-sitosterol pada, λ = 201,6 nm, stig- masterol pada λ = 202 nm, sedangkan sp ektrum serap an hasil bio trans- fo rmasi y ang d ilakukan d eng an spektro fo to meter uv dapat dilihat pada Gambar 1. Hasil biotransfor- masi memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 205,6 nm, 233,8 nm, 243,0 nm, 280,2 nm.

  Harga R _f pada KLT Kro mato g ram hasil bio trans- fo rmasi d an A DD stand ar y ang diperoleh secara KLT dapat dilihat pada Gambar 2. ADD standar mem- berikan serapan maksimum pad a p anjang g elo mbang , λ = 251 nm dengan nilai R _f sebesar 0,32 sedang- kan hasil biotransformasi bercak b

  Tabel 2. Data hasil kalibrasi ADD standar

No Berat ADD (ng) Area (µv/s)

1 609,6 15,262

  2 812,8 18,546 3 1219,2 40,702 4 1422,4 52,729 Keterangan : digunakan untuk perhitungan pengaruh konsentrasi α, α ^, - dipiridil terhadap ADD hasil biotransformasi.

  Tabel 1. Data serapan suspensi bakteri pada panjang gelombang λ=600 nm No Konsentrasi bakteri 10 ⁸ sel/mL Serapan 1 0,17 0,295

  2 0,48 0,435 3 0,91 0,549 4 2,00 1,175

  Gambar 1: Spektrum serapan hasil biotransformasi dengan pelarut n-heksana. dengan nilai R _f sebesar 0,38 mem- p unyai serap an maksimum p ad a panjang gelombang, λ = 246 nm.

  Pengaruh variasi konsentrasi in- hibito r terhadap hasil bio transfo r- masi

  Ko nsentrasi inhibito r d ico ba dengan 4 variasi konsentrasi yaitu 0.5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mM. Hasil biotrans- formasi yang diperoleh dapat diihat pada Tabel 3 Penambahan inhibitor p ad a jam ked ua setelah substrat dimasukkan dengan waktu inkubasi

  B A C

  1

  2

  3

  4

  5

  6

  7

  8

  9 Gambar 2 : Kromatogram hasil biotransformasi dengan fase gerak sikloheksan etilasetat air (60 : 40 : 0,1). Bercak dilihat pada UV dengan λ = 254 nm.

  

Keterangan: bercak 1-3 hasil biotransformasi, kondisi optimum, konsentrasi

α ,α’-dipiridil 1,0 mM 2 jam. Setelah substrat ditambahkan, t inkubasi 72 jam; bercak 4 = kontrol; bercak 5 = ADD 6µL; bercak 6 = ADD 8 µL; bercak 7 = ADD 10 µL: bercak 8 = ADD 12 µL; bercak 9 = ADD 14 µL. A = ADD hasil biotranformasi; B = senyawa yang diduga pregnenolon; C = ADD standar.

  72 jam menghasilkan ADD yang op- Untuk memp ero leh seny aw a timum dengan rendemen 1,85%. A DD d ipilih cara bio transfo rmasi

  M ycobacterium

  Kad ar A DD hasil bio transfo r- dengan menggunakan masi dengan kondisi optimum, yaitu phlei DSM 43286. Dasar pemilihan konsentrasi inhibitor enzim 1,5 mM cara biotransformasi adalah sulitnya α, α’-dipiridil, 2 jam setelah substrat memp ero leh A DD secara sintetis ditambahkan dan waktu inkubasi 72 karena substrat yang digunakan me- jam dapat dilihat pada Tabel 4. miliki atom C asimetrik 6 buah, se- hingga akan diperoleh isomer dengan PEMBAHASAN jumlah sangat besar dan pemisahan

  Penelitian ini meng g unakan isomer-isomer yang terbentuk juga ampas tahu sebagai sampel sumber relatif sulit. sterol. Penelitian terdahulu yang di- Sterol yang terdapat pada limbah lakukan oleh Archic masih mengan- tahu tid ak d ilakukan p emisahan, d ung stero l 0,1334+ 0,003% (b/ b) karena β-sitosterol, kampesterol, dan dihitung terhadap sampel kering. stigmastero l mempunyai struktur _,

  

Tabel 3. Data pengaruh variasi konsentrasi inhibitor α, α -dipiridil terhadap kadar

ADD. Analisis dilakukan dengan TLC Scanner NO KONSENTRASI AREA KADAR ADD _, α , α -dipiridil (mM) (µv/s) hasil biotransformasi

  (% b/b) 1. 0,5 0,473 0,72 2. 1,0 6,920 0,99 3. 1,5 27,479 1,85 4. 2,0 8,121 1,04

  

Tabel 4. Kadar ADD hasil biotransformasi dengan kondisi terbaik. Analisis dilakukan

dengan TLC Scanner

NO KONSENTRASI AREA WAKTU PENAMBAHAN INKUBASI KADAR

_, α , α -dipiridil (mM) (µv/s) SUBSTRAT (jam) (%b/b)

  (jam) 1. 1,5 27,474 2 72 1,85 2. 1,5 27,394 2 72 1,85 3. 1,5 26,994 2 72 1,83 4. 1,5 15,950 2 72 0,48 5. 1,5 14,960 2 72 0,48

Keterangan : No.1 sampai 3 —substrat terdiri dari 12,5 mg β-sitosterol + 12,5 mg stigmasterol. No.4, 5 —substrat sterol dari ampas tahu. yang hampir sama, hanya beda satu ikatan rangkap. Stigmasterol mempu- nyai ikatan rangkap pada posisi C ₂₂ , sed angkan β-sito stero l d an kam- pesterol tidak, dan oleh karena itu polaritas dan besar molekul hampir sama.

  Pro ses bio transfo rmasi stero l total pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi konsentrasi inhibitor enzim terhadap ADD yang dihasilkan.

  Untuk mencari ko nd isi y ang paling optimum dilakukan penelitian menggunakan sterol campur, yaitu β-sitosterol 12,5 mg dan stigmasterol 12,5 mg. Pada penelitian ini tidak digunakan kampesterol karena ke- sulitan untuk memperoleh kampes- terol standar.Bakteri yang digunakan untuk biotransformasi ditumbuhkan pada media pembenihan yang sesuai, yakni nutrien bro th-glisero l. Pada media ini M ycobacterium phlei dapat tumbuh cepat yaitu mencapai fase statis (+10 ⁹ sel/ mL) setelah 24 jam. Untuk menghitung konsentrasi bak- teri d iukur d engan menggunakan spektrofotometer uv-vis pada pan- jang gelombang, λ= 600 nm. Metode ini d apat d igunakan, karena d ari hasil p erco baan d iketahui bahw a kekeruhan suatu cairan kultur ber- banding lurus dengan jumlah mikro- ba dalam kultur. Serapan suspensi bakteri p ad a p anjang gelo mbang λ= 600 nm berkisar antara 0,870 sampai 1,050 yang ekuivalen dengan konsentrasi bakteri 1,4152.10 ⁹ sampai

  1,7849.10 ⁹ sel/ mL. Ko nsentrasi bakteri ini perlu diketahui sebelum menambahkan substrat, karena bakteri harus ditambahkan ke dalam substrat sebelum mencapai fase statis.

  Ko nsentrasi α, α’ -dipiridil de- ngan menggunakan 4 macam variasi konsentrasi yaitu 0,5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mM, waktu inkubasi dan waktu penambahan inhibitor enzim dibuat tetap, yaitu 72 jam untuk waktu in- kubasi dengan w aktu penambahan 2 jam setelah penambahan substrat. Dari percobaan ini diperoleh konsen- trasi

  α, αa’-dipiridil yang memberi- kan hasil ADD yang optimum, yaitu p ad a ko nsentrasi 1,5 mM d ap at menghasilkan A DD sebesar 1,85%. Setelah diperoleh hasil A DD yang o p timum d ico ba p ad a stero l d ari hasil iso lasi amp as tahu d eng an kondisi sebagai berikut, penambahan inhibito r enz im α, α’ -d ip irid il dengan konsentrasi 1,5 mM, 2 jam setelah penambahan substrat d an w aktu inkubasi 72 jam, d ipero leh rendemen 0,48%. Hasil biotransfor- masi yang diperoleh sangat kecil baik dari sterol murni maupun sterol dari ampas tahu. Ini disebabkan mungkin proses biotransformasinya terjadi di d alam bad an sel bakteri. Untuk biotransformasi yang terjadi di dalam sel harus diekstraksi dengan jalan merusak sel bakteri tersebut yaitu d eng an jalan meng g erus, p end i- nginan secara mendadak.

  KESIM PULA N

  Stero l to tal d ari amp as tahu dapat diubah menjadi ADD dengan cara biotransformasi menggunakan bakteri M y cobacterium phlei DSM 43286 dengan inhibitor enzim α, α’- dipiridil.Konsentrasi inhibitor yang menghasilkan A DD optimum dari percobaan yang telah dilakukan ada- lah pada konsentrasi α, α’-dipiridil 1,5 mM dengan rendemen 0,48% dari ampas tahu.

  DA FTA R PUSTA KA

  G. Reed , (Ed s) Biotechnology , Valvia, Verlag Chemie, Wein- heim, 5 – 29.

  Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan A lam, Depok, Skripsi Sarjana 2001. Torrey, S; (1984), Microbial Synthe- sis, Recent A dvanced, Noyes

  Fraksi Hasil Isolasi Skala Preparatif A mpas Tahu , UI, Jurusan

  Thesiani A rchi, A nalisis Sterol dari

  chim Biophys Acta, Dec 22; 531 (3); p308-21.

  Knight, Kominek, (1978); Bio-

  vol.22, A cademic Press, New York, 29 – 54. N o v cha, M .G., F.J. A nto sz , J.C.

  vances in A pplied M icrobiology ,

  Cleavage of Sterol Side Chains dalam; D. Perlman (Ed.) A d-

  Verlag Chemie, Weinheim, p 80 – 95. Martin, C.K.A ., (1977)., Micro bial

  Biotechnology, Biotransformations, v o l. 6a,

  Martin, C.K.A, (1984)., Sterol, dalam, Kieslich K (Ed.)

  DSM 43286” d alam Tesis M ag ister Ilm u Kefarmasian FM IPA -UI Makalah I hal 21 (inpress). Leuenberger, H. G. W, (1984)., Meth- odology dalam; Rehm, H.J., &

  A nonim, (2000); Statistik Indonesia tahun, Katalo g BPS, 1401; h 39,43. Arima, K, (1980). M icrobiological Pro-

  Biokonversi Total sterol Limbah Tahu menjadi 1,4-A ndrostadien- 3, 17-dion M enggunakan M yco- bacterium Phlei

  Kurniadi Maryati, (2003), “ O ptimasi

  , Ja- karta, p 13 – 15.

  technology of Steroid Compound as Contraceptives and Drugs

  Kim, H.K. (1986); Synthesis of Ste- ro id O ral Co ntracep tiv es Available in The United States of A merica, W orkshop on Bio-

  , Vol. 10, Churchill, Livingstone, Edin- burgh, p 72 – 77.

  Industrial M icrobiology

  CMD=Text&DB=PubMed, 8/ 2/ 2001, pk.11.51. Hockenhul, D.J.D., (1971), Progress in

  ed ., Science Tech, Mad iso n, p 258. Http:/ / WWW.ncbi.nlm.nih. gov:80/ e n t r e z / q u e r y . f e g i ?

  Biotechnology ; A Text Book of Industrial M icrobiology , English

  Prix Roussel; 27-35. Crueger, W. & A Crueger. (1984).,

  duction of Steroids Hormones from Cholesterol,

  Data CO., Park Ridge, New Jer- sey, USA., 81-85.