APLICASI ELEKTROFORESIS DALAM FARMASI

APLICASI
ELEKTROFORESIS DALAM
FARMASI
• Sediaan Farmasi yang diproduksi dipabrik

obat tidak saja obat yang bersifat
mikromolekul, tetapi juga yang bersifat
makromolekul.
• Senyawa makromolekul terutama yang
merupakan senyawa bioaktif, (senyawa bio
kimia) juga perlu diketahui cara analisisnya.
• Analisis paling umum dipakai adalah
elektroforesis. Walaupun perkembangan
teknologi senyawa tersebut dapat analisis
dengan KCKT.
1

Principles of Electrophoresis
 Faktor yang menyebabkan pemisahan
 Muatan molekul
 Bobot molekul

 Bentuk molekul
 Molekul dipengaruhi oleh medan listrik
 V = (EQ)/f
 V = molecule velocity
 E = Eletric feld strength
 Q = molecular charge
 F = friction coefcient of molecule
 Hasil pemisahan yang tinggi sangat
2

tergantung berbagai faktor seperti rumus
tersebut

I.Applications
Elektroforesis Gel
 Analysis of

carbohydrates
 Analysis of
inorganic

anions/metal
ions
 DNA profling
 Protein
identifcation

 Advantages
 Fast
 Small Sample
 Relatively

inexpensive
 Automated
 Disadvantages
 Cannot identify
neutral species
(Kecuali yang
osmosis)
 Joule Heating
 Cannot discern

shape

Migrasi sampel
45kD

4

10kD

25kD

Electrophoresis Dan
Buffer
 Beberapa jenis larutan yang dianjurkan

untuk electro phoresis DNA adalah;TAE
(Tris-acetate-EDTA) and TBE (Tris-borateEDTA). Fragmen DNA akan migrasi
dengan kecepatan yang berbeda dalam
kedua dapar tersebut dan sangat
tergantung kekuatan ion.

 Bufer tidak saja untuk mempertahankan
pH, tetapi memberikan ion yang
membantu sifat konduktivitas
 Bila digunakan kadar dapar 10 x lebih
kuat dari larutan stok, suhu dapat naik
pada proses elektroforesis gel dapat
memeleleh
5

Assessing DNA Quality
Time
minutes
3

2

seconds
1

45 30 15 0

Experiment:




100 ng K562 DNA
Digest with DNAse

~23Kbp
Molecular Weight Ladder
~ 2kbp

6

Pengaruh Konsentrasi
Agarose

7

8

Agarose
(%)

Range of separation of linear
DNA
(in kilobases)

0.3

60 - 5

0.6

20 - 1

0.7

10 - 0.8

0.9

7 - 0.5

1.2

6 - 0.4

1.5

4 - 0.2

2.0

3 - 0.1

Acrylamide Gel Electrophoresis
Effect of Gel Percentage and Size
Separation

9

II. Protein staining

10

 Silver stain

c.Commonly used protein stains
Stain

Detection limit

Ponceau S

1-2 g

Reversible

Amido Black

1-2 g

permanent; low
background

Coomassie Blue

1.5 g

permanent; high
background

India Ink

100 ng

permanent

Silver stain

10 ng

permanent

Colloidal gold3 ng
11

Comment

permanent

(2) DNA staining:

Ethidium bromide

 Ethidium bromide bergabung dengan

DNA double helix and

fluoresced bila disinari dengan UV

12

d.Pewarnaan sampel
dengan Ethidium
Bromide

13

Electrophoresis of Nucleotides
DNA mempunyai
mutan negatif ( karena
kerangka phosphate )
DNA akan tertarik
pada muatan positif
baik dari elektrode
maupun dapar,
sebaliknya akan
ditolak oleh muatan
negatif.
14

Ethidium Bromide
 Senyawa mempunyai gugus planar yang

dapat ber intercalates diantara base
DNA.
 Sifat tersebut menyebabkan kenaikan sifat
fouresensinya dibanding senyawa dalam
keadaan bebas (dalam larutan)
 Radiation U.V. pada 254 nm diabsorbed
oleh DNA dan ditransmisikan kepada zat
warna yang terikat, dan dapat
mengemisikan warna pada 590 nm
(orenye kemerahan)
15

Ethidium Bromide
 Ethidium bromide biasanya dibuat

16

dengan larutan 10 mg/ml. Disimpan dan
terlindung (kedap cahaya).
 Zat warna kurang berinteraksi atau
incorporated kedalam gel dan dapar
yang digunakan. Tetapi gel dapat
berwarna setelah dikocok dengan
ethidium bromide (0.5 ug/ml selama 30
min). dan dielusi dengan larutan.
 Warna akan tampak bila disinari dengan
UV dan dapat dipotret dengan flm
polaroid.
 Kepekaan DNA terhadap zat warna ini bila
kadar DNA minimal 0.1 ug of DNA.

Gel Staining

17

An ethidium-stained gel photographed
under UV light

18

**Each band that you see is a collection of millions of
DNA molecules, all of the same length!!

Movement of DNA fragments
in agarose gels (Mobilitas fragmen
DNA dalam agorose sel)
 Ada hubungan yang linier antara

kecepatan migration setiap fragmen
DNA dan logaritma dari ukuran molekul
(in basepairs).
 Molekul yang besar bergerak lambat
karena pengaruh friksi yang lebih besar
Bila digambarkan dengan kurva sebagai
berikut:
19

base pairs

x bp

Distance migrated

Types of Polyacrylamide gels
 Denaturing gels : Gel ini

mengalami polimeri sasi dengan
denaturant, terutama yang bersifat
dapat berpasangan dengan asam
nucleat seperti urea, atau formaid..
 Denatured DNA Yang telah
terdenaturasi akan migrasi melewati
gel poliakrilamid tak terjadi reaksi
(independen) atau dapat bergantian,
hasil migrasi sebagai berikut:
21

Methods for Fluorescently
Labeling DNA
• Intercalating

Dyes (post-PCR
=polimeric chain reaction))
• Dye-labeled nucleotide
insertion during PCR
• Dye-labeled primer insertion
during PCR
3’TGCATCTACGATGTAATCG5’
CGTAGCTG3’
Linkers, dyes, etc. can be added to
the 5’ end of the primer without
disturbing the reaction.
Individual bases can also be tagged
ENZYME Intercalation process
Covalent labeling process
22

Amine Reactive Dyes used in
LabelingDNA
FAM (Blue)

Emission 520

23

JOE (Green)

Emission 548

TAMRA (Yellow)

Emission 580

ROX (Red)

Emission 605

Dye Migration in Diferent %
Polyacrylamide Gels

24

%
Polyacrylamide
gel
5

Bromophenol
blue
35

Xylene cyanol
(41)
130

6

26

106

8

19

76

10

12

55

12

8

28

Sebelum terjadi pemisahan analit dikumpulkan
dulu , kemudian dengan membe rikan arus
listrik terjadilah perbedaan potensial, sehingga
terjadi pengelompokan iom positif dan negatif.
Dengan demikian pemberian potensial dapat
diatur agar pemisahan dapat mencapai optimal.
1.TEKNIK INJEKSI:
1). Hidrostatik, dengan tekanan cairan
Besarnya tekanan tergantung volume cairan
dirumuskan:
g htINJ
 =BOBOT JENIS V= volume
VINJ =——————
h= SELISIH TINGGI LAR.
8L
g = GAYA GARVITASI
 =VISKOSITAS, t= LAMANYA PENYUNTIKAN.
25



26

Contoh gambar
penyuntikan

 SUSUNAN ALAT

27

Isoelectric focusing
(IEF)

Perpindahan(pergerakan) cairan pada
pipa kapiler akan terus berlangsung
sepanjang larutan memiliki muatan atau
diberi muatan, apabila kondisi sudah
menjadi netral maka cairan akan berhenti
bergerak pada pH tti. (PI)

28

2.
Aplikasi
IEF (Isoelectric focusing)berguna untuk
menentukan pI dari protein, terutama dalam
memisahkan
immunoglobulin
,
variasi
hemoglobin
dan
menentukan
posisi
translational
modifkasi
dari
protein
rekombinan, separasi campuran protein dapat
dilihat pada gambar dibawah:

29

•DNA

Aplikasi

Pemisahan oligonucleotida dan sekuen
produk DNA melibatkan agar
polyacrylamide, gambar dibawah
menunjukkan hasil separasi

30

Sample Injection in CE
Hydrodynamic injection
uses a pressure difference between the two ends of the capillary
Vc =
Vc, calculated volume of injection
P, pressure difference
d, diameter of the column
t, injection time
, viscosity
Electrokinetic injection
uses a voltage difference between the two ends of the capillary
Qi = Vapp( kb/ka)tr2Ci
Q, moles of analyte
vapp, velocity
t, injection time
kb/ka ratio of conductivities (separation buffer and sample)
r , capillary radius
Ci molar concentration of analyte

Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) allows
amphoteric molecules, such as proteins, to be
separated by electrophoresis in a pH gradient
generated between the cathode and anode.
 A solute will migrate to a point where its net
charge is zero. At the solute’s isoelectric point
(pI), migration stops and the sample is focused
into a tight zone.
 In CIEF, once a solute has focused at its pI, the
zone is mobilized past the detector by either
pressure or chemical means. This technique is
commonly employed in protein characterization
as a mechanism to determine a protein's
isoelectric point.

IV.Capillary Isotachophoresis (CITP)
 Capillary Isotachophoresis (CITP) adalah
bedasar perbedaan sampel mana yang leading
(pendahulu) dan mana yang termiting (yang akir)
dari suatu elektrolit..
 Analit yang intermediata akan terletak diantara
pendahulu dan yang akir dari analit, dengan
bentuk tajam dan terfocus.(focused Zone) .
 Walaupun ini digunakan untuk model pemisahan
tetapi sebelumnnya merupakan pemusatan dari
sampel lebih dulu.

Analisis Metadon dan
isomernya
 Metadon (MTD), sebagai analgesi yang sintetik,

biasnaya digunakan untuk obat pengganti opiat yang
tidak adiktif. Obat ini mempunyai atom karbon asimitris
sehingga terdapat beberapa isomer seperti:
 R)-MTD., (S)-MTD, (S)-MTD [2,3]. Dan hasil
metabolisme menjadi 2- ethylidene-1,5-dimethyl-3,3diphenylpyrrolidine (EDDP), and to 2-ethyl-5-methyl3,3-diphenylpyrrolidine (EMDP).
 Untuk pemisahan yang optimum , dengan elektroforesis
kapiler (EK) digunakan fase diam highly sulphated
gammacyclodextrin (HS--CD) (Rudaz et al, 2003).
 Sebagai baku internal (standard internal), R)-(+)-1phenylethylamine ((R)-PEA, yang dalam EK, senyawa
ini kecepatan migrasinya tidak sama dengan sampel uji;
34

 Electropherogram of an oral fuid sample spiked with 10 ng/mL (R)-

PEA,used as internal standard (IS), obtained under optimized
conditions: fused-silica capillary 375 m o.d., m i.d., 40.2 cm total
length (efective length 32.8 cm);
 50mM phosphate bufer, pH 4.5, 0.2% HS--CD (w/v); applied voltage,
20 kV; temperature: 20 ◦C, UV detection at 200 nm.

35

36

Electropherogram of an oral fluid sample spiked with 50
ng/mL of (R,S)-MTD, (R,S)-EDDP and (R)-PEA (IS)
using the same optimized conditions as in

Analysis of Hair

Electrophoresis 1998, 19, 42-50

Separation of natural isotopes of 0.56 mM Cl- by capillary
electrophoresis with indirect spectrophotometric detection at 254
nm.
(from C.A.Lucy and T.L.Mcdold,Anal.Chem.1995,67,1074.)

Separation of alkaline, alkaline earths, and Lanthanides
Capillary: 36.5 cm 75 µm fused silica, 30 kV .
Detection: indirect UV, 214 nm.
(D.A.Skoog,F.J.Holler,T.A.Nieman,Principles Of Instrumental Analysis,Fifth
Edition,Sanders Coliege Publishing,1998,778)

S: system peak; 1: ammonium; 2: potassium; 3: calcium; 4: sodium; 5:
magnesium; 6: zinc
(Y. Fung, K. Lau, H. Tung, Talanta, 45, 1998, 619.)

Model Proteins separated

Model Proteins separated at pH= 2.7
Peak No.
Proteins
1
Cytochrome c
2
Lysozyme
3
4
5

Trypsin
Trypsinogen
Trypsin inhibitor

mol. Wt.
12,400
14,000

Isolelectric Point, PI
10.7
10.1

24,000

10.1

23,700
20,100

8.7
4.5

(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

R=CH2OH
R=NHCH3

Chemical structures of tetracycline(A) and
streptomycine(B).
(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

Conclusion
The capillary electrophoretic methods have been
recognized:
1.Lower equipment costs, smaller sample size
requirements, much greater speed, high resolution,
precision, accuracy
and sensitivity.
Compared
to conventional
HPLC methods,
2.The capillary electrophoresis methods have
better resolution, less consumption of buffer
solution and the absent organic solvents in the
analysis.
3. Many types or method can be apllied.
(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

Kemampuan senyawa berpartisipasi kedalam misel

sangat tergantung sifat hidofobiknya

a.) Micell Electroforesis
Senyawa yang dapat dianalisis dengan cara ini
antara lain:morfn, kanabinol, barbi turat.
Benzodiazepin, antibiotika dan vitamin
Waktu retensi dirumuskan:

k’ =PmwV[(S)-CMC)
k’= waktu retensi, Pmw= koefsien partisi,
S= kadar surfaktan, CMC = medium
47

b). OPEN TUBELAR CAPILARY

ELECTROPHORESIS
ATAU CAPILARY ZONE
ELECTROPHORESIS (CZE)
Gerakan analitnya berupa pita, terbuka
karena bagian tengah kapiler hanya ada
cairan netral, sedangkan didinding
bagian tepi terdapat fase medium
elektroforesis , hasilnya kurang bagus
karena penghantaran listrik kurang
sempurna.
48

 d). CIF Sebelum terjadi pemisahan analit

dikumpulkan dulu , kemudian dengan membe
rikan arus listrik terjadilah perbedaan potensial,
sehingga terjadi pengelompokan iom positif dan
negatif
49

Pemisahan senyawa dengan
gugus amin yang berbeda

50

 CONTOH



s+ < BGE back ground elec trophoresis (BGE)
s+ > t
`
`

 Gambar tahapan peristiwa dalam kapiler

sebelum ada arus dan setelah diberi arus listrik.

 Kecepatan migrasi sangat tergantung akan muatan,

dan bobot molekul.
 D). Elektroforesis dengan gel (capillary gel
electrophoresis), peristiwa yang terjadi sama
dengan citp.
51