PRAKTIKUM AKTIVITAS ENZIM DALAM BEBERAPA (1)
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
PRAKTIKUM AKTIVITAS ENZIM DALAM BEBERAPA SAYURAN DAN
BUAH-BAUHAN
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
HENDI KUSWENDI (240210160049)
Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor
Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022)
7798844, 779570 Fax. (022) 7795780 Email: hendikuswendi28@gmail.com
ABSTRACT
Humans need protein for growth, repair damaged body cells, plasma gland,
hormone, and enzyme ingredients, energy reserves in case of deficiency, and maintain the
balance of acid-base blood. Proteins are a source of amino acids that contain elements
C, H, O and N that are not owned by fat or carbohydrates. In this experiment biuret test
was used, ninhydrin test of coagulation properties of isoelectric point test protein and
salting out test in protein test in sample. The biuret test showed that positive albumin and
urea had peptide bonds. The ninhydrin test on albumin samples shows that positive
albumin contains free amino acids, whereas urea does not have free amino acids.
Precipitation of acids and alkalis occurs in proteins that are added strong acids and
strong bases. Proteins which are supplemented with heavy metal salts will precipitate
with the heavy metals present in the salt. Denaturation and coagulation of protein
(albumin) occurred in albumin given the addition of acetate buffer with pH 4, pH 4.5 and
pH 4.98. The isoelectric point is marked by decreased protein solubility and the
formation of precipitate. The isoelectric point of albumin occurs at pH 4.55-4.90. Salting
out occurs in protein (albumin) which is given the addition of neutral salt. It is
characterized by the formation of white protein precipitate which can give positive results
if done biuret test.
Keywords: albumin, protein, amino acids, biuret test, ninhydrin test
H, O dan N yang tidak dimiliki oleh
lemak maupun karbohidrat.
PENDAHULUAN
Manusia membutuhkan protein untuk
pertumbuhan, memperbaiki sel tubuh
yang rusak, bahan pembentuk plasma
kelenjar, hormon, dan enzim, cadangan
energi jika terjadi kekurangan, dan
menjaga keseimbangan asam basa darah
(Sandjaja, 2010). Protein merupakan
suatu zat makanan yang amat penting
bagi tubuh, karena zat gizi ini disamping
sebagai bahan bakar dalam tubuh juga
berfungsi sebagai zat pembangun dan
pengatur. (Winarno, 1992).
Protein merupakan sumber asam
amino yang mengandung unsur-unsur C,
Protein terbentuk melalui reaksi
polimerisasi dan kondensasi dari
monomer asam amino. Masing -masing
asam amino dihubungkan dengan suatu
ikatan peptida. Klasifikasi berdasarkan
strukturnya, protein dikenal memiliki 4
struktur utama yaitu struktur primer,
sekunder, tersier, dan struktur kuartener
(Lehninger, 1990). Asam amino
merupakan senyawa penyusun protein,
oleh karena itu penyediaan asam amino
menjadi sangat penting.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Mahluk
hidup
mempunyai
kemampuan yang tidak sama dalam
membentuk Asam amino. Asam amino
yang umum terdapat dalam alam akan
disintesis oleh sekelompok enzim yang
berbeda satu sama lain dan melalui jalur
yang berbeda pula (Martoharsono,
2006).
Selain berbentuk asam amino, protein
didalam tubuh juga dapat berupa zat
antibodi, enzim, dan hormon yang
berfungsi mengangkut zat gizi, oksigen
dan hasil metabolit ke seluruh tubuh
atau ke organ-organ tubuh tertentu.
Antibodi atau immunoglobin dapat
mengenali dan menghancurkan zat
asing. Enzim berperan terhadap proses
kimiawi dalam sel. Enzim mengontrol
kecepatan dan kelangsungan reaksi
dalam sel.
Hormon adalah pembawa pesan yang
disekresikan untuk respons keadaan
tubuh yang menyimpang. Di samping
itu, protein dalam keadaan tertentu
menjadi sumber energi, di mana tiap
gram protein menghasilkan energi 4
kalori (Sandjaja, 2010).
METODOLOGI
Bahan
Bahan yang digunakan antaralain:
akuades, urea albumin 2% CuSO4 1%
buffer asetat pH 5 ninhidrin H 2SO4 1 N,
KOH 0,5 N, NaOH 4 N, asam asetat
glasial, HCl pekat PbAc, CuSO 4,
FeCl3, HgCl2, dan ZnAc buffer asetat pH
4, pH 5 dan pH 6 kasein NaOH, NaCl,
MgSO4, Na2SO4
Alat
Alat yang digunakan antaralain: bulb
pipet, penjepit kayu, tabung reaksi,
penangas air, pipet volume, pipet tetes,
neraca analitik, ruang asam, botol
semprot, spons.
Metode
Uji Biuret
Terdapat 3 perlakuan pada uji biuret
kali ini, yaitu dengan penambahan 1 ml
albumin 2%, penambahan urea, dan
penambahan urea yang dipanaskan
terlebih
dahulu.
Masing-masing
perlakuan dimasukan dalam tabung
reaksi. Kemudian ditambahkan 1 ml
NaOH 10% dan diaduk sampai
homogen. Ditambahkan pula CuSO4 1%
hingga warna menjadi merah ungu.
Maksimal penambahan CuSO4 1% yaitu
10 tetes, kemudian diamati perubahan
yang terjadi.
Uji Ninhidrin
Terdapat 2 perlakuan pada uji biuret
kali ini, yaitu dengan penambahan
albumin 1% dan urea yang dipanaskan.
Masing-masing perlakuan dimasukan
dalam
tabung
reaksi,
kemudian
ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 5,
dan 20 tetes ninhidrin, kemudian
dipanaskan dan diamati perubahan
warna yang terjadi.
Uji Sifat Koagulasi Protein
Pembentukan endapan dengan asam
dan alkali
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan tetes
demi tetes koagulan (H2SO4 1 N, KOH
0,5 N, NaOH 4 N, asam asetat glasial,
dan
HCl
pekat)
dan
diamati
perubahannya. Selanjutnya, sampel
diamkan selama 90 menit dan diamati,
kemudian dikocok dan dipanaskan, dan
kembali diamati perubahan yang terjadi.
Pembentukan endapan dengan garam
dan logam berat
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan tetes
demi tetes larutan logam (PbAc, CuSO4,
FeCl3, HgCl2, dan ZnAc) kemudian
diamati perubahan yang terjadi.
Denaturasi dan Koagulasi
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin
dan
gelatin,
kemudian
ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 4, pH
5 dan pH 6. Selanjutnya dikocok dan
diamati pada menit ke 0, 5 dan 15.
Dipanaskan selama 2 menit dan diamati
kembali.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Uji Titik Isoelektrik
Ditambahkan larutan asam seperti
pada tabel diktat praktikum kimia
pangan halaman 32, ditambahkan
akuades seperti pada tabel dihalaman 32,
dan terakhir di tambahkan 1 M larutan
kasein dalam Na-asetat, kemudian
dikocok dan diamati selama 10 – 20
menit.
Uji Salting Out
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin, dipanaskan pada
suhu 40 ℃ , kemudian ditambahkan
amonium sulfat sampai titik jenuh,
diaduk dan disaring sampai menjadi
filtrat. Kemudian ditambahkan padatan
(NaOH, NaCl, MgSO4, Na2SO4) dan
ditambahkan pereaksi buret kemudian
diamati perubahan yang terjadi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Praktikum kali ini membahas uji
kualitataif
terhadap
protein.
Uji
kualitatif protein yang dilakukan da
yaitu uji biuret, uji ninhidrin, pengujian
mengenai pembentukan asam dan alkali,
pembentukan garam dan logam berat,
denaturasi dan koagulasi protein, titik
isoelektrik protein, serta salting out.
Jenis protein yang digunakan untuk
pengujian diantaranya yaitu albumin
2%, urea, kasein, dan gelatin.
Uji Biuret
Tabel 1. Data Hasil Pengamatan Uji
Biuret
Perubaha +/
Kel
Sampel
n Warna
1,
2,
urea tidak
ungu muda
+
dipanaska bening
n
6
Albumin
Adanya
+
warna ungu
bening di
atas larutan
5, 9, Urea
Ungu muda +
10
dipanaska bening
n
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2017
Biuret adalah senyawa dengan dua
ikatan peptida yang terbentuk pada
pemanasan dua molekul urea. Suatu
enzim akan dapat menyatukan kedua
asam amino melalui reaksi dehidrasi
ketika dua asam amino berdekatan
dengan gugus amino dari asam amino
lain. Uji biuret merupakan suatu
pengujian untuk mengetahui adanya
ikatan peptida dari suatu sampel.
Adanya ikatan peptida mengindikasikan
adanya protein. Suatu polimer asam
amino tersusu atas ikatan-ikatan peptida.
Peptida adalah jenis ikatan kovalen yang
menghubungkan suatu gugus karboksil
satu asam amino dengan gugus amino
asam amino lainnya sehingga terbentuk
ikatan yang terbentuk ketika atom
karbon dari gugus karboksil suatu
molekul berikatan dengan atom nitrogen
dari gugus amina molekul lain. (Toha,
2001). ditambahkan dan diaduk sampai
homogen.
Uji
biuret
dilakukan
dengan
menambahkan 1 ml NaOH 10% dan ke
dalam sampel yaitu albumin dan urea,
lalu ditambahkan CuSO4 1%. Terdapat 3
perlakuan pada uji biuret kali ini, yaitu
dengan penambahan 1 ml albumin 2%,
penambahan urea, dan penambahan urea
yang dipanaskan terlebih dahulu.
Penambahan larutan NaOH pada larutan
protein tersebut yaitu sebagai katalis
yang berfungsi untuk menghancurkan
atau memecahkan molekul-molekul
protein.
Berdasarkan hasil uji biuret, pada
tiap sampel mengalami perubahan
warna. Sampel yang positif mengandung
ikatan
peptida
akan
mengalami
perubahan warna menjadi warna ungu.
Pada uji biuret ini ion Cu2+ akan
membentuk ikatan kompleks berwarna
ungu dengan peptida pada kondisi alkali
(Maligan, 2014).
Prinsip dari reaksi biuret adalah
Protein + Cu2+
Komplex Cu-
NaOH
Berdasarkan hasil uji biuret terhadap
sampel albumin dan urea, diperoleh
hasil bahwa kedua sampel positif
mengandung protein. Sampel urea dan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
albumin mengalami perubahan warna
menjadi warna ungu dan tampak bening.
Hal ini karena reaksi biuret bersifat
positif terhadap dua buah ikatan peptida
atau lebih seperti yang terdapat pada
albumin yang merupakan salah satu
protein globuler atau protein yang
berbentuk bulat (Winarno, 1997). Akan
tetapi, intensitas warna ungu pada
sampel urea tidak sebanyak pada sampel
albumin. Hal ini menunjukkan bahwa
ikatan peptida pada albumin lebih
banyak dibandingkan dengan ikatan
peptida pada urea. Urea bukan
merupakan protein, namun karena urea
mengandung gugus –NH2 (amin) yang
mempunyai kesamaan dengan gugus
protein sehingga membentuk warna
ungu sebagai hasil reaksi antara Cu 2+
dengan –NH. Oleh karena itu urea
memberikan hasil positif pada uji biuret.
Ninhidrin atau triketohidrien hidrat
adalah suatu senyawa oksidator kuat
yang bereaksi dengan asam amino pada
pH 4-8 dan dihasilkan senyawa
berwarna ungu. Ninhidrin biasa
digunakan untuk pengujian protein.
Ninhidrin dapat digunakan untuk
penentuan kadar asam amino baik secara
kualitatif maupun kuantitatif (Maligan,
2014). Uji ninhidrin dilakukan dengan
menyiapkan sampel dalam tabung reaksi
kemudian sampel tersebut ditambahkan
dengan larutan buffer asetat pH 5 yang
fungsinya adalah untuk menjaga reaksi
dalam suasana asam. Terdapat 2
perlakuan pada uji biuret kali ini, yaitu
dengan penambahan albumin 1% dan
urea yang dipanaskan. Masing-masing
perlakuan dimasukan dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml
buffer asetat pH 5, dan 20 tetes
ninhidrin, kemudian dipanaskan dan
diamati perubahan warna yang terjadi.
Reaksi ninhidrin sering digunakan
untuk menghitung asam amino bebas.
Suatu asam amino jika direaksikan
dengan ninhidrin dalam jumlah berlebih,
maka untuk setiap mol asam amino yang
bereaksi dengan
ninhidrin, akan
terbentuk 1 mol ammonia, 1 mol
aldehid, 1 mol CO2, dan 1 mol
hidrindantin. Amonia yg dibebaskan
akan bereaksi dengan 1 mol ninhidrin
dan 1 mol hidrindantin menghasilkan
produk berwarna ungu (absorbansi
maksimum pada 570 nm). Prolin dan
hidroksiprolin: produk berwarna kuning
(aborbansi maksimum padaa 440 nm)
(Fennema, 1996).
Gambar 1. Reaksi pada Uji Ninhidrin
(Fennema, 1996)
Berdasarkan hasil dari uji ninhidrin
pada sampel albumin dan urea,
diperoleh hasil bahwa pada sampel
albumin terjadi perubahan warna
menjadi ungu muda, sedangkan pada
sampel urea warnanya bening dan hanya
sedikit berwarna ungu muda. Semakin
pekat warna hasil reaksi, semakin tinggi
kandungan asam amino dalam sampel.
Oleh karena itu, dari hasil uji ninhidrin
yang dilakukan dapat disimpulkan
bahwa albumin menunjukkan hasil
positif mengandug asam amino bebas
sedangkan urea menunjukkan hasil
negatif (tidak mengandung asam amino
bebas).
Tabel 2. Pembentukan Endapan Asam
dan Alkali
Setela
Setelah
Ke Samp
h 90
Dipanask
l
el
menit
an
HCl +
Tetap
Tetap
6B
gelatin bening
bening
Terdap
NaOH
at
7B
+
Keruh
endapa
gelatin
n
Asam
asetat
Tetap
Tetap
8B
+
bening
bening
albumi
n
Keruh,
HCl + terdapa
Keruh,
9B albumi
t
terdapat
n
endapa
endapan
n
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
NaOH
10
+
Tetap
Tetap
B albumi bening
bening
n
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2014
Pengujian sifat koagulasi protein
yaitu pembentukan endapan asam dan
alkali, sampel berupa albumin dan
gelatin ditambahkan asam dan basa
yaitu H2SO4 1 N, KOH 0,5 N, NaOH 4
N, asam asetat glasial, dan HCl pekat.
Setelah itu, sampel yang telah
ditambahkan asam dan basa tersebut
didiamkan selama 90 menit lalu dikocok
dan dipanaskan. Masing-masing sampel
diamati perubahan yang terjadi setelah
didiamkan selama 90 menit dan setelah
dilakukan pemanasan.
Berdasarkan hasil pengujian terhadap
sampel gelatin dan albumin, dapat
diketahui
bahwa
pada
beberapa
perlakuan penambahan asam dan basa
terjadi kekeruhan dan endapan setelah
didiamkan selama 90 menit dan setelah
dipanaskan. Sampel yang terdapat
eendapan putih yaitu albumin + KOH,
Albumin + NaOH 4 N, Albumin 1 ml
+ HCl pekat, sedangkan pada
penambahan CH3COOH atau asam
asetat tidak terjadi perubahan pada
sampel. Hal ini dikarenakan CH3COOH
atau asam asetat merupakan asam
lemah. Menurut Lehninger (1990), jika
protein dipanaskan dengan asam atau
basa
kuat,
asam
amino
unit
pembangunnya dibebaskan dari ikatan
kovalen yang menghubungkan molekulmolekul ini menjadi rantai. Oleh karena
itu, dapat dikatakan bahwa penambahan
asam kuat dan basa kuat menyebabkan
terjadinya hidrolisis protein menjadi
asam amino.
Gambar 1. Hidrolisis Protein menjadi
Asam Amino
(Toha, 2001)
Sifat
koagulasi
protein
selanjutnya yang diuji yaitu mengenai
pembentukan endapan garam dan logam
berat. Pada pengujian ini, sampel yang
digunakan adalah gelatin dan albumin
1% sebanyak 1 ml. Masing-masing
sampel ini ditambahkan dengan garam
yang
mengandung
logam
berat
diantaranya yaitu PbAc, CuSO4, FeCl3,
HgCl2, dan ZnAc. Garam-garam tersebut
ditambahkan sedikit demi sedikit sampai
terjadi perubahan pada sampel.
Berdasarkan hasil pengujian yang
dilakukan, diperoleh hasil bahwa
penambahan garam dan logam berat
menimbulkan beberapa perubahan pada
beberapa sampel dan perlakuan.
Perubahan tersebut diantaranya berupa
timbulnya endapan dan gelembung pada
bagian atas sampel.
Berdasarkan data hasil pengamatan
menunjukan sampel Albumin + PbAc,
albumin + CuSO4, Albumin + ZnAc ,
dan Gelatin 1ml+ PbAc yang
menimbulkan endapan, sisa sampel
tidak menunjukan adanya endapan yang
terbentuk.
Endapan yang terbentuk pada sampel
gelatin, akibat penambahan garam
FeCl3, sedangkan pada sampel albumin
endapan terbentuk akibat penambahan
garam logam. Albumin merupakan
protein dengan berat molekul kecil yang
biasa terdapat dalam telur, serum dan
susu. Oleh karena itu, albumin dapat
mengendapkan garam dan logam berat,
sedangkan gelatin yang merupakan
protein dari jaringan kolagen tidak dapat
mengendapkan garam dan logam berat
karena kadar proteinnya yang rendah.
Penambahan larutan protein dengan
garam logam berat, anion-anion dari
garam logam berat akan menyebabkan
suasana larutan menjadi sedikit asam,
sehingga protein akan mengkondisikan
diri sebagai basa dan sebagian terdapat
sebagai anion. Anion dari protein inilah
yang bereaksi dengan ion logam berat
membentuk garam proteinat yang tidak
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
larut dalam air. Adanya endapan
disebabkan karena adanya kemampuan
protein atau asam amino untuk berikatan
dengan ion logam di atas titik
isoelektriknya.
Kemampuan
ini
disebabkan karena pada saat pH berada
di atas titik isoelektrik protein atau asam
amino, maka ia akan bermuatan negatif
sehingga mampu mengikat ion logam
yang bermuatan positif.
Selain menyebabkan terbentuknya
endapan, adanya pertambahan ion logam
menyebabkan
putusnya
jembatan
disulfida dan ikatan kovalen S-S pada
protein yang mengandung gugus
sulfuhidril. Sedangkan untuk asam
amino seperti asam aspartat, glisin, dan
alanin tidak membentuk endapan karena
suasana larutan masih berada di bawah
titik isoelektrik kedua asam amino
tersebut, sehingga asam amino yang
bermuatan
positif
tidak
mampu
berikatan dengan ion logam yang
bermuatan positif pula. Selain itu, ketiga
jenis asam amino tersebut tidak
mengandung
gugus
sulfuhidril
(Fennema, 1996).
Pengendapan garam logam berat oleh
protein
banyak
digunakan
atau
diaplikasikan dalam berbagai aspek.
Salah satunya yaitu dalam pengendapan
dan pengeluaran logam beracun dalam
tubuh. Menurut Winarno (1991), garamgaram logam berat dan asam-asam
mineral kuat ternyata baik digunakan
untuk mengendapkan protein. Prinsip ini
dipakai untuk mengobati orang yang
keracunan logam berat dengan memberi
minum susu atau makan telur mentah
kepada pasien.
Denaturasi dan Koagulasi
Denaturasi adalah proses yang
mengubah struktur molekul tanpa
memutus salah satu dari ikatan peptida
dari protein. Proses ini khas pada setiap
protein dan mempengaruhi protein yang
berbeda untuk derajat yang berbeda,
tergantung pada struktur protein.
Denaturasi dapat disebabkan oleh
beberapa faktor, seperti panas, pH,
garam,
dan
efek
permukaan
(DeMan,1999).
Denaturasi protein dapat diartikan
suatu perubahan atau modifikasi
terhadap struktur sekunder, tertier dan
kuartener molekul protein tanpa
terjadinya pemecahan ikatan-ikatan
kovalen. Karena itu, denaturasi dapat
diartikan suatu proses terpecahnya
ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik,
ikatan garam dan terbukanya lipatan
molekul protein. Proses denaturasi
biasanya disertai dengan terjadinya
koagulasi atau penggumpalan pada
protein. (Winarno 1992),
Pengujian terhadap denaturasi dan
koagulasi protein kali ini, jenis protein
yang digunakan yaitu albumin dan
gelatin.
Sampel diberi beberapa
perlakuan yaitu ditambahkan 1 ml buffer
asetat pH 4, pH 5 dan pH 6. Selanjutnya
dikocok dan diamati pada menit ke 0, 5
dan 15.
Selanjutnya, masing-masing sampel
dipanaskan hingga beberapa saat untuk
mengetahui apakah perlakuan panas
dapat memengaruhi denaturasi dan
koagulasi protein.
Berdasarkan hasil pengujian terhadap
sampel albumin dan gelatin yang diberi
buffer asetat dengan berbagai pH,
diperoleh hasil yang berbeda pada setiap
perlakuan.
Berdasarkan
data
pengamatan, terdapat sesuatu yang unik
pada sampel Albumin+Buffer asetat Ph
4,5, sampel tersebut sejak pertama
dicampurkan atau pada menit ke-0
sampel tersebut langsung menunjukan
adanya gumpalan putih dipermukaan,
pada menit ke-5 larutan menjadi bening
pada bagian bawah, dan pada menit ke15 larutan tampak putih keruh ada
endapan putih, sedangkan Setelah
dipanaskan larutan menjadi Bening ada
endapan putih. Selain itu, albumin +
Buffer + asetat pH 5,98 pada menit ke15 larutan tidak berwarna, namun
banyak gelembung udara, dan setelah
dipanaskan larutan berwarna putih susu
berbentuk busa dan menggumpal.
Sedangkan Gelatin+ buffer asetat pH 45,2 tidak terdapat endapan dan warna
larutan tidak mengalami perubahan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Adanya pembentukan endapan dan
gumpalan pada protein mengindikasikan
terjadinya denaturasi dan koagulasi.
Pada nilai pH di bawah dan di atas pH
isoelektrik, protein membawa muatan
positif atau muatan negatif. Tolakan
elektrostatik
dan
hidrasi
residu
memengaruhi
kelarutan
protein.
Mayoritas protein memiliki kelarutan
minimum pada pH 4-5 (pH isoelektrik)
dan kelarutan maksimum pada pH basa
(DeMan, 1999). Hal ini sesuai dengan
hasil pengujian dimana pada pH 4 dan
5,98 terbentuk banyak endapan dan
gumpalan
yang
mengindikasikan
kelarutan protein yang minimum,
sedangkan pada pH 5,0 ke atas protein
(kasein) memiliki kelarutan yang tinggi
(tidak
membentuk
endapan
dan
gumpalan).
Denaturasi dan koagulasi protein
dapat menimbulkan beberapa efek pada
protein tersebut. Efek dari denaturasi
dan koagulasi protein salah satunya
adalah terjadinya perubahan pada
struktur sekunder dan tersier. Selain itu,
menurut DeMan (1999), denaturasi dan
koagulasi protein adalah aspek stabilitas
panas yang dapat berhubungan dengan
komposisi asam amino dan urutan
protein.
Uji Titik Isoelektrik
Titik isoelektrik suatu asam amino
adalah suatu besaran fisis. Pada titik
isoelektrik, terdapat kesetimbangan
antara bentuk-bentuk asam amino
sebagai ion amfoter, anion, dan kation.
Pada setiap pH di atas titik isoelektrik,
asam amino mempunyai muatan negatif.
Sedangkan pada pH di bawah titik
isoelektrik, asam amino mempunyai
muatan
positif.
(Fessenden
&
Fessenden, 1986)
Titik isoelektrik adalah pH dimana
protein tidak mempunyai selisih muatan
dan karena itu tidak bergerak dalam
medan listrik (Sudarmadji, 1996).
Protein merupakan polimer dari asam
amino. Asam amino mengandung
sebuah gugus karboksil (asam) dan
sebuah gugus amino (basa), sehingga
asam amino bersifat asam dan basa atau
disebut ampholytes (Fennema, 1996).
Tiap jenis protein mempunyai titik
isoelektrik yang berlainan. Pengendapan
paling cepat terjadi pada titik isoelekrik
ini, dan prinsip ini digunakan dalam
proses-proses
pemisahan
serta
pemurnian protein (Winarno, 1991).
Tabel 6. Hasil Pengamatan Uji Titik
Isoelektrik
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2017
Pengujian titik isoelektrik protein
kali ini, sampel yang digunakan adalah
kasein. Sampel tersebut diberi beberapa
perlakuan seperti penambahan asam
asetat dan aquades seperti yang terlihat
pada tabel berikut:
Gambar 2. Prosedur Uji Titik Isoelektrik
(Sumber: Diktat
Pangan (hlm 32)
Praktikum
Kimia
Setelah diberi berbagai perlakuan,
sampel diamati selama 10-20 menit dan
dilihat perubahan yang terjadi.
Berdasarkan hasil pengujian pada
sampel, diperoleh hasil bahwa pada
hampir
semua
perlakuan
tidak
menunjukan adanya endapan setelah
sampel didiamkan selama 10 menit. Hal
ini menunjukkan bahwa masing-masing
sampel belum mencapai titik isoelektrik.
Endapan hanya terdapat pada data
kelompok 2 dan 5, dimana asam asetat
yang
ditambahkan
masing-masing
kelompok yaitu 0,01 N dan 0,1 N. Titik
isoelektrik ini tercapai karena adanya
penambahan asam asetat. Berdasarkan
hasil pengujian dapat disimpulkan
bahwa banyaknya asam asetat tidak
memengaruhi perbedaan pada titik
isoelektrik. Hal ini dipengaruhi oleh
banyaknya aquades yang ditambahkan.
Semua perlakuan diatas menunjukkan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
perbandingan yang relatif tetap antara
asam asetat dan aquades yang
ditambahkan, sehingga konsentrasi dan
pH dari asam asetat relatif sama.
Asam asetat merupakan asam lemah
yang memiliki pH yang tidak terlalu
kecil atau sekitar 4-5. Menurut Pirie
(1987), sebagian besar protein hasil
ekstraksi berdasarkan studi yang
dilakukan mengendap pada pH antara 4
dan 5. Selain itu, menurut Fennema
(1996), titik isoelektrik albumin adalah :
4,55-4,90. Oleh karena itu, penambahan
asam asetat pada albumin.menyebabkan
albumin mencapai titik isoelektriknya.
Pada kondisi ini protein memiliki
kelarutan minimum, sehingga protein
dapat dipisahkan dari bagian bahan
lainnya yang tidak diinginkan (Page,
1981).
Salting Out
Salting out adalah prinsip seberapa
besarnya daya kelarutan protein setelah
diberi garam. Pada pengujian salting
out, sampel yang digunakan adalah
albumin dan gelatin. albumin dan
gelatin, dipanaskan pada suhu 40
℃ ,
kemudian
ditambahkan
amonium sulfat sampai titik jenuh,
diaduk dan disaring sampai menjadi
filtrat. Kemudian ditambahkan padatan
(NaOH, NaCl, MgSO4, Na2SO4) dan
ditambahkan pereaksi buret kemudian
diamati
perubahan yang terjadi.
Berdasarkan hasil pengujian salting out,
tidak ditemukan adanya endapan pada
semua sampel. Bila dalam suatu larutan
protein ditambahkan garam, daya larut
protein akan berkurang, akibatnya
protein akan terpisah sebagai endapan.
Peristiwa pemisahan protein ini disebut
salting out. Bila garam netral yang
ditambahkan berkonsentrasi tinggi,
maka
protein
akan
mengendap
(Winarno, 1991). Pada percobaan ini,
ketika ke dalam larutan protein
ditambahkan garam, larutan protein
tidak mengendap. Dikarenakan protein
tidak larut dalam larutan garam
pekat. Protein jika terlarut dalam
garam akan menimbulkan endapan
berwarna putih. Mengendapnya
protein disebabkan karena adanya
kompetisi antara ion-ion garam dengan
molekul protein untuk mengikat air.
Karena ion-ion dari garam lebih mudah
dalam mengikat air, menyebabkan
kelarutan protein dalam air berkurang.
Dengan penambahan garam secara
kontinyu, molekul air akan keluar dari
larutan dan mengendap.
Setelah dilakukan pengujian biuret
terhadap endapan putih semua sampel,
diperoleh hasil bahwa endapan yang
dilarutkan berubah warna menjadi ungu,
kecuali pada sampel yang diberi garam
MgCl2. Timbulnya warna ungu pada
sampel mengindikasikan adanya protein
yang mengendap akibat penambahan
garam. Adapun pada sampel yang diberi
garam MgCl2 seharusnya menunjukkan
hasil positif pada biuret. Akan tetapi,
dari hasil percobaan sampel ini tidak
berubah warna atau menunjukkan hasil
negatif. Hal ini disebabkan oleh adanya
beberapa kesalahan yang terjadi ketika
pengujian. Kesalahan ini terjadi karena
adanya
ketidaktelitian
dalam
pengambilan endapan sampel ataupun
faktor-faktor lainnya.
KESIMPULAN
Uji biuret pada sampel albumin dan
urea menyebabkan perubahan warna
larutan sampel menjadi berwarna ungu.
Hal ini menunjukkan bahwa albumin
dan urea positif memiliki ikatan peptida.
Uji ninhidrin pada sampel albumin
menyebabkan perubahan warna larutan
sampel menjadi berwarna ungu. Hal ini
menunjukkan bahwa albumin positif
mengandung asam amino bebas,
sedangkan urea tidak memiliki asam
amino bebas. Pengendapan asam dan
alkali terjadi pada protein yang
ditambahkan asam kuat dan basa kuat.
Endapan asam dan alkali terbentuk pada
alumin yang diberi penambahan HCl
dan gelatin yang diberi penambahan
NaOH. Protein yang diberi penambahan
garam logam berat akan mengendap
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
bersama logam berat yang terdapat pada
garam
tersebut.
Denaturasi
dan
koagulasi protein (albumin) terjadi pada
albumin yang diberi penambahan buffer
asetat dengan pH 4, pH. 4,5 dan 4,98.
Titik isoelektrik ditandai dengan
menurunnya kelarutan protein dan
terbentuknya endapan. Titik isoelektrik
albumin terjadi pada pH 4,55-4,90.
Salting out terjadi pada protein
(albumin) yang diberi penambahan
garam netral. Hal ini ditandai dengan
terbentuknya
endapan
protein
berwarna
putih
yang
dapat
memberikan hasil positif jika
dilakukan uji biuret.
DAFTAR PUSTAKA
Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry
3rd Edition. Marcel Dekker Inc,
New York. Inc, Maryland
Maligan, J. M. 2014. Uji Kualitatif
Karbohidrat
dan
Protein.
Available
at:
http://maharajay.lecture.ub.ac.id/fi
les/2014/02/Uji-Kualitatif-KHProtein.pdf
Lehninger, A.L. 1990. Dasar-Dasar
Biokimia Jilid 1. Terjemahan
Maggy Thenawidjaja. Penerbit
Lehninger, A.L. 1990. Dasar-Dasar
Biokimia Jilid 1. Terjemahan
Maggy Thenawidjaja. Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Page, D. 1981. Prinsip-Prinsip Biokimia.
Terjemahan R. Soendoro. Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Pirie, N.W. 1987. Leaf Protein and Its
By-products in Human and
Animal 2nd Edition. Combridge
University Press, Melborne.
Sudarmadji, S. 1996. Teknik Analisa
Biokimiawi. Liberty, Yogyakarta.
Toha,
A.
H.
2001.
Biokimia:
Metabolisme
Biomolekul.
Alfabeta, Bandung.
Winarno, F. G. 1991. Kimia Pangan dan
Gizi. PT. Gramedia Pustaka
Utama: Jakarta.
.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
PRAKTIKUM AKTIVITAS ENZIM DALAM BEBERAPA SAYURAN DAN
BUAH-BAUHAN
FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
HENDI KUSWENDI (240210160049)
Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor
Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022)
7798844, 779570 Fax. (022) 7795780 Email: hendikuswendi28@gmail.com
ABSTRACT
Humans need protein for growth, repair damaged body cells, plasma gland,
hormone, and enzyme ingredients, energy reserves in case of deficiency, and maintain the
balance of acid-base blood. Proteins are a source of amino acids that contain elements
C, H, O and N that are not owned by fat or carbohydrates. In this experiment biuret test
was used, ninhydrin test of coagulation properties of isoelectric point test protein and
salting out test in protein test in sample. The biuret test showed that positive albumin and
urea had peptide bonds. The ninhydrin test on albumin samples shows that positive
albumin contains free amino acids, whereas urea does not have free amino acids.
Precipitation of acids and alkalis occurs in proteins that are added strong acids and
strong bases. Proteins which are supplemented with heavy metal salts will precipitate
with the heavy metals present in the salt. Denaturation and coagulation of protein
(albumin) occurred in albumin given the addition of acetate buffer with pH 4, pH 4.5 and
pH 4.98. The isoelectric point is marked by decreased protein solubility and the
formation of precipitate. The isoelectric point of albumin occurs at pH 4.55-4.90. Salting
out occurs in protein (albumin) which is given the addition of neutral salt. It is
characterized by the formation of white protein precipitate which can give positive results
if done biuret test.
Keywords: albumin, protein, amino acids, biuret test, ninhydrin test
H, O dan N yang tidak dimiliki oleh
lemak maupun karbohidrat.
PENDAHULUAN
Manusia membutuhkan protein untuk
pertumbuhan, memperbaiki sel tubuh
yang rusak, bahan pembentuk plasma
kelenjar, hormon, dan enzim, cadangan
energi jika terjadi kekurangan, dan
menjaga keseimbangan asam basa darah
(Sandjaja, 2010). Protein merupakan
suatu zat makanan yang amat penting
bagi tubuh, karena zat gizi ini disamping
sebagai bahan bakar dalam tubuh juga
berfungsi sebagai zat pembangun dan
pengatur. (Winarno, 1992).
Protein merupakan sumber asam
amino yang mengandung unsur-unsur C,
Protein terbentuk melalui reaksi
polimerisasi dan kondensasi dari
monomer asam amino. Masing -masing
asam amino dihubungkan dengan suatu
ikatan peptida. Klasifikasi berdasarkan
strukturnya, protein dikenal memiliki 4
struktur utama yaitu struktur primer,
sekunder, tersier, dan struktur kuartener
(Lehninger, 1990). Asam amino
merupakan senyawa penyusun protein,
oleh karena itu penyediaan asam amino
menjadi sangat penting.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Mahluk
hidup
mempunyai
kemampuan yang tidak sama dalam
membentuk Asam amino. Asam amino
yang umum terdapat dalam alam akan
disintesis oleh sekelompok enzim yang
berbeda satu sama lain dan melalui jalur
yang berbeda pula (Martoharsono,
2006).
Selain berbentuk asam amino, protein
didalam tubuh juga dapat berupa zat
antibodi, enzim, dan hormon yang
berfungsi mengangkut zat gizi, oksigen
dan hasil metabolit ke seluruh tubuh
atau ke organ-organ tubuh tertentu.
Antibodi atau immunoglobin dapat
mengenali dan menghancurkan zat
asing. Enzim berperan terhadap proses
kimiawi dalam sel. Enzim mengontrol
kecepatan dan kelangsungan reaksi
dalam sel.
Hormon adalah pembawa pesan yang
disekresikan untuk respons keadaan
tubuh yang menyimpang. Di samping
itu, protein dalam keadaan tertentu
menjadi sumber energi, di mana tiap
gram protein menghasilkan energi 4
kalori (Sandjaja, 2010).
METODOLOGI
Bahan
Bahan yang digunakan antaralain:
akuades, urea albumin 2% CuSO4 1%
buffer asetat pH 5 ninhidrin H 2SO4 1 N,
KOH 0,5 N, NaOH 4 N, asam asetat
glasial, HCl pekat PbAc, CuSO 4,
FeCl3, HgCl2, dan ZnAc buffer asetat pH
4, pH 5 dan pH 6 kasein NaOH, NaCl,
MgSO4, Na2SO4
Alat
Alat yang digunakan antaralain: bulb
pipet, penjepit kayu, tabung reaksi,
penangas air, pipet volume, pipet tetes,
neraca analitik, ruang asam, botol
semprot, spons.
Metode
Uji Biuret
Terdapat 3 perlakuan pada uji biuret
kali ini, yaitu dengan penambahan 1 ml
albumin 2%, penambahan urea, dan
penambahan urea yang dipanaskan
terlebih
dahulu.
Masing-masing
perlakuan dimasukan dalam tabung
reaksi. Kemudian ditambahkan 1 ml
NaOH 10% dan diaduk sampai
homogen. Ditambahkan pula CuSO4 1%
hingga warna menjadi merah ungu.
Maksimal penambahan CuSO4 1% yaitu
10 tetes, kemudian diamati perubahan
yang terjadi.
Uji Ninhidrin
Terdapat 2 perlakuan pada uji biuret
kali ini, yaitu dengan penambahan
albumin 1% dan urea yang dipanaskan.
Masing-masing perlakuan dimasukan
dalam
tabung
reaksi,
kemudian
ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 5,
dan 20 tetes ninhidrin, kemudian
dipanaskan dan diamati perubahan
warna yang terjadi.
Uji Sifat Koagulasi Protein
Pembentukan endapan dengan asam
dan alkali
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan tetes
demi tetes koagulan (H2SO4 1 N, KOH
0,5 N, NaOH 4 N, asam asetat glasial,
dan
HCl
pekat)
dan
diamati
perubahannya. Selanjutnya, sampel
diamkan selama 90 menit dan diamati,
kemudian dikocok dan dipanaskan, dan
kembali diamati perubahan yang terjadi.
Pembentukan endapan dengan garam
dan logam berat
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan tetes
demi tetes larutan logam (PbAc, CuSO4,
FeCl3, HgCl2, dan ZnAc) kemudian
diamati perubahan yang terjadi.
Denaturasi dan Koagulasi
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin
dan
gelatin,
kemudian
ditambahkan 1 ml buffer asetat pH 4, pH
5 dan pH 6. Selanjutnya dikocok dan
diamati pada menit ke 0, 5 dan 15.
Dipanaskan selama 2 menit dan diamati
kembali.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Uji Titik Isoelektrik
Ditambahkan larutan asam seperti
pada tabel diktat praktikum kimia
pangan halaman 32, ditambahkan
akuades seperti pada tabel dihalaman 32,
dan terakhir di tambahkan 1 M larutan
kasein dalam Na-asetat, kemudian
dikocok dan diamati selama 10 – 20
menit.
Uji Salting Out
Mula-mula ditambahkan 1 ml sampel
albumin dan gelatin, dipanaskan pada
suhu 40 ℃ , kemudian ditambahkan
amonium sulfat sampai titik jenuh,
diaduk dan disaring sampai menjadi
filtrat. Kemudian ditambahkan padatan
(NaOH, NaCl, MgSO4, Na2SO4) dan
ditambahkan pereaksi buret kemudian
diamati perubahan yang terjadi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Praktikum kali ini membahas uji
kualitataif
terhadap
protein.
Uji
kualitatif protein yang dilakukan da
yaitu uji biuret, uji ninhidrin, pengujian
mengenai pembentukan asam dan alkali,
pembentukan garam dan logam berat,
denaturasi dan koagulasi protein, titik
isoelektrik protein, serta salting out.
Jenis protein yang digunakan untuk
pengujian diantaranya yaitu albumin
2%, urea, kasein, dan gelatin.
Uji Biuret
Tabel 1. Data Hasil Pengamatan Uji
Biuret
Perubaha +/
Kel
Sampel
n Warna
1,
2,
urea tidak
ungu muda
+
dipanaska bening
n
6
Albumin
Adanya
+
warna ungu
bening di
atas larutan
5, 9, Urea
Ungu muda +
10
dipanaska bening
n
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2017
Biuret adalah senyawa dengan dua
ikatan peptida yang terbentuk pada
pemanasan dua molekul urea. Suatu
enzim akan dapat menyatukan kedua
asam amino melalui reaksi dehidrasi
ketika dua asam amino berdekatan
dengan gugus amino dari asam amino
lain. Uji biuret merupakan suatu
pengujian untuk mengetahui adanya
ikatan peptida dari suatu sampel.
Adanya ikatan peptida mengindikasikan
adanya protein. Suatu polimer asam
amino tersusu atas ikatan-ikatan peptida.
Peptida adalah jenis ikatan kovalen yang
menghubungkan suatu gugus karboksil
satu asam amino dengan gugus amino
asam amino lainnya sehingga terbentuk
ikatan yang terbentuk ketika atom
karbon dari gugus karboksil suatu
molekul berikatan dengan atom nitrogen
dari gugus amina molekul lain. (Toha,
2001). ditambahkan dan diaduk sampai
homogen.
Uji
biuret
dilakukan
dengan
menambahkan 1 ml NaOH 10% dan ke
dalam sampel yaitu albumin dan urea,
lalu ditambahkan CuSO4 1%. Terdapat 3
perlakuan pada uji biuret kali ini, yaitu
dengan penambahan 1 ml albumin 2%,
penambahan urea, dan penambahan urea
yang dipanaskan terlebih dahulu.
Penambahan larutan NaOH pada larutan
protein tersebut yaitu sebagai katalis
yang berfungsi untuk menghancurkan
atau memecahkan molekul-molekul
protein.
Berdasarkan hasil uji biuret, pada
tiap sampel mengalami perubahan
warna. Sampel yang positif mengandung
ikatan
peptida
akan
mengalami
perubahan warna menjadi warna ungu.
Pada uji biuret ini ion Cu2+ akan
membentuk ikatan kompleks berwarna
ungu dengan peptida pada kondisi alkali
(Maligan, 2014).
Prinsip dari reaksi biuret adalah
Protein + Cu2+
Komplex Cu-
NaOH
Berdasarkan hasil uji biuret terhadap
sampel albumin dan urea, diperoleh
hasil bahwa kedua sampel positif
mengandung protein. Sampel urea dan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
albumin mengalami perubahan warna
menjadi warna ungu dan tampak bening.
Hal ini karena reaksi biuret bersifat
positif terhadap dua buah ikatan peptida
atau lebih seperti yang terdapat pada
albumin yang merupakan salah satu
protein globuler atau protein yang
berbentuk bulat (Winarno, 1997). Akan
tetapi, intensitas warna ungu pada
sampel urea tidak sebanyak pada sampel
albumin. Hal ini menunjukkan bahwa
ikatan peptida pada albumin lebih
banyak dibandingkan dengan ikatan
peptida pada urea. Urea bukan
merupakan protein, namun karena urea
mengandung gugus –NH2 (amin) yang
mempunyai kesamaan dengan gugus
protein sehingga membentuk warna
ungu sebagai hasil reaksi antara Cu 2+
dengan –NH. Oleh karena itu urea
memberikan hasil positif pada uji biuret.
Ninhidrin atau triketohidrien hidrat
adalah suatu senyawa oksidator kuat
yang bereaksi dengan asam amino pada
pH 4-8 dan dihasilkan senyawa
berwarna ungu. Ninhidrin biasa
digunakan untuk pengujian protein.
Ninhidrin dapat digunakan untuk
penentuan kadar asam amino baik secara
kualitatif maupun kuantitatif (Maligan,
2014). Uji ninhidrin dilakukan dengan
menyiapkan sampel dalam tabung reaksi
kemudian sampel tersebut ditambahkan
dengan larutan buffer asetat pH 5 yang
fungsinya adalah untuk menjaga reaksi
dalam suasana asam. Terdapat 2
perlakuan pada uji biuret kali ini, yaitu
dengan penambahan albumin 1% dan
urea yang dipanaskan. Masing-masing
perlakuan dimasukan dalam tabung
reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml
buffer asetat pH 5, dan 20 tetes
ninhidrin, kemudian dipanaskan dan
diamati perubahan warna yang terjadi.
Reaksi ninhidrin sering digunakan
untuk menghitung asam amino bebas.
Suatu asam amino jika direaksikan
dengan ninhidrin dalam jumlah berlebih,
maka untuk setiap mol asam amino yang
bereaksi dengan
ninhidrin, akan
terbentuk 1 mol ammonia, 1 mol
aldehid, 1 mol CO2, dan 1 mol
hidrindantin. Amonia yg dibebaskan
akan bereaksi dengan 1 mol ninhidrin
dan 1 mol hidrindantin menghasilkan
produk berwarna ungu (absorbansi
maksimum pada 570 nm). Prolin dan
hidroksiprolin: produk berwarna kuning
(aborbansi maksimum padaa 440 nm)
(Fennema, 1996).
Gambar 1. Reaksi pada Uji Ninhidrin
(Fennema, 1996)
Berdasarkan hasil dari uji ninhidrin
pada sampel albumin dan urea,
diperoleh hasil bahwa pada sampel
albumin terjadi perubahan warna
menjadi ungu muda, sedangkan pada
sampel urea warnanya bening dan hanya
sedikit berwarna ungu muda. Semakin
pekat warna hasil reaksi, semakin tinggi
kandungan asam amino dalam sampel.
Oleh karena itu, dari hasil uji ninhidrin
yang dilakukan dapat disimpulkan
bahwa albumin menunjukkan hasil
positif mengandug asam amino bebas
sedangkan urea menunjukkan hasil
negatif (tidak mengandung asam amino
bebas).
Tabel 2. Pembentukan Endapan Asam
dan Alkali
Setela
Setelah
Ke Samp
h 90
Dipanask
l
el
menit
an
HCl +
Tetap
Tetap
6B
gelatin bening
bening
Terdap
NaOH
at
7B
+
Keruh
endapa
gelatin
n
Asam
asetat
Tetap
Tetap
8B
+
bening
bening
albumi
n
Keruh,
HCl + terdapa
Keruh,
9B albumi
t
terdapat
n
endapa
endapan
n
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
NaOH
10
+
Tetap
Tetap
B albumi bening
bening
n
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2014
Pengujian sifat koagulasi protein
yaitu pembentukan endapan asam dan
alkali, sampel berupa albumin dan
gelatin ditambahkan asam dan basa
yaitu H2SO4 1 N, KOH 0,5 N, NaOH 4
N, asam asetat glasial, dan HCl pekat.
Setelah itu, sampel yang telah
ditambahkan asam dan basa tersebut
didiamkan selama 90 menit lalu dikocok
dan dipanaskan. Masing-masing sampel
diamati perubahan yang terjadi setelah
didiamkan selama 90 menit dan setelah
dilakukan pemanasan.
Berdasarkan hasil pengujian terhadap
sampel gelatin dan albumin, dapat
diketahui
bahwa
pada
beberapa
perlakuan penambahan asam dan basa
terjadi kekeruhan dan endapan setelah
didiamkan selama 90 menit dan setelah
dipanaskan. Sampel yang terdapat
eendapan putih yaitu albumin + KOH,
Albumin + NaOH 4 N, Albumin 1 ml
+ HCl pekat, sedangkan pada
penambahan CH3COOH atau asam
asetat tidak terjadi perubahan pada
sampel. Hal ini dikarenakan CH3COOH
atau asam asetat merupakan asam
lemah. Menurut Lehninger (1990), jika
protein dipanaskan dengan asam atau
basa
kuat,
asam
amino
unit
pembangunnya dibebaskan dari ikatan
kovalen yang menghubungkan molekulmolekul ini menjadi rantai. Oleh karena
itu, dapat dikatakan bahwa penambahan
asam kuat dan basa kuat menyebabkan
terjadinya hidrolisis protein menjadi
asam amino.
Gambar 1. Hidrolisis Protein menjadi
Asam Amino
(Toha, 2001)
Sifat
koagulasi
protein
selanjutnya yang diuji yaitu mengenai
pembentukan endapan garam dan logam
berat. Pada pengujian ini, sampel yang
digunakan adalah gelatin dan albumin
1% sebanyak 1 ml. Masing-masing
sampel ini ditambahkan dengan garam
yang
mengandung
logam
berat
diantaranya yaitu PbAc, CuSO4, FeCl3,
HgCl2, dan ZnAc. Garam-garam tersebut
ditambahkan sedikit demi sedikit sampai
terjadi perubahan pada sampel.
Berdasarkan hasil pengujian yang
dilakukan, diperoleh hasil bahwa
penambahan garam dan logam berat
menimbulkan beberapa perubahan pada
beberapa sampel dan perlakuan.
Perubahan tersebut diantaranya berupa
timbulnya endapan dan gelembung pada
bagian atas sampel.
Berdasarkan data hasil pengamatan
menunjukan sampel Albumin + PbAc,
albumin + CuSO4, Albumin + ZnAc ,
dan Gelatin 1ml+ PbAc yang
menimbulkan endapan, sisa sampel
tidak menunjukan adanya endapan yang
terbentuk.
Endapan yang terbentuk pada sampel
gelatin, akibat penambahan garam
FeCl3, sedangkan pada sampel albumin
endapan terbentuk akibat penambahan
garam logam. Albumin merupakan
protein dengan berat molekul kecil yang
biasa terdapat dalam telur, serum dan
susu. Oleh karena itu, albumin dapat
mengendapkan garam dan logam berat,
sedangkan gelatin yang merupakan
protein dari jaringan kolagen tidak dapat
mengendapkan garam dan logam berat
karena kadar proteinnya yang rendah.
Penambahan larutan protein dengan
garam logam berat, anion-anion dari
garam logam berat akan menyebabkan
suasana larutan menjadi sedikit asam,
sehingga protein akan mengkondisikan
diri sebagai basa dan sebagian terdapat
sebagai anion. Anion dari protein inilah
yang bereaksi dengan ion logam berat
membentuk garam proteinat yang tidak
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
larut dalam air. Adanya endapan
disebabkan karena adanya kemampuan
protein atau asam amino untuk berikatan
dengan ion logam di atas titik
isoelektriknya.
Kemampuan
ini
disebabkan karena pada saat pH berada
di atas titik isoelektrik protein atau asam
amino, maka ia akan bermuatan negatif
sehingga mampu mengikat ion logam
yang bermuatan positif.
Selain menyebabkan terbentuknya
endapan, adanya pertambahan ion logam
menyebabkan
putusnya
jembatan
disulfida dan ikatan kovalen S-S pada
protein yang mengandung gugus
sulfuhidril. Sedangkan untuk asam
amino seperti asam aspartat, glisin, dan
alanin tidak membentuk endapan karena
suasana larutan masih berada di bawah
titik isoelektrik kedua asam amino
tersebut, sehingga asam amino yang
bermuatan
positif
tidak
mampu
berikatan dengan ion logam yang
bermuatan positif pula. Selain itu, ketiga
jenis asam amino tersebut tidak
mengandung
gugus
sulfuhidril
(Fennema, 1996).
Pengendapan garam logam berat oleh
protein
banyak
digunakan
atau
diaplikasikan dalam berbagai aspek.
Salah satunya yaitu dalam pengendapan
dan pengeluaran logam beracun dalam
tubuh. Menurut Winarno (1991), garamgaram logam berat dan asam-asam
mineral kuat ternyata baik digunakan
untuk mengendapkan protein. Prinsip ini
dipakai untuk mengobati orang yang
keracunan logam berat dengan memberi
minum susu atau makan telur mentah
kepada pasien.
Denaturasi dan Koagulasi
Denaturasi adalah proses yang
mengubah struktur molekul tanpa
memutus salah satu dari ikatan peptida
dari protein. Proses ini khas pada setiap
protein dan mempengaruhi protein yang
berbeda untuk derajat yang berbeda,
tergantung pada struktur protein.
Denaturasi dapat disebabkan oleh
beberapa faktor, seperti panas, pH,
garam,
dan
efek
permukaan
(DeMan,1999).
Denaturasi protein dapat diartikan
suatu perubahan atau modifikasi
terhadap struktur sekunder, tertier dan
kuartener molekul protein tanpa
terjadinya pemecahan ikatan-ikatan
kovalen. Karena itu, denaturasi dapat
diartikan suatu proses terpecahnya
ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik,
ikatan garam dan terbukanya lipatan
molekul protein. Proses denaturasi
biasanya disertai dengan terjadinya
koagulasi atau penggumpalan pada
protein. (Winarno 1992),
Pengujian terhadap denaturasi dan
koagulasi protein kali ini, jenis protein
yang digunakan yaitu albumin dan
gelatin.
Sampel diberi beberapa
perlakuan yaitu ditambahkan 1 ml buffer
asetat pH 4, pH 5 dan pH 6. Selanjutnya
dikocok dan diamati pada menit ke 0, 5
dan 15.
Selanjutnya, masing-masing sampel
dipanaskan hingga beberapa saat untuk
mengetahui apakah perlakuan panas
dapat memengaruhi denaturasi dan
koagulasi protein.
Berdasarkan hasil pengujian terhadap
sampel albumin dan gelatin yang diberi
buffer asetat dengan berbagai pH,
diperoleh hasil yang berbeda pada setiap
perlakuan.
Berdasarkan
data
pengamatan, terdapat sesuatu yang unik
pada sampel Albumin+Buffer asetat Ph
4,5, sampel tersebut sejak pertama
dicampurkan atau pada menit ke-0
sampel tersebut langsung menunjukan
adanya gumpalan putih dipermukaan,
pada menit ke-5 larutan menjadi bening
pada bagian bawah, dan pada menit ke15 larutan tampak putih keruh ada
endapan putih, sedangkan Setelah
dipanaskan larutan menjadi Bening ada
endapan putih. Selain itu, albumin +
Buffer + asetat pH 5,98 pada menit ke15 larutan tidak berwarna, namun
banyak gelembung udara, dan setelah
dipanaskan larutan berwarna putih susu
berbentuk busa dan menggumpal.
Sedangkan Gelatin+ buffer asetat pH 45,2 tidak terdapat endapan dan warna
larutan tidak mengalami perubahan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
Adanya pembentukan endapan dan
gumpalan pada protein mengindikasikan
terjadinya denaturasi dan koagulasi.
Pada nilai pH di bawah dan di atas pH
isoelektrik, protein membawa muatan
positif atau muatan negatif. Tolakan
elektrostatik
dan
hidrasi
residu
memengaruhi
kelarutan
protein.
Mayoritas protein memiliki kelarutan
minimum pada pH 4-5 (pH isoelektrik)
dan kelarutan maksimum pada pH basa
(DeMan, 1999). Hal ini sesuai dengan
hasil pengujian dimana pada pH 4 dan
5,98 terbentuk banyak endapan dan
gumpalan
yang
mengindikasikan
kelarutan protein yang minimum,
sedangkan pada pH 5,0 ke atas protein
(kasein) memiliki kelarutan yang tinggi
(tidak
membentuk
endapan
dan
gumpalan).
Denaturasi dan koagulasi protein
dapat menimbulkan beberapa efek pada
protein tersebut. Efek dari denaturasi
dan koagulasi protein salah satunya
adalah terjadinya perubahan pada
struktur sekunder dan tersier. Selain itu,
menurut DeMan (1999), denaturasi dan
koagulasi protein adalah aspek stabilitas
panas yang dapat berhubungan dengan
komposisi asam amino dan urutan
protein.
Uji Titik Isoelektrik
Titik isoelektrik suatu asam amino
adalah suatu besaran fisis. Pada titik
isoelektrik, terdapat kesetimbangan
antara bentuk-bentuk asam amino
sebagai ion amfoter, anion, dan kation.
Pada setiap pH di atas titik isoelektrik,
asam amino mempunyai muatan negatif.
Sedangkan pada pH di bawah titik
isoelektrik, asam amino mempunyai
muatan
positif.
(Fessenden
&
Fessenden, 1986)
Titik isoelektrik adalah pH dimana
protein tidak mempunyai selisih muatan
dan karena itu tidak bergerak dalam
medan listrik (Sudarmadji, 1996).
Protein merupakan polimer dari asam
amino. Asam amino mengandung
sebuah gugus karboksil (asam) dan
sebuah gugus amino (basa), sehingga
asam amino bersifat asam dan basa atau
disebut ampholytes (Fennema, 1996).
Tiap jenis protein mempunyai titik
isoelektrik yang berlainan. Pengendapan
paling cepat terjadi pada titik isoelekrik
ini, dan prinsip ini digunakan dalam
proses-proses
pemisahan
serta
pemurnian protein (Winarno, 1991).
Tabel 6. Hasil Pengamatan Uji Titik
Isoelektrik
Sumber: Dokumentasi pribadi, 2017
Pengujian titik isoelektrik protein
kali ini, sampel yang digunakan adalah
kasein. Sampel tersebut diberi beberapa
perlakuan seperti penambahan asam
asetat dan aquades seperti yang terlihat
pada tabel berikut:
Gambar 2. Prosedur Uji Titik Isoelektrik
(Sumber: Diktat
Pangan (hlm 32)
Praktikum
Kimia
Setelah diberi berbagai perlakuan,
sampel diamati selama 10-20 menit dan
dilihat perubahan yang terjadi.
Berdasarkan hasil pengujian pada
sampel, diperoleh hasil bahwa pada
hampir
semua
perlakuan
tidak
menunjukan adanya endapan setelah
sampel didiamkan selama 10 menit. Hal
ini menunjukkan bahwa masing-masing
sampel belum mencapai titik isoelektrik.
Endapan hanya terdapat pada data
kelompok 2 dan 5, dimana asam asetat
yang
ditambahkan
masing-masing
kelompok yaitu 0,01 N dan 0,1 N. Titik
isoelektrik ini tercapai karena adanya
penambahan asam asetat. Berdasarkan
hasil pengujian dapat disimpulkan
bahwa banyaknya asam asetat tidak
memengaruhi perbedaan pada titik
isoelektrik. Hal ini dipengaruhi oleh
banyaknya aquades yang ditambahkan.
Semua perlakuan diatas menunjukkan
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
perbandingan yang relatif tetap antara
asam asetat dan aquades yang
ditambahkan, sehingga konsentrasi dan
pH dari asam asetat relatif sama.
Asam asetat merupakan asam lemah
yang memiliki pH yang tidak terlalu
kecil atau sekitar 4-5. Menurut Pirie
(1987), sebagian besar protein hasil
ekstraksi berdasarkan studi yang
dilakukan mengendap pada pH antara 4
dan 5. Selain itu, menurut Fennema
(1996), titik isoelektrik albumin adalah :
4,55-4,90. Oleh karena itu, penambahan
asam asetat pada albumin.menyebabkan
albumin mencapai titik isoelektriknya.
Pada kondisi ini protein memiliki
kelarutan minimum, sehingga protein
dapat dipisahkan dari bagian bahan
lainnya yang tidak diinginkan (Page,
1981).
Salting Out
Salting out adalah prinsip seberapa
besarnya daya kelarutan protein setelah
diberi garam. Pada pengujian salting
out, sampel yang digunakan adalah
albumin dan gelatin. albumin dan
gelatin, dipanaskan pada suhu 40
℃ ,
kemudian
ditambahkan
amonium sulfat sampai titik jenuh,
diaduk dan disaring sampai menjadi
filtrat. Kemudian ditambahkan padatan
(NaOH, NaCl, MgSO4, Na2SO4) dan
ditambahkan pereaksi buret kemudian
diamati
perubahan yang terjadi.
Berdasarkan hasil pengujian salting out,
tidak ditemukan adanya endapan pada
semua sampel. Bila dalam suatu larutan
protein ditambahkan garam, daya larut
protein akan berkurang, akibatnya
protein akan terpisah sebagai endapan.
Peristiwa pemisahan protein ini disebut
salting out. Bila garam netral yang
ditambahkan berkonsentrasi tinggi,
maka
protein
akan
mengendap
(Winarno, 1991). Pada percobaan ini,
ketika ke dalam larutan protein
ditambahkan garam, larutan protein
tidak mengendap. Dikarenakan protein
tidak larut dalam larutan garam
pekat. Protein jika terlarut dalam
garam akan menimbulkan endapan
berwarna putih. Mengendapnya
protein disebabkan karena adanya
kompetisi antara ion-ion garam dengan
molekul protein untuk mengikat air.
Karena ion-ion dari garam lebih mudah
dalam mengikat air, menyebabkan
kelarutan protein dalam air berkurang.
Dengan penambahan garam secara
kontinyu, molekul air akan keluar dari
larutan dan mengendap.
Setelah dilakukan pengujian biuret
terhadap endapan putih semua sampel,
diperoleh hasil bahwa endapan yang
dilarutkan berubah warna menjadi ungu,
kecuali pada sampel yang diberi garam
MgCl2. Timbulnya warna ungu pada
sampel mengindikasikan adanya protein
yang mengendap akibat penambahan
garam. Adapun pada sampel yang diberi
garam MgCl2 seharusnya menunjukkan
hasil positif pada biuret. Akan tetapi,
dari hasil percobaan sampel ini tidak
berubah warna atau menunjukkan hasil
negatif. Hal ini disebabkan oleh adanya
beberapa kesalahan yang terjadi ketika
pengujian. Kesalahan ini terjadi karena
adanya
ketidaktelitian
dalam
pengambilan endapan sampel ataupun
faktor-faktor lainnya.
KESIMPULAN
Uji biuret pada sampel albumin dan
urea menyebabkan perubahan warna
larutan sampel menjadi berwarna ungu.
Hal ini menunjukkan bahwa albumin
dan urea positif memiliki ikatan peptida.
Uji ninhidrin pada sampel albumin
menyebabkan perubahan warna larutan
sampel menjadi berwarna ungu. Hal ini
menunjukkan bahwa albumin positif
mengandung asam amino bebas,
sedangkan urea tidak memiliki asam
amino bebas. Pengendapan asam dan
alkali terjadi pada protein yang
ditambahkan asam kuat dan basa kuat.
Endapan asam dan alkali terbentuk pada
alumin yang diberi penambahan HCl
dan gelatin yang diberi penambahan
NaOH. Protein yang diberi penambahan
garam logam berat akan mengendap
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017
bersama logam berat yang terdapat pada
garam
tersebut.
Denaturasi
dan
koagulasi protein (albumin) terjadi pada
albumin yang diberi penambahan buffer
asetat dengan pH 4, pH. 4,5 dan 4,98.
Titik isoelektrik ditandai dengan
menurunnya kelarutan protein dan
terbentuknya endapan. Titik isoelektrik
albumin terjadi pada pH 4,55-4,90.
Salting out terjadi pada protein
(albumin) yang diberi penambahan
garam netral. Hal ini ditandai dengan
terbentuknya
endapan
protein
berwarna
putih
yang
dapat
memberikan hasil positif jika
dilakukan uji biuret.
DAFTAR PUSTAKA
Fennema, O. R. 1996. Food Chemistry
3rd Edition. Marcel Dekker Inc,
New York. Inc, Maryland
Maligan, J. M. 2014. Uji Kualitatif
Karbohidrat
dan
Protein.
Available
at:
http://maharajay.lecture.ub.ac.id/fi
les/2014/02/Uji-Kualitatif-KHProtein.pdf
Lehninger, A.L. 1990. Dasar-Dasar
Biokimia Jilid 1. Terjemahan
Maggy Thenawidjaja. Penerbit
Lehninger, A.L. 1990. Dasar-Dasar
Biokimia Jilid 1. Terjemahan
Maggy Thenawidjaja. Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Page, D. 1981. Prinsip-Prinsip Biokimia.
Terjemahan R. Soendoro. Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Pirie, N.W. 1987. Leaf Protein and Its
By-products in Human and
Animal 2nd Edition. Combridge
University Press, Melborne.
Sudarmadji, S. 1996. Teknik Analisa
Biokimiawi. Liberty, Yogyakarta.
Toha,
A.
H.
2001.
Biokimia:
Metabolisme
Biomolekul.
Alfabeta, Bandung.
Winarno, F. G. 1991. Kimia Pangan dan
Gizi. PT. Gramedia Pustaka
Utama: Jakarta.
.
Asisten: Febrin Elisabeth E S
Tanggal praktikum: 7 November2017
Tanggal pengumpulan: 14 November 2017