33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
serta 2 ml aquadest ke dalam labu didih, lalu tambahkan beberapa batu didih di dalamnya. Setelah aquades dan sebagian toluene berpindah ke
tabung pengumpul, masukkan 10 mg serbuk bawang putih yang telah ditimbang secara seksama. Setelah tinggi air pada tabung pengumpul
tidak berubah, hitung kenaikan air yang terjadi Depkes RI, 2000. Kadar Abu
Lebih kurang 2 g sampai 3 g serbuk yang telah ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan
ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air
panas lalu saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrate ke dalam krus, uapkan,
pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Depkes RI, 2000
3.4.4 Penyiapan Hewan Uji
Hewan Uji yang di gunakan adalah tikus putih jantan galur Sprague Dawley berumur 7-8 minggu dengan berat badan 200-350 gram diaklimatisasi
selama dua minggu agar dapat menyesuaikan dengan lingkungannya. Selama
proses adaptasi, dilakukan pengamatan kondisi umum dan penimbangan berat badan.
3.4.5 Terminasi dan Pengukuran Parameter
Seluruh kelompok sampel tikus jantan putih galur Sprague Dawley diterminasi pada hari ke-30 dengan cara dimasukkan ke dalam toples yang telah
dijenuhkan dengan uap eter, kemudian dibedah untuk diambil testis kanan dan kiri dan kauda epididimis. Masing-masing testis kanan dan kiri ditimbang kemudian
disimpan dalam lemari pendingin hingga saat dilakukannya pengujian.
3.4.5.1 Uji Motilitas Sperma
Pengambilan spermatozoa pada epididimis kauda dengan metode cacah dan menggunakan pengenceran dengan garam fisiologis sebesar 1 ml. Untuk
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pengamatan motilitas spermatozoa dapat dilakukan dengan mengamati spermatozoa yang telah ditetesi ke bilik hitung Neubauer dengan perbesaran 400
kali. Motilitas sperma ditentukan dari 100 spermatozoa dalam satu lapang pandang. Motilitas spermatozoa dinilai berdasarkan persen spermatozoa dengan
motilitas baik, yaitu spermatozoa yang bergerak lurus ke depan, cepat, lincah dan aktif Kaspul, 2004.
3.4.5.2 Analisis Protein Kaspase-3 dengan Kit ELISA Pembuatan Homogenat
Siapkan potongan 50 mg jaringan testis masing-masing diambil dari testis kanan dan testis kiri tikus, kemudian dimasukkan ke dalam satu tube. Tambahkan
Phosphate Buffer Saline PBS dengan pH 7 sebanyak 1 mL lalu homogenasi. segera lakukan pengujian atau simpan dalam lemari pendingin pada suhu 4
C sampai siap digunakan.
Pembuatan Standar
Sentrifugasi vial standar pada 6000-10000 rpm selama 30 detik. Rekonstitusi standar dengan 1 mL sampel diluen, pastikan tercampur dengan baik.
Pipet 250 µl sampel diluen ke dalam masing-masing tube S0-S6. Buat seri pengenceran dengan menambahkan 250 µl larutan standard yang telah
direkonstitusi ke dalam tube S6 yang telah berisi diluen, homogenkan. Lakukan pengenceran dari tube S6 ke tube selanjutnya hingga tube S1. Tube S0 berisi
sampel diluen tanpa standard yang bertindak sebagai blanko.
Analisis Protein Kaspase-3
Siapkan reagen, sampel dan standar. Sampel homogenate yang telah dibuat dimasukkan ke dalam mikroplate sebanyak 100 µL. Inkubasi dalam oven
selama 2 jam dengan suhu 37 C. Setelah inkubasi, buang cairan dalam well tanpa
pencucian. Selanjutnya, tambahkan 100 µL biotin anti bodi ke dalam setiap well. Tutup well menggunakan strip perekat kemudian inkubasi selama 1 jam pada suhu
37 C. Lakukan pencucian menggunakan wash buffer hingga 3x pengulangan.
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada pencucian terakhir, hilangkan semua wash buffer yang tersisa dengan dekantasi. Letakkan tube secara terbalik diatas tissue bersih.
Tambahkan 100 µL HRP-avidin ke dalam setiap well. Tutup mikroplate menggunakan strip perekat baru, lalu inkubasi selama 1 jam pada suhu 37
C. Lakukan pencucian seperti pada langkah sebelumnya, lakukan hingga 5x
pengulangan. Setelah pencucian terakhir, tambahkan 50 µL TMB substrat ke dalam setiap well, inkubasi selama 15-30 menit dan pastikan terlindung dari
cahaya. Selanjutnya, tambahkan 50 µ L Stop solution ke dalam setiap well, ketuk- ketuk tube perlahan untuk memastikan tercampur dengan baik. Tahap terakhir
adalah menentukan optical density setiap well dengan menggunakan ELISA reader yang diatur pada panjang gelombang 450 nm.
3.5 Analisis Data
