Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Metodologi Percobaan 1. Rancangan Penelitian

BAB 3 BAHAN DAN METODE

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada April 2013 sampai dengan April 2014 di Laboratorium Fisiologi Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan dan di Laboratorium Biokimia Balai Veteriner, Medan, Sumatera Utara.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kotak perlakuan sampel yang terbuat dari gabus, dilapisi dengan busa serta triplek polywood kedap suara, speaker , multi player, flasdisk, amplifier, sound level meter, pengukur waktu timer, spit, timbangan, mikroskop, masker, sarung tangan, spidol parmanen, counter , tabung EDTA, kamar hitung Improved Neubauer, objek glass, cover glass , aspirator leukosit, pipet leukosit, chamber, kandang penelitian, camera digital , dan alat tulis. Bahan yang digunakan adalah tikus jantan Rattus norvegicus galur Wistar, pakan, sekam, gabus, tissue, larutan turk, zat warna geimsa, methanol dan air. 3.3. Metodologi Percobaan 3.3.1. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni in vivo, dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL yang terdiri dari 4 kelompok perlakuan, dan 6 ekor tikus sebagai ulangan. Kontrol yang digunakan adalah kontrol normal tanpa diberi perlakuan, sedangkan perlakuan yang diberikan adalah diberikan kebisingan dengan tingkat kebisingan yang berbeda-beda. Universitas Sumatera Utara 3.3.2. Prosedur Percobaan 3.3.2.1. Penyediaan Hewan Penelitian Penelitian ini menggunakan tikus Rattus norvegicus galur Wistar yang berumur 8-12 minggu dengan berat badan 150-250 gram, yang diperoleh dari Balai Veteriner, Medan, Sumatera Utara dan di pelihara di Pemeliharaan Tikus di Departement Biologi FMIPA Universitas Sumatera Utara, Medan sebanyak 24 ekor. Kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 60x40x20 cm yang ditutupi dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap dua kali seminggu Smith Mangkoewidjojo, 1988. Cahaya ruangan dikontrol selama 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00, dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembapan ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Pakan berasal dari PT. Charon Pokpan tipe CP 551 dan air minum air PAM disuplai setiap hari secara berlebih.

3.3.2.2. Besar Sampel

Jumlah tikus percobaan per kelompok ulangan ditentukan dengan rumus t-1 n- 1 ≥15 Federer, 1963. Dimana, t adalah jumlah perlakuan dalam penelitian ini ada 4 kelompok perlakuan dan n adalah jumlah ulangan per kelompok, maka jumlah n yang diharapkan secara teoritis adalah 6 ekor, sehingga keseluruhan hewan coba yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah 24 ekor.

3.3.2.3. Pembagian Kelompok Perlakuan

Hewan percobaan dibagi dalam empat kelompok secara acak, masing-masing kelompok sebanyak 6 ekor. a. Kelompok I PO terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa tidak diberi perlakuan bising Kelompok Kontrol b. Kelompok II P1 terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa diberi bising sebesar 25- 50 dB selama 8 jamhari c. Kelompok III P2 terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa diberi bising sebesar 55-80 dB selama 8 jamhari d. Kelompok IV P3 terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa diberi bising sebesar 85-110 dB selama 8 jamhari Universitas Sumatera Utara

3.3.2.4. Pembuatan Alat Perlakuan

Alat perlakuan dirancang dengan elemen-elemen seperti pada Gambar 3.1. a Kotak perlakuan sampelKotak kedap suara terdiri dari gabus dilapisi dengan busa serta triplek polywood kedap suara. Kemudian speaker diletakkan menempel pada atap penutup kotak dan permukaan kotak diberi lubang untuk ventilasi dan mengukur intensitas bising. Intensitas diukur pada 4 titik yang berbeda dan tidak melebihi 1 dB. b Flasdisk dengan file yang berisi rekaman suara bising dihubungkan dengan DVD Multi player3 dengan frekuensi 1 sd 10 kHz c DVD Multi player3 untuk menghidupkan sumber suara dari flasdisk d Amplifier untuk mengeraskanmengatur intensitas bising dB sesuai volume suara. e Sound Level Meter untuk mengukur intensitas bising pada kotak perlakuan f Timer untuk mengukur waktu perlakuan Gambar 3.1. a. Kotak perlakuan sampel b. Flasdisk; c. DVD Multi player3; d. Amplifier; e. Sound Level Meter; f. Timer

3.3.2.5. Cara Kerja Penelitian

Tikus jantan Rattus norvegicus galur Wistar diberikan perlakuan berupa suara bising sebanyak 8 jamhari selama 8 hari sesuai dengan kelompok tikus masing-masing. Pada hari ke 9, tikus dibedah dan diambil darahnya dari jantung dengan spit dan ditampung dalam tabung EDTA agar darah tidak membeku, kemudian dilakukan hitung jumlah leukosit dengan menggunakan kamar hitung a b c d e f Universitas Sumatera Utara Neubauer Improved, dan sediaan apusan darah untuk menghitung jumlah jenis leukosit.

3.3.2.6. Prosedur Pemeriksaan Jumlah Leukosit

a. Diambil darah tikus percobaan yang telah ditampung dalam tabung EDTA b. Diisi pipet leukosit dengan darah hingga dengan tanda garis 0, lalu dibersihkan ujung pipet dengan tissue c. Sambil menahan darah pada ujung pipet, diisi pipet dengan larutan Turk sampai angka 11, dan diletakkan pipet secara horizontal untuk menghindari mengalirnya keluar larutan d. Ditutup kedua ujung pipet dengan jari, kemudian pipet leukosit digoyang membentuk angka delapan selama 3-5 menit e. Dibuang 3 tetes larutan dari ujung pipet, kemudian diteteskan larutan ke dalam kamar hitung yang telah ditutup dengan kaca penutup f. Kamar hitung didiamkan beberapa menit agar leukosit mengendap g. Dilakukan perhitungan di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 x bidang besar kamar. Dihitung bidang A+B+C+D, dimana tiap bidang luasnya 1 mm per segi, dengan rumus: + + + x x 4 = a x 50 ul Keterangan :  a = A+B+C+D  Faktor 10 = karena dalamnya kamar hitung 0,1 mm  Faktor 20 = karena pengenceran darah 20 kali  Faktor 4 = karena seluruh permukaan yang dihitung adalah 4 mm per segi Kosasih, 1984 Gambar 3.2. Kamar Hitung Improved Neubauer A B C D Universitas Sumatera Utara 3.3.2.7. Prosedur Pemeriksaan Hitung Jenis Leukosit 3.3.2.7.1. Cara Membuat Sediaan Apus a. Diambil darah 1 tetes dari tabung EDTA lalu diletakkan darah pada 2-3 mm dari ujung kaca objek. Diletakkan kaca penghapus dengan sudut 30-40 derajat terhadap kaca objek di depan tetes darah b. Ditarik kaca penghapus ke belakang sehingga menyentuh tetes darah, ditunggu sampai darah menyebar pada sudut tersebut c. Dengan gerakan yang bagus, didorong kaca penghapus sehingga terbentuk apusan darah sepanjang 3-4 cm pada kaca objek d. Dibiarkan apusan darah mengering di udara Kosasih, 1984.

3.3.2.7.2. Cara Mewarnai Sediaan Apus

a. Diletakkan sediaan apus pada dua batang gelas di atas bak tempat pewarnaan b. Difiksasi sediaan apus di dalam methanol absolut selama 2-3 menit c. Digenangi sediaan apus dengan zat warna geimsa 5 lalu dibiarkan selama 20- 30 menit d. Dibilas dengan air, mula-mula dengan air yang lambat kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua kelebihan zat warna. Dibiarkan mengering Kosasih, 1984. Universitas Sumatera Utara

3.3.2.7.3. Pemeriksaan Hitung Jenis Leukosit

a. Diperiksa apusan darah yang telah dikeringkan di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 lensa okuler x 10 lensa objektif, cari dibagian mana darah tersebar merata biasanya pada sediaan yang tipis b. Lensa objektif diganti dengan perbesaran 40x, kemudian 100x dan sediaan diberi minyak imersi c. Digolongkan dan dicatat setiap sel berinti pada daerah yang dilalui sampai genap 100 sel. Kemudian masing-masing dibuat persentasenya Kosasih, 1984. Tabel 3.1. Nilai Normal Hitung Jenis Leukosit Tikus Putih Dewasa Jenis Leukosit Rata-Rata Jumlah sel Netrofil 15 8-24 Eosinofil 1 0-4 Limfosit 81 70-89 Monosit Basofil 3 1-6 Sumber: Cameron dan Watson 1949

3.4. Analisis Data