12
polifenol yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C
6
– C
3
– C
6,
yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan 3 karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga Markham, 1988.
Kerangka flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.2 berikut:
Gambar 2.2 Kerangka flavonoid
Flavonoid dalam tumbuhan sebagai campuran dari flavonoid yang berbeda golongan dan jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal. Flavonoid pada
tumbuhan terdapat dalam berbagai bentuk struktur molekul dengan beberapa bentuk kombinasi glikosida. Untuk menganalisis flavonoid lebih baik memeriksa
aglikon yang telah terhidrolisis daripada dalam bentuk glikosida dengan strukturnya yang rumit dan kompleks. Flavonoid dapat berkhasiat sebagai
antioksidan, antibakteri dan antiinflamasi Harborne, 1987.
Struktur dasar dan sistem penomoran untuk turunan flavonoid dapat dilihat pada Gambar 2.3 berikut:
Gambar 2.3 Struktur dasar flavonoid
2.5 Spektrofotometri UV-Visible
Spektrofotometer pada dasarnya terdiri dari sumber sinar, monokromator, sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan alat ukur atau pencatat.
Spektrofotometri serapan merupakan metode pengukuran serapan radiasi
Universitas Sumatera Utara
13 elektromagnetik pada panjang gelombang tertentu, yang diserap zat Depkes RI,
1979. Berdasarkan panjang gelombang spektrofotometri dibagi dua yaitu
spektrofotometri ultraviolet dengan panjang gelombang 200-400 nm, digunakan untuk senyawa yang tidak berwarna dan spektrofotometri visibel sinar tampak
dengan panjang gelombang 400-750 nm, digunakan untuk senyawa yang berwarna Gandjar dan Rohman, 2007.
2.6 Metode Pemerangkapan Radikal 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil DPPH pertama kali ditemukan pada tahun 1922 oleh Goldschmidt dan Renn. DPPH berwarna ungu pekat seperti KMnO4,
bersifat tidak larut dalam air Molyneux, 2004. Struktur kimia DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.4 berikut ini:
DPPH radikal bebas DPPH non radikal
Gambar 2.4 Struktur kimia DPPH
Metode pemerangkapan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH adalah suatu metode sederhana yang dapat digunakan untuk menguji kemampuan
antioksidan yang terkandung dalam makanan. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang padat dan bentuk larutan. Prinsipnya adalah elektron ganjil pada
Universitas Sumatera Utara
14 molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang
tertentu, berwarna ungu Prakash, 2001. Resonansi DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.5 berikut ini:
Gambar 2.5 Resonansi DPPH
Ketika larutan DPPH dicampurkan dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, akan dihasilkan bentuk tereduksi dari DPPH dan
berkurangnya warna ungu Molyneux, 2004. Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan dapat
dilihat pada Gambar 2.6 berikut:
Gambar 2.6 Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan 2.6.1 Pelarut
Metode pemerangkapan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH akan memberi hasil yang baik dengan menggunakan pelarut metanol atau etanol
dan kedua pelarut ini tidak mempengaruhi dalam reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas Molyneux, 2004.
Universitas Sumatera Utara
15
2.6.2 Pengukuran absorbansi – panjang gelombang
Panjang gelombang maksimum λ
maks
yang digunakan dalam pengukuran sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang
maksimum untuk DPPH antara lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm dan 520 nm. Apabila pengukuran menghasilkan tinggi puncak maksimum, maka
itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang disebutkan di atas. Nilai absorbansi yang mutlak tidaklah penting, karena panjang gelombang
dapat diatur untuk memberikan absorbansi maksimum sesuai dengan alat yang digunakan Molyneux, 2004.
2.6.3 Waktu pengukuran
Lamanya pengukuran menurut beberapa literatur yang direkomendasikan adalah selama 60 menit, tetapi dalam beberapa penelitian waktu yang digunakan
sangat bervariasi yaitu 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit dan 60 menit. Waktu reaksi yang tepat adalah ketika reaksi sudah mencapai kesetimbangan. Kecepatan
reaksi dipengaruhi oleh sifat dari aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam sampel Molyneux, 2004; Rosidah, et al., 2008.
Universitas Sumatera Utara
16
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, pemeriksaan karakteristik, identifikasi bahan
tumbuhan, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak, pengujian aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol daun cincau perdu dengan metode aktivitas
pemerangkapan radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl yang diukur dengan menggunakan spektrofotometer sinar tampak. Penelitian ini dilakukan di
Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender Nasional, kertas perkamen, kertas saring,
lemari pengering, mikroskop Boeco, BM-180, Halogen Lamp, penjepit tabung, seperangkat alat penetapan kadar air, spatula, neraca digital Vibra,
spektrofotometer UV-Visible, freeze dryer Edwards.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun dari tumbuhan cincau perdu Premna oblongifolia Merr.. Bahan-bahan kimia berkualitas pro analisis, 1,1-
diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH, butyl hydroxytoluene BHT, amil alkohol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat,
Universitas Sumatera Utara
17 benzen, besi III klorida, bismuth III nitrat, isopropanol, kloroform, metanol, n-
heksan, natrium hidroksida, raksa II klorida, serbuk magnesium Mg, timbal II asetat, kristal kloral hidrat, toluen, kalium iodida, α-naftol. Bahan kimia
berkualitas teknis: etanol 96 dan air suling.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, dan pembuatan ekstrak etanol daun cincau perdu.
3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Bahan yang digunakan adalah daun cincau perdu yang masih segar dan cukup tua. Pengambilan daun cincau dilakukan secara purposif tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan diambil dari jalan Marelan VII, lingkungan V kelurahan tanah enam ratus, kecamatan
Medan Marelan.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi daun cincau perdu dilakukan di Herbarium Bogoriense,
Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor. 3.3.3 Pengolahan bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah daun cincau perdu. Daun dibersihkan dari kotoran yang melekat dan dicuci dengan air hingga bersih, lalu
ditiriskan dan dipotong menjadi beberapa bagian kecil. Selanjutnya dikeringkan dalam lemari pengering pada temperatur ± 40°C sampai kering ditandai bila
diremas rapuh, serbuk lalu disimpan dalam kantong plastik untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotoran lain.
Universitas Sumatera Utara
18
3.4 Pembuatan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.2 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.3 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling
sebanyak 100 ml Depkes RI, 1995. 3.4.4 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.5 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.6 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
19
3.4.7 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 1 ml
air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.9 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan
dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga volume larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.10 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1995.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian
volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
20
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam.
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari daun cincau perdu.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun cincau. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
Universitas Sumatera Utara
21
b. Penetapan kadar air simplisia
