Methylobacterium spp. yang dipanen setelah 7 hari masa inkubasi disajikan pada
Lampiran 7.
Pembuatan Media Perlakuan Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat
Methylobacterium spp. untuk Kultur
In Vitro Tanaman Nilam
Perlakuan pada percobaan I yaitu berupa teknik sterilisasi yang terdiri dari 3 taraf. Taraf yang pertama yaitu teknik sterilisasi menggunakan filter. Taraf yang
kedua yaitu teknik sterilisasi menggunakan filter kemudian otoklaf. Taraf yang ketiga yaitu teknik sterilisasi menggunakan otoklaf.
1. Teknik sterilisasi dengan filter
Langkah pertama adalah filterisasi penyaringan bakteri. Filterisasi ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet. Biakan yang telah
selesai diinkubasi selama 7 hari kemudian difilter disaring menggunakan filter milipore
ukuran 0,22 µm. Bakteri Methylobacterium spp. memiliki ukuran tubuh maksimum 0,8-1,0 x 1,0-10,0 µm Aken et al. 2004a, maka dari itu digunakan
filter milipore ukuran 0,22 µm untuk menyaringnya. Biakan bakteri diambil sekitar 2-3 ml menggunakan suntikan steril,
kemudian disuntikkan kedalam filter milipore yang diletakkan tepat dimulut labu erlenmeyer. Hasilnya akan menetes dari dalam filter milipore masuk kedalam labu
erlenmeyer. Proses ini dilakukan terus berulang-ulang sampai biakan habis. Filter milipore
dan suntikan diganti setiap 100 ml biakan demi menjaga sterilitas dan memudahkan peneliti dalam melakukan proses ini.
Hasil dari filterisasi ini berupa larutan bening berwarna kekuningan yang disebut filtrat. Filtrat hasil dari proses filterisasi disajikan pada Lampiran 7. Filtrat
ini mengandung auksin, sitokinin, dan bahan lainnya yang disintesis oleh bakteri. Filtrat ini yang ditambahkan kedalam media MS untuk kemudian ditanami
eksplan nilam. Langkah kedua adalah pembuatan media MS. Komposisi media MS
disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat sebanyak 500 ml dengan penambahan filtrat sebanyak 10. Artinya, pada 450 ml media MS ditambahkan
sebanyak 50 ml filtrat. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan
memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Larutan
dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran pH menggunakan digital pH meter. pH media yang sesuai
untuk kultur nilam adalah pH netral yaitu 5,8-6. Jika larutan media terlalu basa angka pH tinggi, diatas 6, maka dilakukan
penurunan pH dengan menambahkan larutan HCl setetes demi setetes menggunakan pipet sampai mencapai pH 5,8-6. Jika larutan terlalu asam angka
pH rendah, dibawah 5,8, maka dilakukan penambahan larutan KOH setetes demi setetes untuk meningkatkan pH sampai 5,8-6. Larutan media MS dituangkan
kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 450 ml. Larutan media dituangkan kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan
pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media, kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi
mengunakan otoklaf selama 25-30 menit. Langkah ketiga adalah menambahkan filtrat kedalam media MS steril.
Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus
dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan memadat dalam labu erlenmeyer. Sebanyak 50 ml filtrat ditambahkan kedalam labu erlenmeyer yang
berisi 450 ml media MS untuk membuat media MS+10 filtrat bakteri. Larutan dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 20 botol kultur
dengan volume yang sama yaitu sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10 filtrat ini kemudian ditutup
menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat dan siap ditanami eksplan. Langkah yang sama dilakukan untuk pembuatan
media MS+20 filtrat, dan seterusnya sampai media MS+50 filtrat. Perbedaannya hanya pada jumlah aquades yang dikurangi dan volume filtrat yang
dinaikkan sampai mencapai persentase yang diinginkan.
2. Teknik sterilisasi dengan filter kemudian otoklaf
