digital pH meter sampai mencapai pH 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 999 ml.
Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media,
kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit.
Langkah ketiga adalah menambahkan zeatin yang sudah dilarutkan dan dibuat stok dengan dosis uptake 1 mlliter serta sudah disterilisasi sebanyak 1 ml
kedalam media MS steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet
segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan
memadat dalam labu erlenmeyer. Larutan media dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama yaitu
sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10 TD-J
7
ini kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat.
D. Pembuatan media AMS Padat
Langkah-langkah pembuatan media AMS padat adalah dengan cara menimbang bahan-bahan media AMS dan memasukkannya kedalam gelas kimia
volume 1 liter. Komposisi media AMS disajikan pada Lampiran 4. Bahan-bahan ini dilarutkan dengan menggunakan pelarut berupa aquades steril sebanyak 700
ml. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai semua bahan benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran pH menggunakan digital pH
meter sampai mencapai pH 7. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan
ditambahkan aquades steril sampai tepat 1000 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram
pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 40
botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang telah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan
aluminium foil. Media disterilisasi menggunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat.
Percobaan III. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Auksin
TD-J
10
untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur
In Vitro
Media kontrol pada Percobaan III terdiri dari media MS, MS+IAA 0,1 mgl, media MS+NAA 0,1 mgl, dan media AMS padat. Langkah-langkah
pembuatan media MS dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin A. Langkah-langkah pembuatan media MS+IAA 0,1 mgl dan
media MS+NAA 0,1 mgl dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin B. Langkah-langkah pembuatan media AMS padat dijelaskan
pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan II poin D.
Penanaman Eksplan
Penanaman dilakukan didalam laminar air flow cabinet steril, eksplan ditanam ke dalam botol yang berisi media perlakuan, kemudian tepi botol
dipanaskan pada api bunsen dan ditutup dengan aluminium foil dan di seal dengan plastik wrap. Botol kultur yang berisi eksplan perlakuan disimpan dalam rak
kultur yang kondisi lingkungannya homogen sehingga diharapkan keragaman yang muncul benar-benar disebabkan oleh faktor perlakuan.
Pemeliharaan
Inkubasi diruang kultur pada kondisi terang dengan cahaya lampu TL 40 watt 1000 lux 16 jam per hari, temperatur 21-25
o
C. Eksplan yang terkontaminasi langsung dikeluarkan agar tidak menyebar. Penyemprotan alkohol 70 dilakukan
secara rutin pada botol kultur setiap hari untuk mencegah kontaminasi.
Pengamatan
Pengamatan akan dilakukan setiap minggu mulai dari 0 MST sampai 8 MST dengan parameter yang diamati sebagai berikut :
1. Jumlah tunas 2. Jumlah buku
3. Jumlah daun 4. Tinggi tunas
5. Waktu inisiasi tunas 6. Waktu inisiasi akar
7. Panjang akar 8. Jumlah akar
9. Ada atau tidak ada kalus terbentuk 10. Tingkat kontaminasi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Umum
Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman nilam Aceh steril koleksi Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BSJ, Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian BB-Biogen Bogor. Bahan tanaman ini telah mengalami mutasi yang diinduksi
oleh mutagen fisik berupa sinar gamma 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, dan 20 Gy. Hasil dari radiasi ini berupa mutan yang tahan terhadap cekaman kekeringan. Mutan ini
telah distabilkan dengan cara disubkultur terus-menerus pada media MS setiap 3 bulan sekali selama 1 tahun sebelum akhirnya digunakan pada penelitian ini.
Eksplan tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan I dan II adalah tunas satu buku sepanjang 2 cm. Sketsa gambar eksplan yang digunakan pada
Percobaan I dan II disajikan pada Lampiran 6. Eksplan tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan III adalah tunas tiga buku tanpa menghilangkan
pucuk sepanjang 4 cm. Sketsa gambar eksplan yang digunakan pada Percobaan III disajikan pada Lampiran 6. Persentase pertumbuhan dari semua eksplan yang
ditanam sebesar 88. Kontaminasi sebesar 12 diduga karena selama proses penanaman yang kurang terjaga sterilitasnya.
Kultur disimpan di dalam ruang kultur dengan penyinaran lampu TL 40 watt 1000 lux dan suhu 21-25
C. Pada awal pengkulturan, hampir semua tanaman yang dikulturkan belum memperlihatkan respon pertumbuhan, baik pada media
kontrol maupun media dengan penambahan isolat. Pada media dengan penamabahan isolat, beberapa biakan menunjukkan kelayuan, hal ini terjadi
karena masih adanya pengaruh methanol yang ditambahkan pada media kultur bakteri yang menghambat penyerapan hara sehingga menimbulkan kelayuan pada
kultur. Kelayuan ini tidak berlangsung lama, hanya pada satu minggu setelah tanam. Tanaman kembali terlihat segar dan memperlihatkan adanya pertumbuhan
pada minggu berikutnya yaitu pada dua minggu setelah tanam. Hasil sidik ragam pengaruh perlakuan Methylobacterium spp. terhadap pertumbuhan kultur nilam
disajikan pada Lampiran 8 sampai Lampiran 28 dan rekapitulasinya pada Tabel 2.
Tabel 2. Rekapitulasi Sidik Ragam Peubah yang Diamati pada Pertumbuhan Bibit Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro
No Peubah
[Hasil Transformasi √x+0,5]
Umur Tanaman MST
1 2
3 4
5 6
7 8
Percobaan IIA. Pengujian Strain TD-J
2
untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur
In Vitro
1 Jumlah Tunas
tn tn
tn tn
2 Jumlah Buku
tn tn
3 Jumlah Daun
tn tn
4 Tinggi Tunas
tn tn
tn tn
5 Jumlah Kalus
tn tn
tn tn
tn tn
6 Jumlah Akar
tn tn
tn tn
7 Panjang Akar
tn tn
tn tn
tn Percobaan IIB.
Pengujian Strain TD-J
7
untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur
In Vitro
1 Jumlah Tunas
L L
tn
2 Jumlah Buku
tn
L L
tn
3 Jumlah Daun
tn
L L
4 Tinggi Tunas
tn tn
tn
L L
5 Jumlah Kalus
tn tn
tn L
L 6
Jumlah Akar
tn tn
L L
7 Panjang Akar
tn tn
L L
Percobaan III.
Pengujian Strain TD-J
10
untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur
In Vitro
1 Jumlah Tunas
tn tn
tn tn
tn tn
tn tn
2 Jumlah Buku
tn tn
tn
3 Jumlah Daun
tn tn
tn
4 Tinggi Tunas
tn tn
tn tn
tn tn
tn tn
5 Jumlah Kalus
tn tn
tn
6 Jumlah Akar
tn tn
tn tn
7 Panjang Akar
tn tn
tn
Keterangan : tn : Tidak berpengaruh nyata pada uji F taraf 5
: Berpengaruh nyata pada uji F taraf 5 : Berpengaruh sangat nyata pada uji F taraf 1
MST : Minggu Setelah Tanam L
: Tidak ada data karena tidak dilakukan pengamatan yang bertepatan dengan hari libur nasional.
Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat Methylobacterium spp.
untuk Kultur In Vitro Tanaman Nilam
Eskplan nilam yang digunakan adalah tunas batang satu buku. Media yang digunakan adalah media MS serta media MS+BAP, MS+NAA, dan MS+IAA
pada konsentrasi 0,1 mgl sebagai kontrol. Strain TD-L
2
dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 vv media kultur ditambahkan kedalam media MS
untuk melihat aktifitas isolat bakteri Methylobacterium spp. pada kultur in vitro. Perlakuan teknik sterilisasi isolat bakteri terdiri dari tiga taraf. Taraf
pertama dengan menggunakan filter milipore ukuran 0,22 µm. Taraf kedua dengan menggunakan filter kemudian menggunakan otoklaf. Taraf ketiga dengan
menggunakan otoklaf. Pengamatan dilakukan pada respon pertumbuhan nilam yaitu jumlah dan tinggi tunas, jumlah buku, jumlah daun, jumlah dan panjang
akar, serta pembentukan kalus. Tabel 3. Pengaruh Teknik Sterilisasi Isolat TD-L
2
terhadap Persentase Kontaminasi Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro
Perlakuan Teknik
Sterilisasi Konsentrasi Isolat TD-L
2
Kontrol 10
20 30
40 50
BAP IAA
NAA Pada 1 Minggu Setelah Tanam
F 50
25 75
75 100
- -
- F+O
25 -
- -
O Mati
25 Pada 4 Minggu Setelah Tanam
F 50
25 100
100 100
- -
- F+O
25 Mati
100 -
- -
O Mati
25
Keterangan : F = Filter; F+O = Filter kemudian otoklaf, dan O = Otoklaf.
Hasil percobaan I menunjukkan bahwa media yang ditambahkan bakteri yang disterilisasi menggunakan otoklaf menghasilkan media steril tertinggi yaitu
93,75. Media yang disterilisasi menggunakan filter kemudian otoklaf menunjukkan hasil 68,78 media steril dan 31,25 terkontaminasi. Sedangkan
media yang disterilisasi menggunakan filter menghasilkan 25 media steril dan 75 media terkontaminasi.
Teknik sterilisasi dengan menggunakan filter memperlihatkan resiko kontaminasi yang tinggi dibandingkan sterilisasi dengan menggunakan otoklaf.
Sterilisasi dengan menggunakan filter menunjukkan hasil yang baik hanya pada
penambahan isolat sampai konsentrasi 20. Penambahan isolat dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari 20 mengalami kontaminasi. Data pengaruh
teknik sterilisasi terhadap persentase kontaminasi eksplan pada 1 MST dan 4 MST disajikan pada Tabel 3. Hal ini diduga disebabkan oleh semakin tinggi konsentrasi
isolat yang ditambahkan ke dalam media, semakin tinggi pula jumlah kontaminan dari lingkungan yang terakumulasi pada saat proses filterisasi sehingga
menyebabkan terjadinya kontaminasi. Media MS+10 TD-L
2
yang di sterilisasi menggunakan otoklaf memberikan respon pertumbuhan tanaman nilam yang lebih baik dibandingkan
media yang sama yang di sterilisasi menggunakan filter maupun menggunakan filter kemudian menggunakan otoklaf. Parameter jumlah tunas, jumlah buku dan
jumlah daun memberikan respon yang lebih baik dibandingkan parameter lainnya pada media MS+10 TD-L
2
yang disterilisasi menggunakan otoklaf. Data respon pertumbuhan tanaman nilam terhadap media dengan penambahan isolat TD-L
2
dengan teknik sterilisasi yang berbeda disajikan pada Tabel 4. Hal ini membuktikan bahwa hormon tumbuhan, vitamin dan senyawa lainnya yang
disintesis bakteri dalam crude isolat Methylobacterium sp strain TD-L
2
masih terlihat aktifitasnya meskipun isolat mengalami pemanasan dalam otoklaf.
Perlakuan media dengan penambahan isolat ini pengaruhnya tidak lebih baik dibandingkan dengan media kontrol MS+BAP 0,1 mgl dalam memacu
pertumbuhan tajuk tanaman. Hal ini diduga karena selain sitokinin, TD-L
2
dapat pula mensintesis auksin. Widajati, Salma, Kosmiatin, Pratiwi, dan Rahayu 2008
melaporkan bahwa strain TD-L
2
mampu mensintesis auksin IAA 12,68 ppm termasuk katagori tinggi, GA 98,36 ppm katagori sedang, serta sitokinin
trans- zeatin 49,74 ppm katagori sedang.
Adanya aktifitas auksin yang mempengaruhi pertumbuhan kultur nilam ini dapat dilihat dari parameter akar tanaman, karena salah satu fungsi auksin adalah
menginisiasi pertumbuhan akar utama Torres 1957, memacu pemanjangan sel-sel akar dalam konsentrasi sangat rendah Audus 1972, Bioma 2008, serta
memacu pertumbuhan akar dari stek Kormondy et al. 1977 in Salisbury dan Cleon 1995. Pada penelitian ini terlihat bahwa pada media
Filter 10 TD-L
2
, Filter+otoklaf
10 TD-L
2
, dan media Otoklaf
10 TD-L
2
dapat memacu
pembentukan akar lebih baik dibandingkan media kontrol MS+IAA 0,1 mgl maupun MS+NAA 0,1 mgl. Data respon pertumbuhan eksplan nilam terhadap
media dengan penambahan isolat Methylobacterium spp. strain TD-L
2
pada 4 MST disajikan pada Tabel 4. Hasil ini mendukung hasil penelitian sebelumnya
bahwa Methylobacterium spp. dapat meningkatkan jumlah tunas dan jumlah akar tanaman bunga matahari dalam kultur in vitro Koopmann dan Kutschera 2005.
Tabel 4. Respon Pertumbuhan
Tanaman Nilam terhadap
Media dengan Penambahan Isolat Methylobacterium spp. Strain TD-L
2
pada 4 MST
Media Rata-rata
Jumlah Tunas
Rata-rata Tinggi
tunas cm
Rata-rata Jumlah
Buku Rata-rata
Jumlah Daun
Akar Kalus
MS+BAP 0,1 mgl 14,30
0,40 12,10
3,40 -
- MS+IAA 0,1 mgl
3,70 0,30
6,70 3,60
+ ++
MS+NAA 0,1 mgl 7,30
0,30 8,30
12,00 -
++ Filter
10 TD-L
2
1,30 0,30
2,20 4,00
+++ +
20 TD-L
2
0,20 0,10
1,00 2,80
- -
30 TD-L
2
Kontaminasi 40 TD-L
2
Kontaminasi 50 TD-L
2
Kontaminasi Filter +
Otoklaf 10 TD-L
2
1,10 0,40
2,30 5,30
++ ++
20 TD-L
2
2,50 0,60
5,30 0,50
- +
30 TD-L
2
0,60 0,10
0,60 2,00
- +
40 TD-L
2
- -
- -
- ++
50 TD-L
2
Kontaminasi Otoklaf
10 TD-L
2
3,30 0,20
4,70 10,30
+ +
20 TD-L
2
- -
- -
- +
30 TD-L
2
1,00 0,10
1,00 1,30
- ++
40 TD-L
2
0,75 0,20
1,00 2,00
++ +
50 TD-L
2
1,00 0,20
1,00 2,00
- +
Keterangan : + pada kolom Akar = Skor persentase luasan media yang ditumbuhi Akar. + pada kolom Kalus = Skor persentase luasan media yang ditumbuhi kalus
Berdasarkan hasil percobaan
ini bahwa teknik sterilisasi
isolat menggunakan otoklaf memiliki resiko kontaminasi yang kecil dan lebih ekonomis
maka pengujian isolat beberapa strain Methylobacterium spp. pada percobaan II dan III dilakukan dengan teknik sterilisasi otoklaf kecuali untuk strain TD-J
7
. Strain TD-J
7
ini merupakan salah satu strain yang menghasilkan trans-zeatin tinggi. Pada percobaan IIB strain TD-J
7
dibandingkan dengan zeatin sintetik. Zeatin sintetik ini diketahui akan mengalami kerusakan jika disterilisasi
menggunakan otoklaf, maka dari itu pada percobaan IIB sterilisasi strain TD-J
7
tidak menggunakan otoklaf tetapi menggunakan filter. Konsentrasi penambahan isolat juga hanya dilakukan pada konsentrasi 0, 10, 20, dan 30 vv media
karena dengan konsentrasi 10 saja sudah memperlihatkan adanya aktifitas hormon tumbuhan yang disintesis oleh Methylobacterium spp.
Percobaan II. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Sitokinin
TD-J
2
dan TD-J
7
untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur
In Vitro A. Strain TD-J
2
Jumlah Tunas
Tunas yang muncul dihitung saat tunas telah mencapai tinggi 1 mm. Tunas yang dihitung meliputi tunas aksilar dan tunas adventif. Hasil sidik ragam
menunjukkan bahwa TD-J
2
memberikan pengaruh nyata terhadap jumlah tunas. Data pengaruh isolat Methylobacterium spp. strain TD-J
2
disajikan pada Tabel 5. Perlakuan media MS+30 TD-J
2
memberikan hasil terbaik dengan rata-rata jumlah tunas tertinggi pada 3 MST dan 4 MST adalah 1,31 dan 1,52,
sedangkan pada 5 MST sampai 8 MST, media MS+20 TD-J
2
memberikan hasil terbaik dengan rata-rata jumlah tunas tertinggi 6,55 tunas pada 8 MST.
Penambahan 20 dan 30 Methylobacterium spp. strain TD-J
2
ini menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan perlakuan lainnya bahkan lebih baik
dibandingkan dengan perlakuan media MS+0,1 mgl BAP yang selama ini diketahui sebagai media terbaik untuk perbanyakan tunas nilam dalam kultur
in vitro . Hal ini diduga karena bakteri ini mampu menghasilkan beberapa vitamin
dan antioksidan disamping kemampuannya menghasilkan sitokinin dan auksin. Sy et al. 2005 melaporkan bahwa Methylobacterium spp. memproduksi
vitamin B
12
yang dapat memacu perkembangan tanaman. He et al. 2003 juga melaporkan bahwa bakteri ini memproduksi pyrroloquinoline quinon PQQ
dengan karakteristik sebagai antioksidan yang dapat mengurangi kematian sel sehingga tanaman dapat tumbuh lebih baik. Methylobacterium spp. dilaporkan
dapat pula mensintesa berbagai enzim yang berperan dalam mengaktifasi metabolisme yang terjadi pada tanaman.
Tabel 5. Pengaruh Isolat TD-J
2
terhadap Jumlah Tunas Tanaman Nilam
Perlakuan Media
Minggu Setelah Tanam MST 1
2 3
4 5
6 7
8 TD-J
2
0,71 0,78
0,95bcd 1,04b
1,16ab 1,36a
6,08 5,90
10 0,76
0,81 1,14abc
1,26ab 1,11ab
1,58a 5,38
5,51 20
0,71 0,87
1,20ab 1,29ab
1,65a 1,63a
6,09 6,55
30 0,71
0,89 1,31a
1,52a 0,97b
1,54a 5,99
6,02 BAP
0,1 mgl
0,76 0,77
0,87cd 1,08b
0,71b 1,15ab
4,91 5,58
AMS 0,71
0,71 0,71d
0,71c 0,71ab
0,71b 0,71
0,71
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Kecenderungan yang sama terlihat pula pada parameter jumlah buku, jumlah daun, dan tinggi tunas. Data pengaruh isolat TD-J
2
terhadap jumlah buku, jumlah daun, dan tinggi tunas pada kultur nilam berturut-turut disajikan pada
Tabel 6, Tabel 7, dan Tabel 8. Tabel 6. Pengaruh Isolat TD-J
2
terhadap Jumlah Buku Tanaman Nilam
Perlakuan Media
Minggu Setelah Tanam MST 1
2 3
4 5
6 7
8 TD-J
2
1.22 1.30
1.47bcd 1.58bc
1.84ab 2.10ab
2.09abc 2.44ab
10 1.22
1.26 1.64abc
1.79ab 1.77bc
2.56a 2.78ab
2.68ab 20
1.22 1.33
1.72ab 1.89ab
2.50a 2.68a
3.21a 3.37a
30 1.22
1.30 1.87a
2.17a 1.10cd
2.30a 2.45ab
2.75ab BAP
0,1 mgl
1.22 1.24
1.33cd 1.46bc
0.97d 1.66ab
1.56bc 1.65bc
AMS 1.22
1.22 1.22a
1.22d 1.22c
0.71d 1.09b
1.05c
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Tabel 7. Pengaruh Isolat TD-J
2
terhadap Jumlah Daun Tanaman Nilam
Perlakuan Media
Minggu Setelah Tanam MST 1
2 3
4 5
6 7
8 TD- J
2
1.58 1.70
1.95bc 2.11bcd
2.50ab 3.05ab
3.16ab 3.20ab
10 1.58
1.63 2.20ab
2.44abc 2.40ab
3.55ab 3.87ab
4.01ab 20
1.58 1.75
2.22ab 2.60ab
3.46a 3.95a
4.58a 4.71a
30 1.58
1.68 2.55a
2.99a 1.35bc
3.90a 4.31a
4.40ab BAP
0,1 mgl
1.58 1.61
1.74bc 1.94cd
1.14c 2.55bc
2.77bc 2.85bc
AMS 1.58
1.58 1.58c
1.58d 0.71c
1.58c 1.58c
1.58c
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Tabel 8. Pengaruh Isolat TD-J
2
terhadap Tinggi Tunas Tanaman Nilam
Perlakuan Media
Minggu Setelah Tanam MST 1
2 3
4 5
6 7
8 TD- J
2
0.71 0.72
0.74bc 0.76b
0.87ab 0.99ab
1.08a 1.14a
10 0.71
0.72 0.74bc
0.78ab 0.79c
0.94ab 0.97a
1.04ab 20
0.71 0.72
0.77ab 0.81ab
0.93a 1.03a
1.09a 1.16a
30 0.71
0.72 0.79a
1.02a 0.75d
1.01ab 1.06a
1.07a BAP
0,1 mgl
0.71 0.72
0.73bc 0.76b
0.71e 0.82bc
0.85ab 0.91ab
AMS 0.71
0.71 0.71c
0.71b 0.71e
0.71c 0.71b
0.71b
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Madhaiyan 2006b melaporkan bahwa selain dapat mensintesis hormon pertumbuhan,
Methylobacterium spp.
dapat pula
mensintesa 1-
Aminocyclopropane-1-Carboxylate ACC deaminase. ACC deaminase berperan menurunkan level etilen dengan cara mendegradasi ACC, prekursor hormon etilen
Husen, Wahyudi, Suwanto, dan Saraswati 2009. Hormon etilen berperan dalam menghambat pemanjangan batang dan daun Salisbury dan Cleon 1995. Adanya
ACC deaminase yang dihasilkan oleh bakteri PPFMs ini dapat meniadakan efek etilen tersebut sehingga dapat memacu pemanjangan batang dan daun tanaman.
Lemus et al. 2009 melaporkan bahwa ACC deaminse yang dihasilkan oleh Burkholderia sp. dapat mempengaruhi level etilen serta memiliki peran
penting dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman tomat. ACC deaminase juga berkontribusi terhadap pertumbuhan tanaman pada lingkungan yang kurang
menguntungkan bagi tanaman. Pada tanaman jagung yang di tanam pada kondisi salinitas tinggi, ACC deaminase dapat meningkatkan panjang akar sampai 3,3
kali lipat, tinggi tunas sampai 2,3 kali lipat serta bobot basah sampai 1,13 kali dibandingkan kontrol Kausar dan Shahzad 2006.
Penambahan 20 TD-J
2
pada awal pengkulturan tidak begitu memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan nilam sedangkan pada 5 MST sampai 8 MST
memberikan pengaruh yang cukup kuat sehingga terjadi peningkatan pertumbuhan eksplan. Penambahan 30 TD-J
2
memacu pertumbuhan eksplan nilam pada awal pengkulturan, akan tetapi cenderung konstan setelah 4 MST. Hal
ini terjadi pada semua parameter pertumbuhan tajuk yang diamati antara lain jumlah tunas, buku, dan daun serta tinggi tunas. Data pengaruh konsentrasi 20
dan 30 TD-J
2
terhadap jumlah tunas, jumlah buku, dan jumlah daun serta tinggi tunas berturut-turut disajikan pada Tabel 5, Tabel 6, Tabel 7, dan Tabel 8.
Faktor yang mengakibatkan kondisi tersebut diduga karena ketersediaan unsur hara siap pakai pada kedua media tersebut berbeda. Perbedaan ketersediaan
unsur hara siap pakai ini dipengaruhi oleh perbedaan konsentrasi isolat TD-J
2
yang ditambahkan. Penambahan isolat yang lebih banyak mengakibatkan unsur hara siap pakai menjadi lebih banyak pula pada awal pengkulturan. Hara siap
pakai ini berasal dari hasil metabolisme bakteri pada saat inokulasi dalam media AMS berupa hormon tumbuhan dan vitamin, maupun unsur hara dalam sel bakteri
yang kemudian terlepas pada saat bakteri mati di dalam otoklaf dalam bentuk ion- ion, serta hara yang berasal dari media inokulasi bakteri media AMS.
Tanaman memanfaatkan dengan cepat unsur hara yang siap pakai tersebut untuk keperluan pertumbuhannya membentuk tajuk tunas, batang dan daun
sampai 4 MST. Ketersediaan hara siap pakai tersebut berkurang bahkan mungkin tidak tersedia, maka respon pertumbuhan yang terjadi lebih lambat atau cenderung
konstan pada 5 MST sampai 8 MST dibandingkan pada awal pengkulturan. Fase pertumbuhan konstan ini adalah masa dimana tanaman sedang mengaktifkan
enzim-enzim tertentu yang berfungsi dalam proses katabolisme hara yang tersedia pada media tanam atau media tempat tumbuh tanaman tersebut yaitu media MS.
Persentase Kultur Berkalus
Pada parameter persentase kultur berkalus, penambahan strain TD-J
2
tidak berpengaruh nyata dalam meningkatkan persentase kultur berkalus. Persentase
kultur berkalus tertinggi terdapat pada media MS+BAP 0,1 mgl yaitu sekitar 6 luasan media pada akhir pengamatan. Data pengaruh strain TD-J
2
terhadap persentase jumlah kultur berkalus disajikan pada Tabel 13. Kalus tetap terbentuk
pada media dengan penambahan isolat 10, 20, dan 30 meskipun jumlahnya rendah, lebih rendah dari media MS yang tanpa ditambahkan isolat ataupun zat
pengatur tumbuh sintetik sekalipun.
Tabel 9. Pengaruh TD-J
2
terhadap Persentase Kultur Berkalus Tanaman Nilam
Perlakuan Media
Minggu Setelah Tanam MST 1
2 3
4 5
6 7
8 TD-J
2
0,71 0,94
1,41 1,41
2,62 3,15ab
5,24a 5,71a
10 0,71
0,94 1,07
1,06 0,71
2,84abc 3,87ab
4,26ab 20
0,71 0,71
1,18 1,26
0,71 1,87abc
3,77ab 4,29ab
30 0,71
0,71 0,71
0,71 0,71
0,94bc 2,99ab
3,31b BAP
0,1 mgl 0,71
0,71 1,58
1,87 3,02
3,38a 5,43a
6,00a AMS
0,71 0,71
0,71 1,18
0,71 0,71c
1,82c 0,71c
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5; Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Penambahan isolat TD-J
2
kedalam media kultur tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan kalus tanaman nilam dalam kultur in vitro. Hal ini diduga
karena rasio auksin terhadap sitokonin yang disintesis Methylobacterium spp. strain TD-J
2
ini belum cukup untuk memacu pertumbuhan kalus.
Widajati et al. 2008 melaporkan bahwa Methylobacterium spp. strain TD-J
2
mensintesis IAA 2,08 ppm termasuk ke dalam kategori rendah dan mensintesis sitokinin trans-zeatin 89,21 ppm termasuk ke dalam kategori tinggi, sehingga
rasio auksin terhadap sitokinin yang dihasilkan strain TD-J
2
rendah. Padahal untuk memacu pembentukan kalus dibutuhkan rasio auksin terhadap sitokininnya
yang tinggi. Wattimena 1991 melaporkan bahwa untuk tujuan pembentukan dan atau produksi kalus, eksplan tanaman terpilih dikulturkan dalam media yang
ditambahkan auksin dengan konsentrasi relatif tinggi dengan atau tanpa sitokinin. Persentase kultur berkalus paling tinggi terdapat pada media MS+BAP 0,1
mgl. Hal ini diduga karena BAP 0,1 mgl adalah golongan sitokinin yang dapat mendorong pembelahan sel Wattimena 1991 sehingga terbentuk kalus dalam
jumlah lebih banyak dibandingkan pada media lainnya. Kalus yang terbentuk berwarna putih kehijauan, diduga sebagai kalus semu yang akan berkembang
menjadi tunas, karena diketahu bahwa media MS+BAP 0,1 mgl merupakan media yang biasa digunakan untuk tujuan multiplikasi tunas nilam Hayati 1992;
Mapriti 1997.
Jumlah dan Panjang Akar
Pada akhir pengamatan hasil sidik ragam menunjukkan bahwa jumlah akar tertinggi dihasilkan oleh media MS, tanpa penambahan isolat bakteri maupun zat
pengatur tumbuh. Data pengaruh strain TD-J
2
terhadap jumlah akar disajikan pada Tabel 14.
Tabel 10. Pengaruh Strain TD-J
2
terhadap Jumlah Akar Tanaman Nilam pada 8 MST
Perlakuan Media Jumlah Akar
TD-J
2
4.72a 10
4.33a 20
4.33a 30
4.06a BAP
0,1mgl 1.38b
AMS 0.71b
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Penambahan isolat TD-J
2
tidak memberikan pengaruh nyata dalam menginduksi akar pada kultur nilam meskipun masih lebih baik dibandingkan
media kontrol MS+BAP 0,1 mgl. Begitu pula dengan parameter panjang akar, penambahan Methylobacterium spp. strain TD-J
2
10, 20, dan 30 tidak memberikan pengaruh nyata. Panjang akar tertinggi diberikan oleh perlakuan
media MS mulai dari awal sampai akhir pengamatan. Data pengaruh strain TD-J
2
terhadap panjang akar disajikan pada Tabel 15. Tabel 11. Pengaruh Strain TD-J
2
terhadap Panjang Akar Tanaman Nilam
Perlakuan Media Panjang Akar cm
TD-J
2
0.86a 10
0.81ab 20
0.80ab 30
0.78b BAP
0,1mgl 0.71c
AMS 0.71c
Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5.
Penambahan isolat TD-J
2
tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap pembentukan akar tanaman nilam dalam kultur in vitro. Hal ini diduga disebabkan
oleh dua faktor. Faktor yang pertama adalah karena auksin yang dihasilkan oleh isolat bakteri tidak cukup kuat untuk menginduksi akar. Salah satu cara untuk
menginduksi pertumbuhan akar adalah dengan menambahkan ZPT jenis auksin Jhon 1983; Salisbury dan Cleon 1995. Auksin yang dihasilkan oleh strain TD-J
2
rendah dan sitokinin tinggi, sehingga rasio auksin terhadap sitokininnya menjadi lebih rendah dan tidak mampu menginduksi pertumbuhan akar dengan baik.
Faktor yang kedua adalah karena Methylobacterium spp. mensintesis senyawa-senyawa lain disamping auksin dan sitokinin diantaranya vitamin B
12
Sy et al. 2005, enzim, dan senyawa lainnya yang belum diketahui, sehingga komposisi pada media dengan penambahan isolat bakteri menjadi lebih kompleks.
Komposisi media yang kompleks memungkinkan adanya efek saling meniadakan atau saling menekan antara senyawa satu dengan senyawa lainnya sehingga tidak
dapat menginduksi perakaran tanaman nilam dalam kultur in vitro. Penelitian terdahulu melaporkan bahwa untuk menginduksi pertumbuhan akar diperlukan
media dengan unsur hara yang minimum. Hayati 1992 melaporkan bahwa untuk induksi perakaran nilam, media MS 0,5 hara makro tanpa ZPT adalah yang
terbaik. Media MS+BAP 0,1 mgl adalah media yang menghasilkan akar terendah
setelah media AMS. Benzyl amino purine BAP adalah sitokinin yang salah satu fungsinya adalah menghambat pembentukan akar Torres 1957 sehingga akar
yang terbentuk pada media tersebut rendah, sedangkan pada media AMS tidak terjadi pertumbuhan akar karena salah satu komponen media AMS adalah 1
methanol yang bersifat racun terhadap tanaman dan menghambat penyerapan hara
oleh tanaman. Tanaman nilam pada media AMS mengalami kelayuan sejak minggu pertama setelah tanam, dan mengalami kematian di minggu berikutnya.
Penambahan isolat Methylobacterium spp. strain TD-J
2
ke dalam media kultur mengakibatkan penampakan tanaman nilam dalam kultur in vitro menjadi
lebih hijau serta memiliki daun yang lebih tebal dan kokoh. Hal ini terjadi karena Methylobacterium
spp. menghasilkan beberapa enzim. Madhaiyan 2006b melaporkan bahwa bakteri ini mampu mensintesa 1-Aminocyclopropane-1-
Carboxylate ACC deaminase. ACC deaminase yang berperan menurunkan level etilen dengan cara mendegradasi ACC, prekursor hormon etilen Husen et al.
2009. Etilen dapat menginduksi penuaan pada bunga. Sebagaimana pada buah, apabila sel daun mahkota menjadi peka terhadap
etilen, daun mahkota tersebut memberikan respon dengan meningkatkan hasil etilen autokatalitik secara tiba-tiba saat ACC sintase terinduksi Borochov dan
Woodson 1988 in Salisbury dan Cleon 1995 dan segera saja daun mahkota mulai melayu akibat meningkatnya permeabilitas membran plasma dan tonoplas, yang
diikuti dengan hilangnya linarut dan kemudian air menuju dinding sel, dan ruang antar sel Salisbury dan Cleon 1995. Maka dari itu, dengan adanya ACC
deaminase yang dihasilkan oleh Methylobacterium spp. ini dapat menjadikan tanaman bugar dan tidak cepat mengalami penuaan. Belimov et al. 2001 dalam
Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah 2010 melaporkan bahwa bakteri ACC deaminase mampu memelihara kebugaran tanaman pada tanah
tercemar logam berat.
B. Strain TD-J