Pembuatan media AMS Padat

digital pH meter sampai mencapai pH 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 999 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media, kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit. Langkah ketiga adalah menambahkan zeatin yang sudah dilarutkan dan dibuat stok dengan dosis uptake 1 mlliter serta sudah disterilisasi sebanyak 1 ml kedalam media MS steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan memadat dalam labu erlenmeyer. Larutan media dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama yaitu sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10 TD-J 7 ini kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat.

D. Pembuatan media AMS Padat

Langkah-langkah pembuatan media AMS padat adalah dengan cara menimbang bahan-bahan media AMS dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Komposisi media AMS disajikan pada Lampiran 4. Bahan-bahan ini dilarutkan dengan menggunakan pelarut berupa aquades steril sebanyak 700 ml. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai semua bahan benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran pH menggunakan digital pH meter sampai mencapai pH 7. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 1000 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang telah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi menggunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. Percobaan III. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Auksin TD-J 10 untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Media kontrol pada Percobaan III terdiri dari media MS, MS+IAA 0,1 mgl, media MS+NAA 0,1 mgl, dan media AMS padat. Langkah-langkah pembuatan media MS dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin A. Langkah-langkah pembuatan media MS+IAA 0,1 mgl dan media MS+NAA 0,1 mgl dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin B. Langkah-langkah pembuatan media AMS padat dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan II poin D. Penanaman Eksplan Penanaman dilakukan didalam laminar air flow cabinet steril, eksplan ditanam ke dalam botol yang berisi media perlakuan, kemudian tepi botol dipanaskan pada api bunsen dan ditutup dengan aluminium foil dan di seal dengan plastik wrap. Botol kultur yang berisi eksplan perlakuan disimpan dalam rak kultur yang kondisi lingkungannya homogen sehingga diharapkan keragaman yang muncul benar-benar disebabkan oleh faktor perlakuan. Pemeliharaan Inkubasi diruang kultur pada kondisi terang dengan cahaya lampu TL 40 watt 1000 lux 16 jam per hari, temperatur 21-25 o C. Eksplan yang terkontaminasi langsung dikeluarkan agar tidak menyebar. Penyemprotan alkohol 70 dilakukan secara rutin pada botol kultur setiap hari untuk mencegah kontaminasi. Pengamatan Pengamatan akan dilakukan setiap minggu mulai dari 0 MST sampai 8 MST dengan parameter yang diamati sebagai berikut : 1. Jumlah tunas 2. Jumlah buku 3. Jumlah daun 4. Tinggi tunas 5. Waktu inisiasi tunas 6. Waktu inisiasi akar 7. Panjang akar 8. Jumlah akar 9. Ada atau tidak ada kalus terbentuk 10. Tingkat kontaminasi. HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman nilam Aceh steril koleksi Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BSJ, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian BB-Biogen Bogor. Bahan tanaman ini telah mengalami mutasi yang diinduksi oleh mutagen fisik berupa sinar gamma 5 Gy, 10 Gy, 15 Gy, dan 20 Gy. Hasil dari radiasi ini berupa mutan yang tahan terhadap cekaman kekeringan. Mutan ini telah distabilkan dengan cara disubkultur terus-menerus pada media MS setiap 3 bulan sekali selama 1 tahun sebelum akhirnya digunakan pada penelitian ini. Eksplan tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan I dan II adalah tunas satu buku sepanjang 2 cm. Sketsa gambar eksplan yang digunakan pada Percobaan I dan II disajikan pada Lampiran 6. Eksplan tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan III adalah tunas tiga buku tanpa menghilangkan pucuk sepanjang 4 cm. Sketsa gambar eksplan yang digunakan pada Percobaan III disajikan pada Lampiran 6. Persentase pertumbuhan dari semua eksplan yang ditanam sebesar 88. Kontaminasi sebesar 12 diduga karena selama proses penanaman yang kurang terjaga sterilitasnya. Kultur disimpan di dalam ruang kultur dengan penyinaran lampu TL 40 watt 1000 lux dan suhu 21-25 C. Pada awal pengkulturan, hampir semua tanaman yang dikulturkan belum memperlihatkan respon pertumbuhan, baik pada media kontrol maupun media dengan penambahan isolat. Pada media dengan penamabahan isolat, beberapa biakan menunjukkan kelayuan, hal ini terjadi karena masih adanya pengaruh methanol yang ditambahkan pada media kultur bakteri yang menghambat penyerapan hara sehingga menimbulkan kelayuan pada kultur. Kelayuan ini tidak berlangsung lama, hanya pada satu minggu setelah tanam. Tanaman kembali terlihat segar dan memperlihatkan adanya pertumbuhan pada minggu berikutnya yaitu pada dua minggu setelah tanam. Hasil sidik ragam pengaruh perlakuan Methylobacterium spp. terhadap pertumbuhan kultur nilam disajikan pada Lampiran 8 sampai Lampiran 28 dan rekapitulasinya pada Tabel 2. Tabel 2. Rekapitulasi Sidik Ragam Peubah yang Diamati pada Pertumbuhan Bibit Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro No Peubah [Hasil Transformasi √x+0,5] Umur Tanaman MST 1 2 3 4 5 6 7 8 Percobaan IIA. Pengujian Strain TD-J 2 untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro 1 Jumlah Tunas tn tn tn tn 2 Jumlah Buku tn tn 3 Jumlah Daun tn tn 4 Tinggi Tunas tn tn tn tn 5 Jumlah Kalus tn tn tn tn tn tn 6 Jumlah Akar tn tn tn tn 7 Panjang Akar tn tn tn tn tn Percobaan IIB. Pengujian Strain TD-J 7 untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro 1 Jumlah Tunas L L tn 2 Jumlah Buku tn L L tn 3 Jumlah Daun tn L L 4 Tinggi Tunas tn tn tn L L 5 Jumlah Kalus tn tn tn L L 6 Jumlah Akar tn tn L L 7 Panjang Akar tn tn L L Percobaan III. Pengujian Strain TD-J 10 untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro 1 Jumlah Tunas tn tn tn tn tn tn tn tn 2 Jumlah Buku tn tn tn 3 Jumlah Daun tn tn tn 4 Tinggi Tunas tn tn tn tn tn tn tn tn 5 Jumlah Kalus tn tn tn 6 Jumlah Akar tn tn tn tn 7 Panjang Akar tn tn tn Keterangan : tn : Tidak berpengaruh nyata pada uji F taraf 5 : Berpengaruh nyata pada uji F taraf 5 : Berpengaruh sangat nyata pada uji F taraf 1 MST : Minggu Setelah Tanam L : Tidak ada data karena tidak dilakukan pengamatan yang bertepatan dengan hari libur nasional. Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat Methylobacterium spp. untuk Kultur In Vitro Tanaman Nilam Eskplan nilam yang digunakan adalah tunas batang satu buku. Media yang digunakan adalah media MS serta media MS+BAP, MS+NAA, dan MS+IAA pada konsentrasi 0,1 mgl sebagai kontrol. Strain TD-L 2 dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 vv media kultur ditambahkan kedalam media MS untuk melihat aktifitas isolat bakteri Methylobacterium spp. pada kultur in vitro. Perlakuan teknik sterilisasi isolat bakteri terdiri dari tiga taraf. Taraf pertama dengan menggunakan filter milipore ukuran 0,22 µm. Taraf kedua dengan menggunakan filter kemudian menggunakan otoklaf. Taraf ketiga dengan menggunakan otoklaf. Pengamatan dilakukan pada respon pertumbuhan nilam yaitu jumlah dan tinggi tunas, jumlah buku, jumlah daun, jumlah dan panjang akar, serta pembentukan kalus. Tabel 3. Pengaruh Teknik Sterilisasi Isolat TD-L 2 terhadap Persentase Kontaminasi Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Perlakuan Teknik Sterilisasi Konsentrasi Isolat TD-L 2 Kontrol 10 20 30 40 50 BAP IAA NAA Pada 1 Minggu Setelah Tanam F 50 25 75 75 100 - - - F+O 25 - - - O Mati 25 Pada 4 Minggu Setelah Tanam F 50 25 100 100 100 - - - F+O 25 Mati 100 - - - O Mati 25 Keterangan : F = Filter; F+O = Filter kemudian otoklaf, dan O = Otoklaf. Hasil percobaan I menunjukkan bahwa media yang ditambahkan bakteri yang disterilisasi menggunakan otoklaf menghasilkan media steril tertinggi yaitu 93,75. Media yang disterilisasi menggunakan filter kemudian otoklaf menunjukkan hasil 68,78 media steril dan 31,25 terkontaminasi. Sedangkan media yang disterilisasi menggunakan filter menghasilkan 25 media steril dan 75 media terkontaminasi. Teknik sterilisasi dengan menggunakan filter memperlihatkan resiko kontaminasi yang tinggi dibandingkan sterilisasi dengan menggunakan otoklaf. Sterilisasi dengan menggunakan filter menunjukkan hasil yang baik hanya pada penambahan isolat sampai konsentrasi 20. Penambahan isolat dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari 20 mengalami kontaminasi. Data pengaruh teknik sterilisasi terhadap persentase kontaminasi eksplan pada 1 MST dan 4 MST disajikan pada Tabel 3. Hal ini diduga disebabkan oleh semakin tinggi konsentrasi isolat yang ditambahkan ke dalam media, semakin tinggi pula jumlah kontaminan dari lingkungan yang terakumulasi pada saat proses filterisasi sehingga menyebabkan terjadinya kontaminasi. Media MS+10 TD-L 2 yang di sterilisasi menggunakan otoklaf memberikan respon pertumbuhan tanaman nilam yang lebih baik dibandingkan media yang sama yang di sterilisasi menggunakan filter maupun menggunakan filter kemudian menggunakan otoklaf. Parameter jumlah tunas, jumlah buku dan jumlah daun memberikan respon yang lebih baik dibandingkan parameter lainnya pada media MS+10 TD-L 2 yang disterilisasi menggunakan otoklaf. Data respon pertumbuhan tanaman nilam terhadap media dengan penambahan isolat TD-L 2 dengan teknik sterilisasi yang berbeda disajikan pada Tabel 4. Hal ini membuktikan bahwa hormon tumbuhan, vitamin dan senyawa lainnya yang disintesis bakteri dalam crude isolat Methylobacterium sp strain TD-L 2 masih terlihat aktifitasnya meskipun isolat mengalami pemanasan dalam otoklaf. Perlakuan media dengan penambahan isolat ini pengaruhnya tidak lebih baik dibandingkan dengan media kontrol MS+BAP 0,1 mgl dalam memacu pertumbuhan tajuk tanaman. Hal ini diduga karena selain sitokinin, TD-L 2 dapat pula mensintesis auksin. Widajati, Salma, Kosmiatin, Pratiwi, dan Rahayu 2008 melaporkan bahwa strain TD-L 2 mampu mensintesis auksin IAA 12,68 ppm termasuk katagori tinggi, GA 98,36 ppm katagori sedang, serta sitokinin trans- zeatin 49,74 ppm katagori sedang. Adanya aktifitas auksin yang mempengaruhi pertumbuhan kultur nilam ini dapat dilihat dari parameter akar tanaman, karena salah satu fungsi auksin adalah menginisiasi pertumbuhan akar utama Torres 1957, memacu pemanjangan sel-sel akar dalam konsentrasi sangat rendah Audus 1972, Bioma 2008, serta memacu pertumbuhan akar dari stek Kormondy et al. 1977 in Salisbury dan Cleon 1995. Pada penelitian ini terlihat bahwa pada media Filter 10 TD-L 2 , Filter+otoklaf 10 TD-L 2 , dan media Otoklaf 10 TD-L 2 dapat memacu pembentukan akar lebih baik dibandingkan media kontrol MS+IAA 0,1 mgl maupun MS+NAA 0,1 mgl. Data respon pertumbuhan eksplan nilam terhadap media dengan penambahan isolat Methylobacterium spp. strain TD-L 2 pada 4 MST disajikan pada Tabel 4. Hasil ini mendukung hasil penelitian sebelumnya bahwa Methylobacterium spp. dapat meningkatkan jumlah tunas dan jumlah akar tanaman bunga matahari dalam kultur in vitro Koopmann dan Kutschera 2005. Tabel 4. Respon Pertumbuhan Tanaman Nilam terhadap Media dengan Penambahan Isolat Methylobacterium spp. Strain TD-L 2 pada 4 MST Media Rata-rata Jumlah Tunas Rata-rata Tinggi tunas cm Rata-rata Jumlah Buku Rata-rata Jumlah Daun Akar Kalus MS+BAP 0,1 mgl 14,30 0,40 12,10 3,40 - - MS+IAA 0,1 mgl 3,70 0,30 6,70 3,60 + ++ MS+NAA 0,1 mgl 7,30 0,30 8,30 12,00 - ++ Filter 10 TD-L 2 1,30 0,30 2,20 4,00 +++ + 20 TD-L 2 0,20 0,10 1,00 2,80 - - 30 TD-L 2 Kontaminasi 40 TD-L 2 Kontaminasi 50 TD-L 2 Kontaminasi Filter + Otoklaf 10 TD-L 2 1,10 0,40 2,30 5,30 ++ ++ 20 TD-L 2 2,50 0,60 5,30 0,50 - + 30 TD-L 2 0,60 0,10 0,60 2,00 - + 40 TD-L 2 - - - - - ++ 50 TD-L 2 Kontaminasi Otoklaf 10 TD-L 2 3,30 0,20 4,70 10,30 + + 20 TD-L 2 - - - - - + 30 TD-L 2 1,00 0,10 1,00 1,30 - ++ 40 TD-L 2 0,75 0,20 1,00 2,00 ++ + 50 TD-L 2 1,00 0,20 1,00 2,00 - + Keterangan : + pada kolom Akar = Skor persentase luasan media yang ditumbuhi Akar. + pada kolom Kalus = Skor persentase luasan media yang ditumbuhi kalus Berdasarkan hasil percobaan ini bahwa teknik sterilisasi isolat menggunakan otoklaf memiliki resiko kontaminasi yang kecil dan lebih ekonomis maka pengujian isolat beberapa strain Methylobacterium spp. pada percobaan II dan III dilakukan dengan teknik sterilisasi otoklaf kecuali untuk strain TD-J 7 . Strain TD-J 7 ini merupakan salah satu strain yang menghasilkan trans-zeatin tinggi. Pada percobaan IIB strain TD-J 7 dibandingkan dengan zeatin sintetik. Zeatin sintetik ini diketahui akan mengalami kerusakan jika disterilisasi menggunakan otoklaf, maka dari itu pada percobaan IIB sterilisasi strain TD-J 7 tidak menggunakan otoklaf tetapi menggunakan filter. Konsentrasi penambahan isolat juga hanya dilakukan pada konsentrasi 0, 10, 20, dan 30 vv media karena dengan konsentrasi 10 saja sudah memperlihatkan adanya aktifitas hormon tumbuhan yang disintesis oleh Methylobacterium spp. Percobaan II. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Sitokinin TD-J 2 dan TD-J 7 untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro A. Strain TD-J 2 Jumlah Tunas Tunas yang muncul dihitung saat tunas telah mencapai tinggi 1 mm. Tunas yang dihitung meliputi tunas aksilar dan tunas adventif. Hasil sidik ragam menunjukkan bahwa TD-J 2 memberikan pengaruh nyata terhadap jumlah tunas. Data pengaruh isolat Methylobacterium spp. strain TD-J 2 disajikan pada Tabel 5. Perlakuan media MS+30 TD-J 2 memberikan hasil terbaik dengan rata-rata jumlah tunas tertinggi pada 3 MST dan 4 MST adalah 1,31 dan 1,52, sedangkan pada 5 MST sampai 8 MST, media MS+20 TD-J 2 memberikan hasil terbaik dengan rata-rata jumlah tunas tertinggi 6,55 tunas pada 8 MST. Penambahan 20 dan 30 Methylobacterium spp. strain TD-J 2 ini menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan perlakuan lainnya bahkan lebih baik dibandingkan dengan perlakuan media MS+0,1 mgl BAP yang selama ini diketahui sebagai media terbaik untuk perbanyakan tunas nilam dalam kultur in vitro . Hal ini diduga karena bakteri ini mampu menghasilkan beberapa vitamin dan antioksidan disamping kemampuannya menghasilkan sitokinin dan auksin. Sy et al. 2005 melaporkan bahwa Methylobacterium spp. memproduksi vitamin B 12 yang dapat memacu perkembangan tanaman. He et al. 2003 juga melaporkan bahwa bakteri ini memproduksi pyrroloquinoline quinon PQQ dengan karakteristik sebagai antioksidan yang dapat mengurangi kematian sel sehingga tanaman dapat tumbuh lebih baik. Methylobacterium spp. dilaporkan dapat pula mensintesa berbagai enzim yang berperan dalam mengaktifasi metabolisme yang terjadi pada tanaman. Tabel 5. Pengaruh Isolat TD-J 2 terhadap Jumlah Tunas Tanaman Nilam Perlakuan Media Minggu Setelah Tanam MST 1 2 3 4 5 6 7 8 TD-J 2 0,71 0,78 0,95bcd 1,04b 1,16ab 1,36a 6,08 5,90 10 0,76 0,81 1,14abc 1,26ab 1,11ab 1,58a 5,38 5,51 20 0,71 0,87 1,20ab 1,29ab 1,65a 1,63a 6,09 6,55 30 0,71 0,89 1,31a 1,52a 0,97b 1,54a 5,99 6,02 BAP 0,1 mgl 0,76 0,77 0,87cd 1,08b 0,71b 1,15ab 4,91 5,58 AMS 0,71 0,71 0,71d 0,71c 0,71ab 0,71b 0,71 0,71 Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Kecenderungan yang sama terlihat pula pada parameter jumlah buku, jumlah daun, dan tinggi tunas. Data pengaruh isolat TD-J 2 terhadap jumlah buku, jumlah daun, dan tinggi tunas pada kultur nilam berturut-turut disajikan pada Tabel 6, Tabel 7, dan Tabel 8. Tabel 6. Pengaruh Isolat TD-J 2 terhadap Jumlah Buku Tanaman Nilam Perlakuan Media Minggu Setelah Tanam MST 1 2 3 4 5 6 7 8 TD-J 2 1.22 1.30 1.47bcd 1.58bc 1.84ab 2.10ab 2.09abc 2.44ab 10 1.22 1.26 1.64abc 1.79ab 1.77bc 2.56a 2.78ab 2.68ab 20 1.22 1.33 1.72ab 1.89ab 2.50a 2.68a 3.21a 3.37a 30 1.22 1.30 1.87a 2.17a 1.10cd 2.30a 2.45ab 2.75ab BAP 0,1 mgl 1.22 1.24 1.33cd 1.46bc 0.97d 1.66ab 1.56bc 1.65bc AMS 1.22 1.22 1.22a 1.22d 1.22c 0.71d 1.09b 1.05c Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Tabel 7. Pengaruh Isolat TD-J 2 terhadap Jumlah Daun Tanaman Nilam Perlakuan Media Minggu Setelah Tanam MST 1 2 3 4 5 6 7 8 TD- J 2 1.58 1.70 1.95bc 2.11bcd 2.50ab 3.05ab 3.16ab 3.20ab 10 1.58 1.63 2.20ab 2.44abc 2.40ab 3.55ab 3.87ab 4.01ab 20 1.58 1.75 2.22ab 2.60ab 3.46a 3.95a 4.58a 4.71a 30 1.58 1.68 2.55a 2.99a 1.35bc 3.90a 4.31a 4.40ab BAP 0,1 mgl 1.58 1.61 1.74bc 1.94cd 1.14c 2.55bc 2.77bc 2.85bc AMS 1.58 1.58 1.58c 1.58d 0.71c 1.58c 1.58c 1.58c Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Tabel 8. Pengaruh Isolat TD-J 2 terhadap Tinggi Tunas Tanaman Nilam Perlakuan Media Minggu Setelah Tanam MST 1 2 3 4 5 6 7 8 TD- J 2 0.71 0.72 0.74bc 0.76b 0.87ab 0.99ab 1.08a 1.14a 10 0.71 0.72 0.74bc 0.78ab 0.79c 0.94ab 0.97a 1.04ab 20 0.71 0.72 0.77ab 0.81ab 0.93a 1.03a 1.09a 1.16a 30 0.71 0.72 0.79a 1.02a 0.75d 1.01ab 1.06a 1.07a BAP 0,1 mgl 0.71 0.72 0.73bc 0.76b 0.71e 0.82bc 0.85ab 0.91ab AMS 0.71 0.71 0.71c 0.71b 0.71e 0.71c 0.71b 0.71b Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Madhaiyan 2006b melaporkan bahwa selain dapat mensintesis hormon pertumbuhan, Methylobacterium spp. dapat pula mensintesa 1- Aminocyclopropane-1-Carboxylate ACC deaminase. ACC deaminase berperan menurunkan level etilen dengan cara mendegradasi ACC, prekursor hormon etilen Husen, Wahyudi, Suwanto, dan Saraswati 2009. Hormon etilen berperan dalam menghambat pemanjangan batang dan daun Salisbury dan Cleon 1995. Adanya ACC deaminase yang dihasilkan oleh bakteri PPFMs ini dapat meniadakan efek etilen tersebut sehingga dapat memacu pemanjangan batang dan daun tanaman. Lemus et al. 2009 melaporkan bahwa ACC deaminse yang dihasilkan oleh Burkholderia sp. dapat mempengaruhi level etilen serta memiliki peran penting dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman tomat. ACC deaminase juga berkontribusi terhadap pertumbuhan tanaman pada lingkungan yang kurang menguntungkan bagi tanaman. Pada tanaman jagung yang di tanam pada kondisi salinitas tinggi, ACC deaminase dapat meningkatkan panjang akar sampai 3,3 kali lipat, tinggi tunas sampai 2,3 kali lipat serta bobot basah sampai 1,13 kali dibandingkan kontrol Kausar dan Shahzad 2006. Penambahan 20 TD-J 2 pada awal pengkulturan tidak begitu memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan nilam sedangkan pada 5 MST sampai 8 MST memberikan pengaruh yang cukup kuat sehingga terjadi peningkatan pertumbuhan eksplan. Penambahan 30 TD-J 2 memacu pertumbuhan eksplan nilam pada awal pengkulturan, akan tetapi cenderung konstan setelah 4 MST. Hal ini terjadi pada semua parameter pertumbuhan tajuk yang diamati antara lain jumlah tunas, buku, dan daun serta tinggi tunas. Data pengaruh konsentrasi 20 dan 30 TD-J 2 terhadap jumlah tunas, jumlah buku, dan jumlah daun serta tinggi tunas berturut-turut disajikan pada Tabel 5, Tabel 6, Tabel 7, dan Tabel 8. Faktor yang mengakibatkan kondisi tersebut diduga karena ketersediaan unsur hara siap pakai pada kedua media tersebut berbeda. Perbedaan ketersediaan unsur hara siap pakai ini dipengaruhi oleh perbedaan konsentrasi isolat TD-J 2 yang ditambahkan. Penambahan isolat yang lebih banyak mengakibatkan unsur hara siap pakai menjadi lebih banyak pula pada awal pengkulturan. Hara siap pakai ini berasal dari hasil metabolisme bakteri pada saat inokulasi dalam media AMS berupa hormon tumbuhan dan vitamin, maupun unsur hara dalam sel bakteri yang kemudian terlepas pada saat bakteri mati di dalam otoklaf dalam bentuk ion- ion, serta hara yang berasal dari media inokulasi bakteri media AMS. Tanaman memanfaatkan dengan cepat unsur hara yang siap pakai tersebut untuk keperluan pertumbuhannya membentuk tajuk tunas, batang dan daun sampai 4 MST. Ketersediaan hara siap pakai tersebut berkurang bahkan mungkin tidak tersedia, maka respon pertumbuhan yang terjadi lebih lambat atau cenderung konstan pada 5 MST sampai 8 MST dibandingkan pada awal pengkulturan. Fase pertumbuhan konstan ini adalah masa dimana tanaman sedang mengaktifkan enzim-enzim tertentu yang berfungsi dalam proses katabolisme hara yang tersedia pada media tanam atau media tempat tumbuh tanaman tersebut yaitu media MS. Persentase Kultur Berkalus Pada parameter persentase kultur berkalus, penambahan strain TD-J 2 tidak berpengaruh nyata dalam meningkatkan persentase kultur berkalus. Persentase kultur berkalus tertinggi terdapat pada media MS+BAP 0,1 mgl yaitu sekitar 6 luasan media pada akhir pengamatan. Data pengaruh strain TD-J 2 terhadap persentase jumlah kultur berkalus disajikan pada Tabel 13. Kalus tetap terbentuk pada media dengan penambahan isolat 10, 20, dan 30 meskipun jumlahnya rendah, lebih rendah dari media MS yang tanpa ditambahkan isolat ataupun zat pengatur tumbuh sintetik sekalipun. Tabel 9. Pengaruh TD-J 2 terhadap Persentase Kultur Berkalus Tanaman Nilam Perlakuan Media Minggu Setelah Tanam MST 1 2 3 4 5 6 7 8 TD-J 2 0,71 0,94 1,41 1,41 2,62 3,15ab 5,24a 5,71a 10 0,71 0,94 1,07 1,06 0,71 2,84abc 3,87ab 4,26ab 20 0,71 0,71 1,18 1,26 0,71 1,87abc 3,77ab 4,29ab 30 0,71 0,71 0,71 0,71 0,71 0,94bc 2,99ab 3,31b BAP 0,1 mgl 0,71 0,71 1,58 1,87 3,02 3,38a 5,43a 6,00a AMS 0,71 0,71 0,71 1,18 0,71 0,71c 1,82c 0,71c Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5; Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Penambahan isolat TD-J 2 kedalam media kultur tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan kalus tanaman nilam dalam kultur in vitro. Hal ini diduga karena rasio auksin terhadap sitokonin yang disintesis Methylobacterium spp. strain TD-J 2 ini belum cukup untuk memacu pertumbuhan kalus. Widajati et al. 2008 melaporkan bahwa Methylobacterium spp. strain TD-J 2 mensintesis IAA 2,08 ppm termasuk ke dalam kategori rendah dan mensintesis sitokinin trans-zeatin 89,21 ppm termasuk ke dalam kategori tinggi, sehingga rasio auksin terhadap sitokinin yang dihasilkan strain TD-J 2 rendah. Padahal untuk memacu pembentukan kalus dibutuhkan rasio auksin terhadap sitokininnya yang tinggi. Wattimena 1991 melaporkan bahwa untuk tujuan pembentukan dan atau produksi kalus, eksplan tanaman terpilih dikulturkan dalam media yang ditambahkan auksin dengan konsentrasi relatif tinggi dengan atau tanpa sitokinin. Persentase kultur berkalus paling tinggi terdapat pada media MS+BAP 0,1 mgl. Hal ini diduga karena BAP 0,1 mgl adalah golongan sitokinin yang dapat mendorong pembelahan sel Wattimena 1991 sehingga terbentuk kalus dalam jumlah lebih banyak dibandingkan pada media lainnya. Kalus yang terbentuk berwarna putih kehijauan, diduga sebagai kalus semu yang akan berkembang menjadi tunas, karena diketahu bahwa media MS+BAP 0,1 mgl merupakan media yang biasa digunakan untuk tujuan multiplikasi tunas nilam Hayati 1992; Mapriti 1997. Jumlah dan Panjang Akar Pada akhir pengamatan hasil sidik ragam menunjukkan bahwa jumlah akar tertinggi dihasilkan oleh media MS, tanpa penambahan isolat bakteri maupun zat pengatur tumbuh. Data pengaruh strain TD-J 2 terhadap jumlah akar disajikan pada Tabel 14. Tabel 10. Pengaruh Strain TD-J 2 terhadap Jumlah Akar Tanaman Nilam pada 8 MST Perlakuan Media Jumlah Akar TD-J 2 4.72a 10 4.33a 20 4.33a 30 4.06a BAP 0,1mgl 1.38b AMS 0.71b Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Penambahan isolat TD-J 2 tidak memberikan pengaruh nyata dalam menginduksi akar pada kultur nilam meskipun masih lebih baik dibandingkan media kontrol MS+BAP 0,1 mgl. Begitu pula dengan parameter panjang akar, penambahan Methylobacterium spp. strain TD-J 2 10, 20, dan 30 tidak memberikan pengaruh nyata. Panjang akar tertinggi diberikan oleh perlakuan media MS mulai dari awal sampai akhir pengamatan. Data pengaruh strain TD-J 2 terhadap panjang akar disajikan pada Tabel 15. Tabel 11. Pengaruh Strain TD-J 2 terhadap Panjang Akar Tanaman Nilam Perlakuan Media Panjang Akar cm TD-J 2 0.86a 10 0.81ab 20 0.80ab 30 0.78b BAP 0,1mgl 0.71c AMS 0.71c Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata pada uji DMRT 5. Data merupakan hasil Transformasi √ x+0,5. Penambahan isolat TD-J 2 tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap pembentukan akar tanaman nilam dalam kultur in vitro. Hal ini diduga disebabkan oleh dua faktor. Faktor yang pertama adalah karena auksin yang dihasilkan oleh isolat bakteri tidak cukup kuat untuk menginduksi akar. Salah satu cara untuk menginduksi pertumbuhan akar adalah dengan menambahkan ZPT jenis auksin Jhon 1983; Salisbury dan Cleon 1995. Auksin yang dihasilkan oleh strain TD-J 2 rendah dan sitokinin tinggi, sehingga rasio auksin terhadap sitokininnya menjadi lebih rendah dan tidak mampu menginduksi pertumbuhan akar dengan baik. Faktor yang kedua adalah karena Methylobacterium spp. mensintesis senyawa-senyawa lain disamping auksin dan sitokinin diantaranya vitamin B 12 Sy et al. 2005, enzim, dan senyawa lainnya yang belum diketahui, sehingga komposisi pada media dengan penambahan isolat bakteri menjadi lebih kompleks. Komposisi media yang kompleks memungkinkan adanya efek saling meniadakan atau saling menekan antara senyawa satu dengan senyawa lainnya sehingga tidak dapat menginduksi perakaran tanaman nilam dalam kultur in vitro. Penelitian terdahulu melaporkan bahwa untuk menginduksi pertumbuhan akar diperlukan media dengan unsur hara yang minimum. Hayati 1992 melaporkan bahwa untuk induksi perakaran nilam, media MS 0,5 hara makro tanpa ZPT adalah yang terbaik. Media MS+BAP 0,1 mgl adalah media yang menghasilkan akar terendah setelah media AMS. Benzyl amino purine BAP adalah sitokinin yang salah satu fungsinya adalah menghambat pembentukan akar Torres 1957 sehingga akar yang terbentuk pada media tersebut rendah, sedangkan pada media AMS tidak terjadi pertumbuhan akar karena salah satu komponen media AMS adalah 1 methanol yang bersifat racun terhadap tanaman dan menghambat penyerapan hara oleh tanaman. Tanaman nilam pada media AMS mengalami kelayuan sejak minggu pertama setelah tanam, dan mengalami kematian di minggu berikutnya. Penambahan isolat Methylobacterium spp. strain TD-J 2 ke dalam media kultur mengakibatkan penampakan tanaman nilam dalam kultur in vitro menjadi lebih hijau serta memiliki daun yang lebih tebal dan kokoh. Hal ini terjadi karena Methylobacterium spp. menghasilkan beberapa enzim. Madhaiyan 2006b melaporkan bahwa bakteri ini mampu mensintesa 1-Aminocyclopropane-1- Carboxylate ACC deaminase. ACC deaminase yang berperan menurunkan level etilen dengan cara mendegradasi ACC, prekursor hormon etilen Husen et al. 2009. Etilen dapat menginduksi penuaan pada bunga. Sebagaimana pada buah, apabila sel daun mahkota menjadi peka terhadap etilen, daun mahkota tersebut memberikan respon dengan meningkatkan hasil etilen autokatalitik secara tiba-tiba saat ACC sintase terinduksi Borochov dan Woodson 1988 in Salisbury dan Cleon 1995 dan segera saja daun mahkota mulai melayu akibat meningkatnya permeabilitas membran plasma dan tonoplas, yang diikuti dengan hilangnya linarut dan kemudian air menuju dinding sel, dan ruang antar sel Salisbury dan Cleon 1995. Maka dari itu, dengan adanya ACC deaminase yang dihasilkan oleh Methylobacterium spp. ini dapat menjadikan tanaman bugar dan tidak cepat mengalami penuaan. Belimov et al. 2001 dalam Kelompok Peneliti Biologi dan Kesehatan Tanah 2010 melaporkan bahwa bakteri ACC deaminase mampu memelihara kebugaran tanaman pada tanah tercemar logam berat.

B. Strain TD-J