ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN-GEN ANALOG

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RESISTANCE AND DEFENSE GENE ANALOGS IN COCOA Theobroma cacao L. Abstract Plants disease Resistance is controlled by a number of resistance genes. Generally there are two groups of resistance genes namely 1 R gene that encod e proteins involved in recognizing pa thogens; and 2 defense respon se gene that encode proteins that inhibit the growth of pa thogens. This research aims to study the ana log genes thought related to the nature of plant resistance to Phytophthora palmivora. A PCR strategy was used to clone resistance genes analogs RGAs and defense gene analogs DGAs using specific primers Tc-ICLR, Tc Cat, Tc- Chit Tc-Pox , and non-specific primers NBS-LRR, Pto, IPTO, and I Glu. Of the eight cloned sequences, only three sequences were successfully isolated, they are one RGA sequence of Pto and two sequences of DGA of Cat1 and Cat2. Based on the analysis of alignments and phylogenetic de ndo gram at the amino acid level, those three analogue genes have a fairly high level of homology against ot her plants. From the obtained sequences, the specific primer will be designed to analyze the ge netic diversity of cocoa by resistant gene analog- marker. Pendahuluan Sejalan dengan pertumbuhan jumlah penduduk dan konsumsi masyarakat terhadap berbagai produk berbahan dasar coklat, maka terjadi peningkatan permintaan biji kakao baik untuk pasar lokal maupun internasional. Hal ini merupaka n pe luang yang amat ba ik bagi Indo nesia seba gai salah satu Negara produsen kakao untuk meningkatkan produksinya baik secara kualitas maupun kuantitas. Pengembangan budi daya kakao di Indonesia masih menemui berbagai kendala, salah satunya adalah gangguan berbagai penyakit yang dapat menyerang tanaman ini. Salah satu penyakit utama yang menyerang pertanaman kakao adalah busuk buah yang disebabkan oleh cendawan Phytophthora palmivora. Buah ya ng terinfeksi akan menunjukkan gejala pembusukan disertai bercak coklat kehitaman dengan batas yang tegas, biasanya dimulai dari ujung atau pangkal buah Sukamto 2008. Penyakit ini merupakan masalah yang sulit untuk dikendalikan, sehingga menyebabkan penurunan hasil kakao sacara signifikan. Salah satu cara yang paling efektif untuk mengatasi penyakit ini adalah dengan penanaman kultivar yang tahan. Menurut Akrofi dan Opoku 2000 penanaman varietas yang tahan merupakan cara pengendalian penyakit yang paling bermanfaat karena cara ini ramah lingkungan. Berdasarkan hal tersebut maka upaya pemuliaan tanaman kakao terutama diarahkan untuk mendapatkan kultivar unggul yang berdaya hasil tinggi dan mempunyai sifat resisten terhadap hama dan penyakit terutama penyakit busuk b uah ya ng disebabka n P. palmivora. Pengemba ngan klon kakao yang lebih resisten atau toleran terhadap infeksi P.palmivora juga perlu dilakukan untuk mengatasi penurunan hasil tanaman kakao. Klon kakao unggul yang lebih resisten atau toleran terhadap infeksi P.palmivora dapat dirakit melalui hibridisasi terkontrol antara tetua yang resisten atau toleran de ngan yang berdaya hasil tinggi Rubiyo 2009. Phytophthora bersifat patogen pada semua bagian tanaman kakao, mulai dari kecambah sampai tanaman dewasa, menyebabkan sejumlah penyakit. Hingga kini ada delapan species Phytophthora yang telah diisolasi dari tanaman kakao yaitu: P. palmivora, P. megakarya, P. capsici, P. tropicalis, P. katsurae, P. arecae, P. nicotianae, da n P. megasperma App iah et al. 2003. Mekanisme resistensi penyakit tanaman dibagi menjadi dua kategori yaitu preformed resistance resistensi alami dan induced resistance resistensi yang diinduksi Agrios 2005. Tanaman sejenis dapat memberikan respon yang berbeda terhadap serangan patogen. Ada yang rentan, agak rentan, tahan atau agak tahan. Hal ini bergantung pada jenis dan jumlah gen- gen resisten yang terdapa t pada tanaman tersebut. Agrios 2005. Ketika tanaman terserang patogen maka sejumlah gen ketahanan akan diaktifkan, sehingga tanaman akan membatasi penyebaran penyakit dengan membentuk bercak-bercak, lesion, atau be njolan melalui pembentukan struktur maupun senyawa yang dapat menahan penyebaran patogen. Tanaman memiliki sistem yang kompleks dalam hal mempertahankan diri dari serangan penyakit, nematode maupun serangga Chen et al. 2009. Salah satu pertahanan yang efektif dike nal de ngan interaksi gen de ngan gen yang membutuhkan gen ke tahanan R khusus dan berhubungan dengan gen avirulen Avr dari pathogen Wang et al. 2004; Miller et al. 2008. Fungsi utama dari R gene adalah mengenda lika n ketahanan terhadap pe nyakit dengan memiliki hubungan antar gen gene for gen relationship de ngan gen avirulen avr pathogen Hammond-Kosack and Jones 1997. Beberapa gen yang terlibat dalam interaksi tanaman-patogen telah berhasil dikenali. Gen yang mengendalikan sifat resistensi terdiri atas dua kelompok: yang pertama adalah kelompok gen yang terlibat dalam pengenalan patogen dan atau sinyal transduksi disebut gen ke tahaman R gene; yang lainnya terlibat dalam mekanisme ketahanan dan sintesis produk yang dibutuhka n unt uk pe ngenalan patogen Hammond-Kosack dan Jones 1997. Ketahanan secara kuantitatif pada tanaman kakao telah banyak dipelajari. Berdasarkan pengamatan fenotipik dijelaskan bahwa sifat resistensi dikendalikan oleh banyak gen poligenik, oleh karena itu pendekatan yang digunakan untuk mempelajarinya difokuskan pada gen-gen yang berpotensi terlibat dalam lintasan biokimia ketahanan terhadap penyakit. Hal ini didasarkan pada dugaan bahwa gen-ge n tertentu yang dike nal fungs inya be rhubungan de ngan ketahana n tanaman memegang peranan dalam interaksi antara tanaman dengan patogen Lanaud et al.2003. Bailey et al. 2005 berhasil mempelajari gen-gen yang terekspresi sebagai respon kakao terhadap infeksi Phytophthora megakarya dan menemukan bahwa ekspresi gen- gen tersebut berbeda pada berbagai umur daun. Saat ini telah lebih dari 60 gen ke tahanan R gene yang berhasil diperoleh dan diperbanyak dari berbagai spesies tanaman Dilbirligi and Gill 2004; Chen et al. 2008. Berdasarkan domain structural yang dimilikinya, gen ketahanan R gene dapat dikelompokan menjadi tiga kelompok : 1 gen yang menyandi protein yang mengandung Nucleotide Binding Site da n Leucine-Rich Repeat NBS-LRR; 2 ge n yang menyandi protein yang menga ndung serinthreonin kinase STK; 3 gen yang menyandi protein yang mengandung extracitoplasmic Leucine-Rich Repeat eLRR Gao et al. 2005. Gen NBS menyandi protein NBS yang memegang peran penting dalam ketahanan terhadap patogen dan siklus sel. Keberadaan kelompok gen NBS cukup berlimpah dalam genom tanaman berkisar antara 0.6 – 2 dari jumlah gen total De Young 2006. Genom kakao paling sedikit mengandung 253 gen LRR-RLK yang memiliki kemiripan dengan A thaliana Argout et al. 2010 Kelompok gen lainnya dikenal sebagai gen pertahanan defence response gene, berperan dalam pembatasan serangan pathogen pada jaringan tanaman dengan cara membatasi pertumbuhan, perkembangan dan perbanyakan patogen dalam tubuh tanaman. Gen ini menyandi protein yang dikenal dengan PR protein Pathogenesis Related Protein. Beberapa senyawa yang sudah diidentifikasi sebagai PR protein antara lain glucanase, chitinase, peroxidase, dsb. Lanaud et al. 2003. Berbagai gen ketahanan telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari berbagai jenis tumbuhan seperti anggur Gaspero and Cipriani, 2003, kedelai Wang et al. 2004, kapas Gao et al. 2005, sorghum Totad et al.2005, zizania Chen et al. 2006, pisang Xinwu et al. 2007; Miller et al. 2008, ubi ramba t Chen et al. 2008, juga gandum Zhang et al. 2010. Demikian pula pada kakao, penelitian tentang RGADGA sebelumnya telah dilakukan oleh Lanaud et al. 2003; Clement et al. 2003; dan Bailey et al. 2005. Penelitian yang dilakuka n bertuj uan untuk: 1 mengisolasi gen- gen analog yang diduga terkait dengan sifat resistensi kakao terhadap Phytophthora Palmivora ; 2 mengidentifikasi fragmen DNA gen-gen DGARGA pada tanaman kakao; 3 menentukan runutan fragmen DNA gen- gen DGARGA pada kakao. Selanjutnya dari hasil penelitian ini akan dikembangka n pe nanda molekuler spesifik untuk gen-gen DGARGA yang dapat diguna ka n untuk analisis keragaman kakao koleksi Puslit Kopi dan Kakao Indonesia. Bahan dan Metode Waktu dan tempat Kegiatan dilaksanakan di laboratorium Central of Agricultural Biotechnology Kasetsart University, Thailand mulai bulan September 2008 sampai dengan Januari 2009, dan laboratorium Biologi Molekuler Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura Agrohort, Fakultas Pertanian Intitut Pertanian Bogor dari bulan September 2009 sampai dengan Juni 2010. Bahan tanaman dan ekstraksi DNA kakao DNA kakao diisolasi dari delapan klon kakao koleksi Puslit Kopi dan Kakao Indonesia, Jember Tabe l 9. Lebih kurang 20-30 mg daun kering dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendoft bersama bola gir kecil. Sampel daun dihancurkan dalam mesin penghancur jaringan Retsch MM301 selama 3 menit de ngan frekuensi 300 hertz. Jaringa n yang suda h hancur diinkubasi dengan buffer lisis yang mengandung RNase selama semalam, dan difiltrasi melalui filter column. Eks traks i larutan DNA selanjut nya dilakukan sesuai dengan protokol Plant Genomic DNA Mini Kit Geneaid, Geneaid Biotech Ltd. http:www.geneaid.com . Urutan tahapan ekstraksi secara lengkap disajikan pada lampiran. Tabe l 9. K lon-klon kakao yang digunakan sebagai templat DNA untuk PCR No. Klon Tipe Kelompok Ketahanan 1. DR 1 Trinitario Mulia SR 2. DR 2 Trinitario Mulia RT 3. DR 38 Trinitario Mulia TH 4. ICCRI 1 Trinitario Lindak TH 5. ICCRI 2 Trinitario Lindak AR 6. ICCRI 3 Trinitario Lindak TH 7. ICCRI 4 Trinitario Lindak RT 8. DRC 15 Trinitario Lindak SR 9. PA 300 Trinitario Lindak TH 10. SCa 6 Trinitario Lindak TH Catatan: Data tipe dan kelompok kakao diperoleh dari Puslit Kopi dan Kakao Indo nesia. Data Respon ketahanan diperoleh dari hasil penelitian Rubiyo 2009. Ket: SR: sangat rentan; RT: rentan; AR: agak rentan; AT: agak tahan; TH: tahan. PCR dan Amplifikasi DNA Template DNA dari masing- masing klon kakao diamplifikasi dengan empat primer spesifik dan empat primer non spesifik. Primer spesifik yang digunakan adalah Tc-ICLR, Tc Cat, Tc-Chit, da n Tc-Pox, sedangkan primer non spesifik adalah NBS-LRR, Pto, iPto, da n iGlu. Primer yang digunakan dalam penlitian ini diambil da ri primer yang sudah digunakan dalam penelitian sebelumnya pada kakao Lanaud et al. 2004. PCR dilakukan dengan total volume 15 µl, terdiri atas 2 µl DNA template, 1 µl primer, 1.5 µl 10x buffer, 0.15 µl MgCl, 0.075 Taq DNA polymerase, dan 2.7 µl dNTP. Proses PCR dilakukan dengan 39 siklus, diawali denaturasi pada 94 o C selama 4 menit, kemudian 39 siklus berikutnya yang terdiri atas denaturasi pada 94 o C selama 45 detik , penempelan annealing pada suhu 50 o C untuk primer spesifik dan 42 o C untuk pr imer non spesifik selama 45 detik, dan perpanjangan extension pada suhu 72 o C selama 30 detik. Tahap terakhir dilanjutkan dengan perpanjangan akhir final extension pada suhu 72 o C selama 5 menit dan pendinginan coolingsampai suhu 16 o C selama 10 menit. Hasil amplifikasi PCR dievaluasi dengan melakukan running pada gel agarose 1 selama 20 menit pada mesin elektroforesis dengan arus 300 Am dan 200 V. Kloning dan Sekuensing Fragmen D NA Produk PCR yang telah divisualisasikan pada gel agarose, dipilih yang memiliki pita yang jelas untuk keperluan kloning dan sekuensing. Produk PCR dilakukan menurut protokol PCR Clean Up Kit dari produk GelPCR DNA Fragments Extraction Kit Geneaid. Fragmen DNA PCR yang telah murni diperbanyak di bakteri Eschericia coli strain DH 10B. Fragmen DNA sebanyak 1.5 ul diligasikan ke vektor p GEMP-T 0.5 ul menggunakan enzim T4 DNA ligase 0.5 ul dan buffer 2.5 ul pada suhu 4°C selama semalam. Sebanyaak 2.5 ul DNA plasmid hasil ligasi ditransformasikan ke 40 ul sel kompeten E. coli dengan sistem kejut listrik. Bakteri E. coli kemudian dikultur pada media LB cair 800 ul. Bakteri E. coli digoyang di atas shaker dengan kecepatan 220 rpm dan suhu 37°C selama lebih kurang dua jam. Sel E. coli sebanyak 80 ul kemudian disebar di media LB padat yang mengandung ampisilin, dan IPTG. E. coli diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37°C selama semalam. Sel E. coli transfor man yang mengandung DNA sisipan akan membentuk koloni putih. Konfirmasi adanya DNA sisipan pada plasmid dilakukan dengan elektrophoresis PCR koloni di agarose 1.0 . Koloni bakteri yang positif mengandung plasmid dan DNA sisipan diambil sebanyak 5 ul dan dikultur dalam media LB cair 5 ml, selanjutnya digoyang di atas shaker incubator dengan kecepatan 220 rpm selama 16 jam. Ekstraksi plasmid rekombinan dari bakteri E. coli dilakukan sesuai dengan protokol High-Speed Plasmid Mini Kit Geneaid. DNA plasmid diukur konsentrasinya dengan metode elektroforesis dalam agarose gel 1.0 dengan marka kuantitas. DNA plasmid dikirim ke manufaktur untuk disekuensing. Analisis Hasil Sekuensing dan Desain Primer Spesifik Data hasil sekuensing berupa runutan DNA selanj utnya dianalisis tingka t kemiripannya dengan tanaman lain menggunakan metode BlastN, yang dapat diakses dari situs NCBI http:www,ncbi.nlm.nih.gov . Runutan asam amino diperoleh de nga n mentranslasika n runutan nukleot ida hasil sekuensing menggunakan perangkat lunak DNAMAN. Analisis pensejajaran runutan asam amino dilakuka n de ngan program ClustalW yang tersedia di situs Genebe e http:www.genebee.msu.suclustaladvanced.html dan diekspor ke program Genedoc. Selanjutnya analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program UPGMA untuk mempe roleh dendo gram. Berdasarka n hasil sekuensing diperoleh runutan fragmen DNA yang ke mudian dibuat desain primer spesifik dengan menggunakan program software Primer 3. Selanjutnya primer spesifik ini akan digunakan untuk menganalisis keragaman genetik hibrida F1 kakao. Hasil dan Pembahasan Amplifikasi PCR dan sekuensing klon yang mengandung DGARGA Hasil amplifikasi dengan PCR menunjukkan bahwa di antara delapan pasang primer yang digunakan, tidak semuanya dapat mengamplifikasi genom kakao. Primer- primer yang dapat mengamplifikasi genom kakao terdiri atas empat primer spesifik dan dua primer non spesifik Tabel 11. Produk PCR yang dihasilkan memiliki ukuran berkisar antara 800 -1000 bp Gambar 25. Produk PCR dari setiap gen diligasi ke dalam plasmid vector dan selanjutnya diperbanyak da lam bakteri E. coli, menghasilkan masing- masing dua klon untuk TcCat, NBS- LRR, dan Pto. Klon-klon yang mengandung fragmen DNA tersebut selanjutnya dilakuka n sekue nsing. Tabe l 10. Primer spesifik dan non spesifik, suhu annealing dan ukuran produk PCR`untuk amplifikasi gen- gen RGADGA pada kakao No. Nama Primer Sekuens Suhu annealing 1. A. Primer spesifik Tc-ICLR F: ATGGCTGCATCTTTCTCAGTGCC R: GTTCTCCATAAC TTCTTGGCCAT 56 o C 2. Tc Cat F: TCACTAATGGATCCCTACAAGG R: GTGACCTCAAAGAAACCCTTTGC 56 o 3. C Tc-Chit F: TTCGCTACAACCGGTGATGATGC R: AGAAGGCTTTGGGTGGATTGTGGAG 56 o 4. C Tc-Pox, F: CTTCATTTCCATGACTGCTTCGT R: GGTGGTAAGGTTCTGCAAGGTTACT 56 o C 5. B. Non spesifik NBS-LRR F: GGTGGCATTGGTAARACNACNCTNGC R: GTTGTCTTACCAATGCCNCCCATNCC 42 o 6 C Pto F: GGAGGATTTGGTAARGTNTAYAAR R: ACCACACCAAATGAPTANACPTC 42 o C M 1 2 3 4 5 6 Gambar 25. Hasil amplifikasi genom kakao ICCRI3 dengan 6 pasang primer yang digunakan: 1 hasil amplifikasi genom kakao dengan primer NBS-LRR, 2 primer TcPox, 3 primer Cat, 4. Primer Chit, 5 primer ICL, dan 6 primer Pto, M=marker Analisis Runutan Fragmen DNA dan Asam amino Analisis runutan basa dari pot ongan fragmen gen Cat1, Cat2, dan Pto yang berasal dari DNA genomik kakao menghasilkan runutan basa masing- masing dengan panjang 1081, 957, dan 542 bp Gambar 26. Fragmen gen Cat 1 memiliki daerah ekson dengan panjang 882 bp dan menyandikan 294 asam amino Gambar 26A, Cat 2 memiliki daerah ekson dengan panjang 665 bp dan menyandikan 222 asam amino Gambar 26B, sedangkan Pto memiliki daerah ekson dengan panjang 540 bp dan menyandikan 180 asam amino Gambar 26C. A 1 TCACTAATGGATCCCTACAAGGTACTCTTTCTCTTCTCCGATTCTAATTATAATTAATAA T N G S L Q G T L S L L R F L L I 61 TCGTTTGCTGGATTTAATTCGACTTTGTATTTGTTTTTGACGAATTATTTTCTTCTTTCA I V C W I F D F V F V F D E L F S S F 121 ATCAAATCTTGCTGAGGTTCGTTTTTGATTGACTCTGTTTCCTTCTTCTTCTTTTTTCCT N Q I L L R F V F D L C F L L L L F S 181 TTTTTGTTAATTGGATTTCTGTAACGTGGCCTTGTTTGCTTCGATTAAAGTTTTCTTCAG F F V N W I S V T W P C L L R L K F S S 241 GATGTTCCTAATCGTTTCTTACCTTAAGCTATTAGATGAGAAATCGCTTTTTAGGGAGAA G C S S F L T L S Y M R N R F L G R 301 AATTATTTTTGACTTCCGAAGACTGAAGTACTAAAAAGCCATTTCAAATAAGTCTCTTTA K L F L T S E D S T K K P F Q I S L F 361 TAATAATAATTTTGATGAATCGAGTTGAATTTCTTTCTTTTGGTTTTTTTCATTTTTCTC I I I I L M N R V E F L S F G F F H F S 421 TGCGATTACAGTTCGTTAGTGAATAATCATTCTTTTTGGGTATTCTAAATTGGATGATGC L R L Q F V S E S F F L G I L N W M M 481 AGTACCGCCCATCAAGTGCTTTCAATTCCCCATTCTGGACAACTAATTCTGGTGCTCCAG Q Y R P S S A F N S P F W T T N S G A P 541 TTTGGAACAACAACTCATCACTCACTGTCGGACCCAGAGGTATATGATTTTCTCCCCCTT V W N N N S S L T V G P R G I F S P P 601 TTTCTTTTGTTTTTATAGAAATACTACTTGTGTAACTATAATGAAAATCACCCGCTACTG F S F V F I E I L L V L K S P A T 661 ACTGCCAGATTATTAGTCATGATTTTTCTTGAGCACTTTCCTCTTGAGTTGATATTCATT D C Q I I S H D F S A L S S V D I H 721 TTGGCAATACTTATGATTATCAAGAGCACTTTATCATTATAATTTGTGCCGCGATCAGCA F G N T Y D Y Q E H F I I I I C A A I S 781 TTTTGTTGTTATAGTTTGCTTAGGTT GTTCCTATTTGATTATATATCACTATCACTAATA I L L L F A V V P I L Y I T I T N 841 TAGTAGTCTTATGCAATGCATTCCTGTAACTATTAAACTGAAAACCATCTTTTCCCATTT I V V L C N A F L L L N K P S F P I 901 TTTTTATTAGCTGGGTGGGGGGCTGGGGTTTGCACTTGGCATTTTGTGTCAATCAAATTG F F I S W V G G W G L H L A F C V N Q I 961 TAAAACTTGAAAACTATGTTAATATTCTTTGCGGGAACAATTTTCTTTTAACAAATGTTG V K L E N Y V N I L C G N N F L L T N V 1021 TTGAAAATTTGGAACCNNANTTNNNTTTGACAGGACCAATNNNCTCTTGAGGANNNNATT V E N L E P X X X L T G P X X S G X X 1081 A B 1 GTGACCTCAAAGAAACCCTTTGCCCAATCTCCCTTGTAGGGATCCATTAGTGAATTAGAT P Q R N P L P N L P C R D P L V N M 61 GAGAAATCGCTTTTTAGGGAGAAAATTATTTTTGACTTCCGAAGACTGAAGTACTAAAAA R N R F L G R K L F L T S E D S T K K 121 GCCATTTCAAATAAGTCTCTTTATAATAATAATTTTGATGAATCGAGTTGAATTTCTTTC P F Q I S L F I I I I L M N R V E F L S 181 TTTTGGTTTTTTTCATTTTTCTCTGCGATTACAGTTCGTTAGTGAATAATCATTCTTTTT F G F F H F S L R L Q F V S E S F F L 241 GGGTATTCTAAATTGGATGATGCAGTACCGCCCATCAAGTGCTTTCAATTCCCCATTCTG G I L N W M M Q Y R P S S A F N S P F W 301 GACAACTAATTCTGGTGCTCCAGTTTGGAACAACAACTCATCACTCACTGTCGGACCCAG T T N S G A P V W N N N S S L T V G P R 361 AGGTATATGATTTTCTCCCCCTTTTTCTTTTGTTTTTATAGAAATACTACTTGTGTAACT G I F S P P F S F V F I E I L L V L 421 ATAATGAAAATCATCCGCTACTGACTGCCAGATTATTAGTCATGATTTTTCTTGAGCACT K S S A T D C Q I I S H D F S A L 481 TTCCTCTTGAGTTGATATTCATTTTGGCAATACTTATGATTATCAAGAGCACTTTATCAT S S V D I H F G N T Y D Y Q E H F I I 541 TATAATTTGTGCCGCGATCAGCATTTTGTTGTTATAGTTTGCTTAGGTTGTTCCTATTTG I I C A A I S I L L L F A V V P I 601 ATTATATATCACTATCACTAATATAGTAGTCTTATGCAATGCATTCCTGTAACTATTAGA L Y I T I T N I V V L C N A F L L L D 661 CTGAAAACCATCTTTTCCCATTTTTTTTATTAGCTGGGTGGGGGGCTGGGGTTTGCACTT K P S F P I F F I S W V G G W G L H L 721 GGCATTTTGTGTCAATCAAATTGTAAAACTTGAAGACTATGTTAATATTCTTTGTGGGAA A F C V N Q I V K L E D Y V N I L C G N 781 CAATTTTCTTTTAACAAATGTTGTTGATAATTTGGAACCTACATTTCTATTTGACAGGTC N F L L T N V V D N L E P T F L F D R S 841 CAATTCTCCTTGAGGACTATCATCTGGTGGAAAAGCTTGCCAACTTTGATAGGGAGCGGA N S P G L S S G G K A C Q L G A D 901 TTCCAGAACGTGTTGTCCATGCTAGGGGAGCCAGTGCAAAGGGTTTCTTTGAGGTCC S R T C C P C G S Q C K G F L G C 1 GGAGGATTTGGTAAGGTATATAAGGGGTTCTTAGATGAAGGGGAAACAATAGTTGCAATC G G F G K V Y K G F L D E G E T I V A I 61 AAGCGCCTGAATCCAGAGTCCAGACAAGGTGTTTCCGAGTTCTTGACAGAGATTGAGATG K R L N P E S R Q G V S E F L T E I E M 121 CTCTCTCAGCTTCGCCATGTTCATTTGGCGTCCTTGATCGGATATTGCAATGAAAATCGT L S Q L R H V H L A S L I G Y C N E N R 181 GAGATGATACTCGTGTATGATTTTATGAGTAACGGAACTCTTTCTGATCATCTTTATGGT E M I L V Y D F M S N G T L S D H L Y G 241 ACTAGCTATGATTCTCTGACTTGGAAGCAAAGGCTGGAGATATGCAAGGGAGCAGCTATT T S Y D S L T W K Q R L E I C K G A A I 301 GGGTTGAACTATCTTCATACAGAAGTGAAGTATACTGTCATTCATCGAGACGTGAAGACA G L N Y L H T E V K Y T V I H R D V K T 361 AGCAACATTCTACTAGATGAGAAATTCACAGCCAAAGTTTCGGATTTTGGGTTGTCCAAA S N I L L D E K F T A K V S D F G L S K 421 ACGGACCCAAAAGTTGACATGCTTAATACTGGAATAAAGGGCACATGGGGATACTTGGAT T D P K V D M L N T G I K G T W G Y L D 481 CCAGAGTATGCTCGAGGTCATTCATTAACCGAAAAATCAGATGTTTACTCATTTGGTGTG P E Y A R G H S L T E K S D V Y S F G V 541 GT Gambar 26. Runutan basa dan prediksi runutan asam amino dari DNA genom kakao. A. potongan fragmen gen Cat1 1081 bp; B. potongan fragmen gen Cat2 957 bp; C. potongan fragmen gen Pto 542 bp. Runutan fragmen DNA hasil sekuensing ditranslasikan menjadi urutan asam amino menggunakan perangkat lunak DNAMAN versi 4. Berdasarkan konserv domain yang dimilikinya, dari lima sekuens yang ditranslasikan menjadi urutan asam amino hanya diperoleh tiga sekuens ya ng mengandung konserv domain, yaitu dua untuk Catalase dan satu Pto. Urutan asam amino yang diperoleh selanjutnya dianalisis tingkat kemiripannya dengan berbagai jenis tanaman lain yang terdapat di data base Gen Bank, menggunakan algoritma Blast X dan Blast P Tabel 11 dan 12. Tabel 11. Hasil penelusuran tingkat kemiripan antara Pto- like kinase pada kakao dengan sejumlah aksesi tanaman dari Gen Bank menggunakan algoritma Blast P Aksesi Protein yang dihasilkan Jenis tanaman E value Max Ident AAF43394.1 CAB62020.1 AAQ82660.1 AAT28296.1 AAL51075.1 ABV30740.1 ACA05214.1 ACN87619.1 XP_002528705.1 ACX80234.1 ACO25571.1 ACA05217.1 XP_002534329.1 serinethreonine protein kinase receptor-like protein kinase homolog Pto-like serinethreonine kinase Pto-like receptor kinase resistance protein kinase R-like protein kinase-like protein pto-like protein kinase-like protein kinase, putative Pto-type resistance protein protein kinase-coding resistance protein pto-like protein Serinethreonine-protein kinase Oryza sativa Arabidopsis thaliana Capsicum chinense Rosa roxburghii Triticum aestivum Prunus avium Fragaria x ananassa Corylus avellana Ricinus communis Cucumis x hytivus Nicotiana repanda Potentilla tucumanensis Ricinus communis 1e-82 2e-81 4e-81 2e-79 2e-79 6e-78 7e-78 2e-80 1e-79 4e-83 2e-80 2e-79 2e-84 68 68 67 65 66 68 62 68 72 67 65 67 71 Fragmen DNA Pto ditranlasikan dengan menggunakan program Blast X untuk mengetahui susunan dan panjang asam amino pada masing- masing fragmen. Runutan asam amino ini mempunyai tingkat homologi yang cukup tinggi 72 dengan asam amino dari Ricinus communis XP002534329.1. Runutan asam amino untuk fragmen DNA Pto juga memiliki homologi denga n Arabidopsis thaliana CAB92960.1, Oryza sativa AAF43394.1, Prunus avium ABV30740.1, dan Corylus avellana ACN87619.1 sebesar 68. Selanjutnya berturut-turut pada Capsicum chinensis, Potentilla tucumanensis, Cucumis x hytivus 67, Triticum aestivum 66, Rosa roxburghii dan Nicotiana repanda 65 , Fragaria x ananassa 62. Tabel 12. Hasil penelusuran tingkat kemiripan antara Catalase pada kakao dengan sejumlah aksesi tanaman dari Gen Bank menggunakan algoritma Blast P Aksesi Protein yang dihasilkan Jenis tanaman E value Max Ident AET97564.1 ACJ11733.1 BAH37035.1 CAD42909.1 AAK96854.1 AAD17933.1 AAB71764.1 CAA42720.1 ACJ22771.1 AAL83720.1 Catalase Catalase Catalase 1 Catalase Catalase Catalase Catalase 1 Catalase-1 Catalase 1 Catalase Ziziphus jujube Gossypium hirsutum Pisum sativum Prunus persica Arabidopsis thaliana Brassica juncea Nicotiana tabacum Zea mays Jatropha curcas Vitis vinifera 4e-12 5e-12 6e-11 1e-10 4e-10 5e-10 2e-08 5e-08 6e-08 7e-08 91 94 91 82 82 82 88 79 84 76 Hasil analisis Fragmen DNA Cat pada kakao setelah ditranslasikan menghasilkan runutan asam amino yang memiliki homologi tinggi dengan tanaman lain. Runutan yang memiliki homologi tertingga i adalah Gossypium hirsutum 94, selanjutnya berturut-tur ut tanaman Pisum sativum dan Ziziphu s jujube 91. Runutan catalase kakao juga memiliki homologi yang tinggi dengan tanaman dikotil lainnya seperti Nicotiana tabacum 88, Jatropha curcas 84, Arabidopsis thaliana dan Prunus persica 82, Zea mays 79, dan Vitis vinifera 76. Gambar 27. Pensejajaran sekuen asam amino yang diturunkan dari fragmen DNA Pto kakao hasil amplifikasi primer PTO, dengan tanaman Oryza sativa AAF43394.1 , Arabidopsis thaliana CAB62020.1,Capsicum chinense AAQ82660.1, Rosa roxburghii AAT28296.1, Triticum aestivum AAL51075.1, Prunus avium, Fragaria x ananassa ABV30740.1, Corylus avellana ACA05214.1, Ricinus communis ACN87619.1, Cucumis x hytivus XP002528705.1, Nicotiana repanda ACX80234.1, Potentilla tucumanensis ACO25571.1 Gambar 28. Pensejajaran sekuen asam amino yang diturunkan dari fragmen DNA Catalase kakao hasil amplifikasi primer CAT, dengan tanaman Ziziphus jujube AET97564.1 , Gossypium hirsutum ACJ11733.1 , Pisum sativum BAH37035.1 , Prunus persica CAD42909.1 , Arabidopsis thaliana AAK96854.1 , Brassica juncea AAD17933.1 , Nicotiana tabacum AAB71764.1 , Zea mays CAA42720.1 , Jatropha curcas ACJ22771.1 , da n Vitis vinifera AAL83720.1 . Dendrogram filogenetik Pto da n catalase dibuat berdasarkan sekuen asam amino yang diturunka n dari masing- masing fragmen DNAnya. Dendrogram filogenetik Pto menunjukkan adanya 3 group. Pto kakao mengelompok dalam satu group de ngan Oryza sativa, Capsicum chinense, Rosa roxburghii, Prunus avium, Fragaria x ananassa, Corylus avellana, Cucumis x hytivus, dan Potentilla tucumanensis. Gambar 29. Dendogram filogenetik sekuens asam amino Pto like kinase dari kakao PTO230705 dengan Pto dari tanaman Oryza sativa AAF43394.1 , Arabidopsis thaliana CAB62020.1,Capsicum chinense AAQ82660.1, Rosa roxburghii AAT28296.1, Triticum aestivum AAL51075.1, Prunus avium, Fragaria x ananassa ABV30740.1, Corylus avellana ACA05214.1, Ricinus communis ACN87619.1, Cucumis x hytivus XP002528705.1, Nicotiana repanda ACX80234.1, Potentilla tucumanensis ACO25571.1 dengan menggunakan Clustal W. Grup Pto yang ke dua terdiri atas Arabidopsis thaliana, Nicotiana repanda, da n Lycopersicon esculentum, sedangkan grup yang ketiga adalah Ricinus communis dan Arabidopsis thaliana Gambar 29. Dendo gram filogenetik Catalase terbagi menjadi tiga group dimana dua catalase kakao terpisah dari tanaman lainnya, seperti Prunus persica Nicotiana tabacum, Ziziphus jujube, Arabidopsis thaliana, da n Brassica juncea yang berada pada grup dua, sedangkan di grup tiga terdiri atas catalase dari tanaman Pisum sativum, Jatropha curcas, Vitis vinifera da n Zea mays Gambar 30 Gambar 30. Dendogram filogenetik sekuens asam amino catalase 1 dan 2 dari kakao CA 229529 dan 229533 dengan catalase dari tanaman Ziziphus jujube AET97564.1 , Gossypium hirsutum ACJ11733.1 , Pisum sativum BAH37035.1 , Prunus persica CAD42909.1 , Arabidopsis thaliana AAK96854.1 , Brassica juncea AAD17933.1 , Nicotiana tabacum AAB71764.1 , Zea mays CAA42720.1 , Jatropha curcas ACJ22771.1 , da n Vitis vinifera AAL83720.1 . Sejumlah gen ketahanan telah berhasil ditemukan pada berbagai jenis tanaman. Pada kakao, Lanaud et al. 2004 be rhasil mengisolasi sebelas fragmen DNA yang diduga terka it dengan gen-gen ketahanan. Dalam pnelitian tersebut diperoleh dua sekuens termasuk NBS yang berlokasi pada kromosom nomor 7 dan 10, sekuens seperti Pto terdapat pada lima wilayah genom yang salah satunya berada pada kromosom no 4, sedangkan sekuens PR2 berada pada dua wilayah yang terdapat pada kromosom nomor 5 dan 9. Pada penelitian ini tidak didapat kan sekuens NBS-LRR, meskipun sebenarnya kelompok ini cukup berlimpah ter kandung dalam genom tanaman yaitu berkisar antara 0.6 - 2 dari jumlah total genom tanaman De Young et al. 2006. Gen resisten analog yang diperoleh pada penelitian ini adala Pto, yang merupakan salah satu anggota dari kelompok Serine-Threonin Kinase STK. Martin et al. 1994 pertama kali menemukan Pto yang berperan dalam menghasilkan protein ketahanan terhadap bakteri pada tanaman tomat. Lanaud et al. 2004 telah berhasil menemukan sekuens Pto yang terkait dengan sifat resistensi terhadap P.palmivora pada kakao, tepatnya berada pada kromosom nomor 4. Catalase termasuk kelompok PR protein bersama dengan chitinase, glucanase, dan peroksidase, yang berperan dalam memicu mekanisme ketahanan pada sel tanaman. Berbagai strategi untuk mencari kandidat gen perlu dikembangkan secara terus menerus. Salah satunya adalah dengan mengisolasi gen yang menghasilkan ekspresi berbeda selama proses infeksi pada tanaman yang tahan dan tanaman yang rentan Lanaud et al. 2004. Menurut Totad et al. 2005, studi mengenai R gene dan RGA masih perlu digali lebih lanjut. Masih diperlukan informasi yang lebih banyak mengenai sekuens R gene untuk mengetahui lebih banyak struktur domain yang merupakan dasar dari penelusuran gen-gen RGA pada berba gai tanaman. Desain Primer Spesifik Berdasarkan runutan DNA hasil sekuensing selanj utnya dilakuka n desain primer spesifik dengan menggunakan program Primer 3. Primer spesifik yang dihasilkan selanj utnya diharapkan dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA kakao Tabe l 13. Primer spesifik yang berhasil didesain dalam penelitian ini selanjutnya digunakan untuk amplifikasi DNA kakao untuk mengevaluasi keragaman genetik tetua maupun hibrida F1. Hasil produk PCR dari templat DNA dengan primer spesifik di atas, setelah dievaluasi dengan running pada gel agaros menunjukkan bahwa DNA kakao dapat teramplifikasi Gambar 31. Akan tetapi untuk mengetahui apakah primer ini dapat menghasilkan pita polimorfik untuk tetua maupun hibrida kakao yang digunakan, masih perlu evaluasi lebih lanjut. Tabe l 13. Hasil desain primer spesifik gen Cat dan Pto berdasarkan sekuen fragmen DNA kakao Gambar 31. Hasil amplifikasi DNA F1 kakao dengan primer spesifik TcCAT1 pada gel agaros. Di antara berbagai jenis marka molekuler yang telah digunakan, Resistance Gene Analogue RGA merupakan marka spesifik yang dibuat berdasarka n urutan gen ketahanan. Penggun aan marka RGA untuk analisis keragaman genetic padi telah dilakukan oleh Bustamam et al. 2004. Primer spesifik yang diperoleh dari penelitian ini diharapka n dapat menjadi marka RGA yang aplikatif untuk mempelajari keragaman genetik kakao resisten terhadap P. palmivora. Simpulan Amplifikasi genom tetua kakao dengan primer spesifik dan non spesifik menghasilka n tiga sekuens kandidat gen resisten analaog, yang terdiri atas satu sekuen Pto da n dua sekuens Cat. Hasil penelusuran dan pensejajaran sekuens tersebut pada level asam amino menunjukkan bahwa ketiganya memiliki homologi yang cukup tinggi dengan berbagai jenis tanaman lain. Hal ini No Marker Urutan Basa Jmlh Basa PCR Size bp Tm o C 1 TcCAT 1 F: TTGCTGAGGTTCGTTTTTGA R: GCAGTCAGTAGCGGGTGATT 20 20 537 59.4 60.3 2 TcCAT2 F: GTAACGTGGCCTTGTTTGCT R: GCCAGTAGGTGGGTGGAGTA 20 20 446 60.2 60.0 5 TcPTO F: GTTCATTTGGCGTCCTTGAT R: CCATGTGCCCTTTATTCCAG 20 20 330 59.9 60.3 mengindikasikan bahwa sekuen-sekuens tersebut juga terdapat pada tanaman lain dengan tingkat kemiripan yang cukup tinggi. Primer spesifik yang dihasilkan diharapkan dapat digunakan sebagai marka untuk mempelajari keragaman genetic kakao resisten terhadap P. palmivora. DAFTAR PUSTAKA Agrios GN. 2005. Plant Pathology.. Elsevier Academic Press. New York. 5 th Akrofi AY Opoku IY. 2000. Managing Phytophthora megakarya pod root disease. Ghana experience. Proc 3 ed. 803p. rd Int. Seminar of International Permanent Working Group for Cacao Pests and Diseases. Kota Kinabalu, Sabah Malaysia. 16-17 th App iah AA, Flood,J., Bridge, P.D. Ancher,S.A.2003. Inter-and intraspecific morphometric variation and characterization of Phytophthora isolates from cocoa. Plant Pathology,52,168-180. October. Argout et al.2010. The genome of Theobroma cacao. Nature Genetics. http:www.nature.comdoifinder10.1038ng.736 Bailey BA et al. 2005. Developmental expression of stress response genes in Theobroma cacao leaves and their response to Nep1 treatment and a compatible infection by Phytophthora megakarya, Plant physiology and Biochemistry. 43: 611-621. Bustamam M, Reflinur, Agisimanto, Suyono. 2004. Variasi genetik padi tahan blas berdasarkan sidik jari DNA dengan markah gen analog resisten. J Biotek Pertanian. 9: 56-61 Chen GS, Zhou YF, Hou LL, Pan DR. 2009. Cloning and characterization of full length cDNA of a CC-NBS-LRR Resistance Gene in Sweetpotato. Agricultural Science in China. 85: 538-545. De young BI Innes RW.2006. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense. Nat. Immunol. 7: 1243-1249. Di Gaspero G Cipriani G. 2002. Resistance gene analogs are candidate marker for disease-resistance genes in grape Vitis spp.. Theoretical and Aplied Genetics. 106: 163-172. Drenth A. and B. Sendall. 2004. Economic Impact of Phytophthora Diseases in Southeast Asia. In Drenth, A. and Guest, D.I., ed. 2004. Diversity and management of Phytophthora in Southeast Asia. ACIAR Monograph. P. 10-18. Gao Y, Guo W, Wang L, Zhang T. 2006. Isolation and characterization of resistance and de fense gene ana logs in cot ton Gossypium barbadense L.. Science in China Series C: Life Sciences. 49.6: 530-542. Hammond-Kosack KE, Jones JDG. 1997. Plant disease resistance gene. Annual review plant Molecular Biology. 48;575-607. Lanaud C, Risterucci AM, Pieretti I, N’goran JAK, and Fargeas D.2004. Characterisation and genetic mapping of resistance and defence gene analogs in cocoa Theobroma cacao L.. Molecular Breeding 13:211-227. Martin et al. 1994. A member of the tomato Pto gene family confer sensitivity to fenthion in rapid cell death. P lant Cell 6: 1543 -1552. Miller RN, et al. 2008. Analysis of non-TIR-NBS-LRR resistance gene analogs in Musa acuminate Colla: isolation, RFLPmarker development, and physical mapping. BMC Plant Biology. 30 : 8-15. Sukamto S. 2008. Pengendalian Penyakit. Di dalam: Wahyudi T, editor. Panduan Lengkap Kakao. Jakarta: Penebar Swadaya. hlm 154-167. Totad AS, Fkhrudin B, Kuruvinashetti MS. 2005. Isolation and characterization of resistnce gene analogue RGAs from sorghum Sorghum bicolor L.Moenih. Euphytica vol. 143, no 1-2.p 179-188. Weising K, Nybom H, Wolff K, and Meyer W. 1995. DNA Fingerprinting in Plant and Fungi. CRC Press, Boca Raton, Fla. Xinwu P et al. 2007. Isolatio, characterization and phylogenetic analysis of the resistance gen analogues RGAs in ba na na Musa spp.. BAB VI PEMBAHASAN UMUM Kakao merupaka n salah satu tanaman perkebunan yang memiliki po tensi untuk dikembangkan, seiring dengan peningkatan kebutuhan dan permintaan terhadap biji kakao yang semakin tinggi. Upaya ini menemui berbagai kendala, salah satunya adalah penyakit busuk buah yang disebabka n oleh infeks i Phytophthora palmivora Butl. Untuk mengatasi masalah tersebut maka pemuliaan tanaman untuk mengembangkan varietas kakao unggul yang tahan terhadap P. palmivora sangat penting untuk dilakukan dan perlu mendapatkan perhatian khusus. Kultivar unggul kakao yang resisten terhadap infeksi P. palmivora dapat menjadi metode terbaik yang tersedia bagi petani produsen kakao di Indonesia untuk mengatasi masalah serangan pe nyakit busuk b uah kakao d i lapangan. Bahan tanaman yang unggul dan bermutu dapat diperoleh dengan berbagai cara, salah satunya adalah dengan menggunakan benih hibrida F1. Untuk menghasilkan hibrida F1 unggul yang berproduksi tinggi dan resisten terhadap serangan penyakit busuk buah kakao akibat infeksi P. palmivora perlu digunakan tetua do nor yang mempunyai sifat resisten da n tetua pe nerima yang mempunyai daya hasil tinggi. Untuk mendapatkan tetua tersebut diperlukan identifikasi dan analisis keragaman plasma nutfah kakao dari berbagai sentra produksi kakao di Indo nesia. Informasi ini akan sangat bermanfaat untuk mendapatkan hibrida F1 seperti yang diharapka n. Analisis keragaman genetic dapat dilakukan secara langsung dengan mengamati karakter morfologi pada plasma nutfah kakao telah dilakukan dengan pengamatan morfologi Motilal dan Butler, 2003; Bekele et al., 2006, akan tetapi hasilnya masih kurang sempurna karena karakter morfologi dapat berubah dan sangat dipengaruhi lingkungan. Analisis dengan menggunakan marka molekuler dapat menentukan diversitas genetik plasma nutfah kakao sebagai calon tetua yang akan digunakan dalam program pemuliaan tanaman. Untuk meningkatkan kemungkinan didapatkannya kultivar unggul baru, perlu dilakukan persilangan antar dua tetua yang mempunyai jarak genetik yang tinggi. Identitas tetua dengan jarak genetik yang tinggi dapat diketahui dengan menggunakan marka molekuler, sehingga metode ini dapat meningkatkan efektivitas dan efisiensi program pe muliaan yang aka n dilakuka n. Analisis terhadap keragaman morfologi dilakukan secara langsung dengan mengamati berbagai karakter morfologi. Sebanyak 22 klon kakao telah berhasil dikarakterisasi dengan menggunakan deskriptor list yang sudah dikembangkan untuk kakao. Bentuk daun kakao bervariasi, mulai dari elips, oblong maupun obovate bergantung kepada klonnya. Demikian pula dengan bentuk ujung dan pangkalnya, memiliki keragaman yang cukup tinggi. Variasi bentuk ujung dan pangkal daun berupa runcing, meruncing, maupun membulat terdapat pada berbagai klon kakao yang diamati. Warna flush atau daun muda juga bervariasi diantara berbagai klon yang berbeda. Kakao memiliki bunga yang berukuran amat kecil jika dibandingkan dengan buahnya, terdiri atas kelopak yang berwarna ungu dan mahkota bunga berwarna putih kekuningan. Bunga kakao muncul dari cabang yang tua kauliflor. Kakao berasal dari dua subjenis yang berbeda yaitu tipe Criolo yang tergolong jenis mulia, dan Forastero yang merupakan kakao lindak. Selain itu terdapat kelompok kakao lain yang merupakan persilangan liar antara keduanya yang ke mudian dikenal dengan kelompok Trinitario. Sifat morfologi dan fisiologi keturunannya amat beragam demikian pula daya hasil dan mutu bijinya Prawoto 2008. Klon-klon kakao yang tersebar di seluruh wilayah Indonesia pada umumnya termasuk tipe Forastero dan Trinitario, akan tetapi klon-klon mulia seri DR Djati Runggo meskipun termasuk jenis Trinitario lebih dikenal dengan sebutan Java Criolo karena menghasilkan biji putih Susilo 2010. Keragaman morfologis klon kakao dianalisis dengan menggunakan katalog karakter morfologis yang telah diperoleh. Berdasarkan hasil pengelompokan klastering yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa klon kakao koleksi Puslit Kopi dan Kakao Indonesia memiliki keragaman morfologis yang tinggi. Pengelompokan klon yang diamati terlihat berhubungan dengan progenitor yang menurunkan klon masing- masing. Klon-klon yang diketahui memiliki latar belakang genetik yang sama ternyata juga mengelompok ke dalam grup klaster yang sama. Sebagai contoh Sca 12 dan Sca6 yang diketahui merupakan turunan dari tetua yang sama, mengelompok menjadi satu grup yang sama. Seperti telah diuraikan di atas bahwa identifikasi dengan marka morfologi memiliki kelemahan karena karkater tersebut sangat dipengaruhi lingkunga n. Analisis molekuler dapat membantu mengatasi kekurangan tersebut. Berbagai marka molekuler telah dikembangkan untuk analisis keragaman genetik pada berbagai jenis tanaman. Salah satu marka molekuler yang paling efektif untuk tujuan tersebut adalah marka SSR atau dikenal juga dengan mikrosatelit. Mikrosatelit telah digunakan secara luas pada berbagai jenis tanaman karena tingkat polimorfisme yang tinggi, lokus yang spesifik, mudah diperbanyak, hanya membutuhkan sedikit DNA, dan yang terpenting adalah sifatnya yang kodominan Pugh 2004. Pemanfaatan marka SSR untuk mengidentifikasi keragaman genetik telah banyak dilakukan pada berbagai jenis tanaman baik tanaman monokotil maupun dikotil. Hal ini menunjukkan bahwa dengan berbagai kelebihan yang dimiliki, marka SSR sangat potensial untuk dikembangkan sebagai marka molekuler terutama untuk ke perluan ide ntifikasi da n studi keragaman genetik. Pada tanaman kakao marka SSR telah digunakan untuk berbagai tujuan, seperti karakterisasi dan analisis keragaman genetik Lanaud et al 1999; Zhang et al. 2006, karakterisasi kakao koleksi internasional Zhang et al., 2009, dan pembuatan linkage map Risterucci et al. 2000; Pugh et al. 2004. Penggunaan marka SSR juga telah dilakukan unt uk analisis keragamann genetic klon-klon kakao tahan hama penggerek buah kakao PBK Susilo 2010. Pada penelitian ini, dari 39 lokus SSR yang digunakan untuk menganalisis 29 klon kakao, pita polimorfik yang dihasilkan pada 24 lokus menunjukkan adanya keragaman di antara sampel kakao yang dianalisis. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan marka SSR cukup efektif untuk mempelajari keragaman genetik plasma nutfah kakao Saunders et al. 2004. Terka it de ngan tujuan unt uk mencari klon-klon yang memiliki potensi sebagai tetua, hasil analisis dengan marka SSR yang diperoleh juga dapat digunaka n untuk menentuka n jarak ge netik antar klon yang dievaluasi. Besar kecilnya jarak genetik antar klon yang dievaluasi merupakan informasi penting dalam pemanfaatan klon-klon tersebut unt uk pe muliaan tanaman. Dua klon ya ng mempunyai jarak genetik yang tinggi, apabila disilangkan akan menghasilkan turunan yang variasinya sangat tinggi. Sebaliknya, dua klon yang jarak genetiknya rendah, apabila disilangkan aka n menghasilka n turuna n yang variasinya renda h. Klon-klon yang digunakan sebagai tetua dalam persilangan untuk mendapatkan bibit unggul harus memiliki karakter agronomis yang baik dan keduanya mempunyai jarak genetik yang tinggi. Dengan menyilangkan dua tetua yang demikian itu maka didapatkan populasi hibrida F1 yang heterogeneous dan mempunyai keragaman yang tinggi. Populasi F1 yang heterogeneous tersebut sangat efektif untuk mengatasi berbagai permasalahan yang mungkin menjadi kendala di lapangan seperti: stres lingkungan abiotik seperti: nutrisi, kekeringan, keracunan hara, stres biotik seperti: serangan hama dan penyakit. Selain itu, karena kedua tetua yang digunakan masing- masing mempunyai karakteristik agronomis yang diinginkan, hibrida F1 yang didapat diharapkan juga mewarisi sifat-sifat baik tetuanya. Hasil analisis kedekatan genetik mengindikasikan tingkat kesamaan antar individu yang ditentukan berdasarkan koe fisien DICE de ngan menggun akan prosedur SIMQUAL yang tersedia dalam paket perangkat lunak NTSys versi 2.01. Hal ini berarti, jarak genetik antar klon kakao yang diuji menjadi semakin kecil dengan semakin besarnya nilai kesamaan diantara keduanya. Sebaliknya, jarak genetik antar klon kakao yang diuji menjadi semakin besar dengan semakin kecilnya nilai kesamaan diantara keduanya. Tingkat kesamaan di antara lima klon kakao yang dijadikan sebagai tetua bervariasi antara 0.15 – 0.48. Hal ini berarti jarak genetik antar tetua yang digunakan untuk menghasilkan galur kakao hibrida F1 berkisar antara 0.52 – 0.85, merupakan nilai relatif tinggi. Berdasarkan hal tersebut diduga bahwa populasi F1 yang dihasilkan akan mempunyai tingkat keragaman genetik yang tinggi. Keragaman genetik antar individu dalam populasi F1 yang dihasilkan diduga akan terlihat mempunya i nilai yag tinggi, terutama dari hasil kombinasi persilanga n antara: klon kakao DR 1 x Sca 6, ICS 13 x Sca 6, dan ICCRI 3 x Sca 6. Hasil analisis klaster yang dilakukan juga menunjukan bahwa Sca 6 mempunyai tingkat kesamaan yang paling rendah dengan empat klon kakao yang lain. Sebaliknya, klon kakao TSH 858 dan ICS 13 mempunyai tingkat kesamaan yang tertinggi diantara lima tetua yang dievaluasi. Berdasarkan informasi genetik yang diperoleh,maka terpilih lima tetua yang digunakan dalam persilanga n tersebut adalah klon kakao ICCRI 3, TSH 858, ICS 13, DR1 dan Sca 6. Upaya melakukan perakitan klon-klon unggul kakao tidak terlepas dari analisis runutan fragmen DNA yang diduga terkait dengan sifat resistensi kakao terhadap penyakit busuk buah ynag disebabkan P. palmivora. Runutan fragmen DNA hasil sekuensing ditranslasikan menjadi urutan asam amino menggunakan perangkat lunak DNAMAN versi 4. Berdasarkan konserv domain yang dimilikinya, dari lima sekuens yang ditranslasikan menjadi urutan asam amino hanya diperoleh tiga sekuens yang mengandung konserv domain, yaitu dua unt uk Catalase dan satu Pto. Urutan asam amino yang diperoleh selanjutnya dianalisis tingkat kemiripannya dengan berbagai jenis tanaman lain yang terdapat di data base Gen Bank, menggunakan algoritma Blast X dan Blast P. Fragmen DNA Pto ditranlasikan dengan menggunakan program Blast X untuk mengetahui susunan dan panjang asam amino pada masing- masing fragmen. Runutan asam amino ini mempunyai tingkat homologi yang cukup tinggi 72 dengan asam amino dari Ricinus communis XP002534329.1. Runutan asam amino untuk fragmen DNA Pto juga memiliki homologi dengan Arabidopsis thaliana CAB92960.1, Oryza sativa AAF43394.1, Prunus avium ABV30740.1, dan Corylus avellana ACN87619.1 sebesar 68. Selanjutnya berturut-turut pada Capsicum chinensis, Potentilla tucumanensis, Cucumis x hytivus 67, Triticum aestivum 66, Rosa roxburghii da n Nicotiana repanda 65, Fragaria x ananassa 62. Hasil analisis Fragmen DNA Cat pada kakao setelah ditranslasikan menghasilkan runutan asam amino yang memiliki homologi tinggi dengan tanaman lain. Runutan yang memiliki homologi tertingga i adalah Gossypium hirsutum 94, selanjutnya berturut-tur ut tanaman Pisum sativum dan Ziziphu s jujube 91. Runutan catalase kakao juga memiliki homologi yang tinggi dengan tanaman dikotil lainnya seperti Nicotiana tabacum 88, Jatropha curcas 84, Arabidopsis thaliana dan Prunus persica 82, Zea mays 79, dan Vitis vinifera 76. Secara umum terdapat dua ke lompok utama gen yang mengendalikan ketahanan tanaman terhadap hama dan penyakit, yang pertama adalah kelompok gen yang terlibat dalam pengenalan patogen dan atau sinyal transduksi disebut gen ketahaman R gene yang dikenal juga dengan RGA; yang lainnya terlibat dalam mekanisme ketahanan dan sintesis produk yang dibutuhkan untuk pengenalan pathogen, d ike nal de ngan DGA Hammond-Kosack dan Jones 1997. Berdasarkan hasil analisis runutan fragmen DNA yang berhasil diisolasi, gen resisten analog RGA yang diperoleh pada penelitian ini adala Pto, yang merupakan salah satu anggota dari kelompok Serine-Threonin Kinase STK. Martin et al. 1994 pertama kali menemukan Pto yang berperan dalam menghasilkan protein ketahanan terhadap bakteri pada tanaman tomat. Lanaud et al. 2004 telah berhasil menemukan sekuens Pto yang terkait dengan sifat resistensi terhadap P.palmivora pada kakao, tepatnya berada pada kromosom nomor 4. Kelompok DGA yang berhasil diisolasi dalam penelitian ini adalah Cat yang menyandi protein Catalase, yaitu termasuk kelompok PR protein bersama dengan chitinase, glucanase, dan peroksidase, yang berperan dalam memicu mekanisme ketahanan pada sel tanaman.

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan 1. Keragaman morfologis plasma nutfah kakao yang diamati cukup tinggi. Kondisi seperti ini akan sangat menguntungkan bagi upaya peningkatan kualitas bibit kakao melalui pengembangan hibrida kakao, yang memerlukan tetua dengan keragaman yang tinggi. 2. Marka SSR dapat digunakan untuk evaluasi keragaman genetik plasma nutfah kakao dengan tingkat polimorfisme yang cukup tinggi. Secara umum dapat diketahui bahwa klon kakao yang dikoleksi oleh Puslit Kopi dan Kakao Indonesia mempunyai keragaman genetik yang tinggi. Tingkat heterosigositas dan keragaman genetik plasma nutfah kakao koleksi Puslit Kopi dan Kakao Indonesia yang relatif tinggi memiliki peluang yang amat potensial untuk dijadikan sebagai tetua dalam persilangan, untuk mendapatkan hibrida yang unggul. 3. Hasil analisis keragaman hibrida F1 dengan menggunakan marka SSR menunjukkan bahwa populasi hibrida F1 kakao hasil silangan tetua yang terpilih menunjukkan adanya keragaman yang cukup tinggi. Hal ini mengindikasikan bahwa persilangan antara dua tetua dengan jarak genetik tinggi dapat menghasilkan hibrida dengan keragaman yang tinggi. Dengan menyilangkan dua tetua yang demikian itu maka didapatkan populasi hibrida F1 yang heterogeneous dan mempunyai keragaman yang tinggi. Populasi F1 yang heterogeneous tersebut sangat efektif untuk mengatasi berbagai permasalahan yang mungkin menjadi kendala di lapangan. 4. Hasil analisis terhadap populasi hibrida F1 dengan menggunakan marka SSR diperoleh keragaman yang cukup tinggi di antara individu hasil silangan. Rata-rata tingkat heteros igositas relatif tinggi, akan tetapi tidak ditemukan adanya keterkaitan antara tingkat heterosigos itas hibrida F1 dengan sifat ke tahanannya terhadap pe nyakit busuk buah yang disebabk an oleh Phytophthora palmivora. 5. Amplifikasi genom tetua kakao dengan primer spesifik dan non spesifik menghasilka n tiga sekuens ka ndida t gen resisten analaog, yang terdiri atas satu sekuen Pto dan dua sekuens Cat. Hasil pe nelus uran dan pe nsejajaran sekuens tersebut pada level asam amino menunjukkan bahwa ketiga memiliki homologi yang cukup tinggi dengan berbagai jenis tanaman lain. Hal ini mengindikasikan bahwa sekuen-sekuens tersebut juga terdapat pada tanaman lain dengan tingkat kemiripan yang cukup tinggi. Saran 1. Untuk mendapatkan informasi yang lebih akurat mengenai keragaman plasma nutfah kakao, perlu dilakukan analisis dan karakterisasi terhadap seluruh klon kakao koleksi Puslit Kopi dan Kakao Indonesia maupun klon- klon kakao yang tersebar di berbagai sentra produksi kakao seluruh Indonesia. 2. Marka SSR merupakan marka molecular yang sangat informatif untuk mengevaluasi keragaman. Oleh karena itu marka SSR dapat direkomendasikan agar digunakan dalam berbagai kegiatan yang berkaitan dengan analisis keragaman genetik pada berbagai jenis tanaman. 3. Analisis keterkaitan antara heterosigositas dengan sifat ketahanan terhadap P. palmivora masih perlu dikembangkan, dengan menggunakan sampel yang lebih banyak. Demikian pula dengan jumlah lokus SSR yang digunakan sebaiknya lebih banyak lagi agar informasi yang diperoleh lebih akurat. 4. Isolasi dan karakterisasi terhadap gen-gen analog yang diduga terkait dengan sifat ketahanan kakao terhadap P. palmivora masih perlu dikembangkan, dengan menggunakan lebih banyak primer baik yang spesifik maupun non spesifik untuk mengamplifikasi genom kakao. Hal ini perlu dilakukan untuk memperoleh informasi yang lebih banyak mengenai gen-gen RGA dan DGA pada tanaman kakao. 5. Kegiatan penelitian perlu terus dilanjutkan, terutama mengenai analisis keragaman klon-klon kakao khususnya terkait dengan sifat ketahanannya terhadap P. palmivora berdasarkan marka RGA dan DGA yang primernya sudah dibuat pada penelitian ini. Namun demikian jumlah primer yang didesain juga masih perlu ditambah, sehingga hasilnya menjadi lebih informatif. 6. Kegiatan penelitian untuk memperoleh bibit kakao yang unggul perlu terus dikembangkan, sehingga tujuan pemuliaan tanaman kakao untuk mendapatkan klon-klon kakao yang memiliki daya hasil tinggi sekaligus tahan terhadap pe nyakit secara bertahap dapat terwujud.