19 5
mT cCIR106 F: GGGAGTT AAAAT GGGGCAA G
R: TT GCT GTT GTT GT CTT GCTTTT 20
22 246
GA9TT GCA 3
60.66 59.96
20 5
mT cCIR10 F: CGAATT GACAGAT GGCCT ACA
R: CCCAAGCAAGCCT CATACT C 21
20 122
T G13 61.04
59.84 21
6 mT cCIR16,
F: CTT CACCAGCT CACCGAT CT R: AT CAAT GGGTTCGGGT AGT G
20 20
207 CT 13
60.41 59.67
22 6
mT cCIR255 F: GCCTTACAGCATT CCCAT GA
R: AT CT GCAGGACTT GGACCAC 20
20 193
AC11 61.00
60.12 23
6 mT cCIR276
F: T GT GT GTTTAATT GCT CCT GCT R: T GT CT GCCCTTTGACCTTTC
22 20
199 GA14
59.81 60.23
24 6
mT cCIR291 F: TT GCAATT GTCCCAAGCAT A
R: AT GT CAAGCAT GGCAGT GTT 20
20 212
CT 12 60.07
59.17 25
7 mT cCIR186
F: GCGT GT GT GT GCAAAT GATA R: CCGAT AAAT GGGCGTT GTAG
20 20
155 T G8
59.15 60.34
26 7
mT cCIR190 F: CT GAAGCACAATTATTCCAT CAA
R: CCAATT GCT CCACAAAGAGC 23
20 172
T G12 59.13
60.78 27
7 mT cCIR7
F: GCTTTCAGT CCTTTGCTTTCA R: CAGACAAGCCAT GGT CAGT G
21 20
122 CT 14
59.62 60.31
28 8
mT cCIR99 F: TT CGGAAAT GT CGAGAGAGG
R: CCT CT GCCCAT GATCCT AT G 20
20 167
GA9 60.33 60.44
29 8
mT cCIR103 F: CT CCAAGAAAAAGAGGCACA
R: TT GT GGTTATT GCGAACGT G 20
20 175
GA10 58.08
60.56 30
8 mT cCIR211
F: GGGATT GCACTTCACAAGGT R: T CCAAGTT CCGT AT GT GCT G
20 20
179 CT 9
59.97 59.72
31 8
mT cCIR218 F: CAT GCGTT GACCAAGGAAG
R: AT CAAT GCAT GGGAACACCT 19
20 181
CT 11 60.25
60.20 32
9 mT cCIR90
F: CCAGTTCAAAAAT CAT GTT CAGT G R: TT GT GGAGCAACT GT CAACC
24 20
155 CT 10
60.78 59.73
33 9
mT cCIR145 F: T GGAAGGCT GT CCAAAATTC
R: T GTTT GT GT CT GGCTTTT GC 20
20 241
CT 17 60.05
59.89 34
9 mT cCIR251
F: T CAT GCCCAGT GACACAAAT R: AAT GGACT GGAGCAT GGAAG
20 20
228 CT 7CA12
59.97 60.07
35 9
mT cCIR287 F: GCGTT GT CT CGCTTT CTTCT
R: GGGAAAGCCAT GTT CAT GTT 20
20 160
T C9 59.76
59.80 36
10 mT cCIR91
F: GCCCAT GCTT CTCTT CAT GT R; GGGAAAT GAGAAGGGT GT GA
20 20
191 CT 10
60.23 59.90
37 10
mT cCIR155 F: CTTAGAGGCTT GT GCCGT GA
R: GCCAT GCCAATTTCCAAT AA 20
20 197
T C12 61.50
60.65 38
10 mT cCIR209
F: T GT CCTT CACATAAGCCAT GA R: T GTT GCCCTTCCTT GTTAGG
21 20
243 GT6ATGA9
59.14 60.10
39 10
mT cCIR229 F: T CT GGCCCTT GAGAAT GAGT
R: T CCGCAAT CCT ACAACACAA 20
20 151
T C8 59.80
60.11
Proses PCR dilakukan dengan 39 siklus, diawali denaturasi pada 94
o
C selama 4 menit, kemudian 39 siklus berikutnya yang terdiri atas denaturasi pada
94
o
C selama 45 detik, penempelan annealing pada suhu 55
o
C selama 45
detik, dan perpanjangan extension pada suhu 72
o
C selama 30 detik. Tahap terakhir dilanjutkan dengan perpanjangan akhir final extension pada suhu 72
o
C selama 5 menit dan pendinginan cooling sampai suhu 16
o
C selama 5 menit. Hasil amplifikasi PCR dievaluasi dengan melakukan running pada gel agarose
1 selama 20 menit pada mesin elektroforesis dengan arus 300 Am dan 200 Volt untuk konfirmasi ada tidaknya produk amplifikasi.
Running PAGE DNA hasil amplifikasi dengan SSR Proses elektroforesis dimulai dengan penyiapan kaca. Pertama, siapkan
dua kaca panjang dan pendek. Kaca panjang dibersihkan dengan etanol 95, dan dilanjutkan dengan clear view. Untuk kaca pendek dibersihkan dengan etanol
95, dilanjutkan dengan campuran antara Bind Silane dan asam asetat. Kemudian, dua kaca disusun dengan diberi plat plastik sebagai pembatas dan
dijepit dengan empat pasang penjepit. Sementara itu, disiapka n “Microsatelite gel polyacrilamide” yang terdiri atas: 60 ml 4.5 acrilamide ditambah 10 APS µl
dan 90 µl TEMED, kemudian diaduk perlahan sampai tercampur. Cairan acrilamide selanjutnya dituangkan secara perlahan ke celah diantara dua kaca,
ke mudian disisipka n sisirnya dan dibiarkan sampai gel terpolimerisasi. Sampel berupa produk PCR sebanyak 2 µl ditambah 3-4 µl pewarna
kemudian diaduk dan didenaturasi pada suhu 94° C selama 10 menit. Sementara itu dilakukan pre running elektroforesis dengan buffer 1X TBE hingga mencapai
suhu 60
o
Pewarnaan perak nitrat dimulai dengan perendaman kaca dalam larutan acetic acid 10 selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak 3x
masing- masing selama 10 menit, kemudian dilakukan perendaman pada larutan perak nitrat selama 30 menit, selanjutnya dicuci dengan akuades. Selanjutnya kaca
direndam pada larutan developer sambil digoyang hingga nampak pita. Setelah nampak pita, larutan developer dibuang dan terakhir dicuci dengan acetic acid
selama 5 detik dan dilanjutkan pencucian terakhir dengan air. C. 2 µl sampel hasil amplifikasi dimasukka n pada celah sisir sampai
semua sampel masuk, dan sampel siap di running pada mesin elektroforesis dengan kondisi 3000 volt, 300 mA, 65 Watt selama 2,5 jam. Setelah selesai, kaca
dikeluarkan da n kaca penutupnya dilepaskan dengan hati-hati. Hasil elektroforesis siap untuk diwarnai.
