tidak ada tetesan. DNA dikeringkan dengan vacuum pump, selanjutnya dicairkan dengan 200
μl aquabides.
b. Amplifikasi DNA dengan PCR
Metode amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction PCR dilakukan sesuai yang dilakukan Nisya 2010 pada tanaman
jarak pagar Jatropha curcas L yang sefamili dengan jarak kepyar. Tahapan PCR meliputi pre heat, denaturation, annealing, extention,
dan pendinginan suhu. Tahapan, penggunaan proses PCR terdapat pada Gambar 3.
Keterangan: 1: menit, 11: detik, TA: suhu annealing Tabel 2 Gambar 3. Proses reaksi PCR yang digunakan dalam analisis RAPD
jarak kepyar Bahan reaksi yang digunakan dalam amplifikasi dengan PCR
disajikan pada Tabel 3. Untuk amplifikasi DNA, 5 μl primer, 5 μl
taqpol dari kit SIGMA dimasukkan ke dalam PCR tube dan diamplifikasi pada mesin PCR ASTEC Thermal Cycler PC 707. Proses
amplifikasi ini dilakukan sebanyak 45 siklus, yaitu denaturasi selama 1 menit pada suhu 94
C, annealing selama 1 menit pada suhu 36 C dan
extention selama 2 menit pada suhu 72 C serta stop PCR post PCR
dilakukan pada suhu 72 C selama 7 menit. Hasil dari amplifikasi ini
dilanjutkan dengan elektroforesis.
Tabel 3. Bahan reaksi PCR yang digunakan dalam analisis RAPD pada jarak kepyar
Bahan reaksi PCR Volume yang diambil dari
larutan stok μl Konsentrasi akhir
10 x Vivantis Buffer A 2
1x 2mM dNTP mix
0.8 0.08mM
50 mM MgCl2 0.6
1.5mM Taq DNA polymerase 5 unit
μl 0.24
3 unit Double destilate water
6.36 -
Primer 5
2.5 pm
μl DNA 10pm μl
5 -
Volume Total 20
c. Elektroforesis Produk PCR
Langkah elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose 1.5 0,6 g dengan larutan TAE 1x 200 ml. Gel agarose dipasangi sekat
pencetak dan sisir pelubang pembentuk sumur, kemudian dilepaskan saat beku. Larutan TAE 1x ditambahkan sampai gel terendam.
Pelaksanaan tahap elektroforesis sama dengan proses pengujian DNA. Dengan perbandingan loading dye dan DNA adalah 10:2 DNA
ladder disimpan pada salah satu sumur untuk mengukur pita – pita
DNA yang akan dihasilkan dari masing -masing genotipe jarak kepyar. DNA ladder yang digunakan adalah Vivantis 100 bp Gambar 4.
Gambar 4. DNA ladder Vivantis 100 bp Elektroforesis dilakukan selama 90 menit pada voltase 90 V. Hasil
elektroforesis divisualisasikan di atas ultra violet transiluminator dan didokumentasikan dengan kamera.
Kategori