Analisis hubungan kemiripan dan keragaman genetik berdasarkan

Setiap karakter kualitatif diamati secara visual, terutama warna. Sementara itu, karakter lain yang berkaitan dengan bentuk fisik diamati dengan visual dan juga indera peraba. Daun tua yang dipilih untuk diamati dalam penelitian ini adalah daun yang muncul pada tiga ruas batang pertama dari permukaan tanah, sementara daun muda adalah daun yang muncul pada tiga ruas batang dari atas pada tanaman yang sama tiap genotipe. Batang tua yang diamati dipilih dari tiga ruas batang pertama dari permukaan tanah, sedangkan batang muda adalah tiga ruas dari bawah. Karakter kuantitatif yang diamati terdiri atas: a. Tinggi tanaman cm Tinggi tanaman diukur dari permukan tanah hingga titik tumbuh. b. Diameter batang cm Diameter batang diukur pada batang dengan ketinggian satu pertiga tinggi batang dari permukaan tanah. c. Panjang ruas batang tua dan batang muda cm Panjang ruas batang tua dan batang muda masing-masing diukur dari ruas pada batang tua dan batang muda yang dipilih secara acak. d. Panjang tangkai daun cm Panjang tangkai daun diukur dari daun tua. e. Panjang dan lebar daun cm Panjang dan lebar daun diukur dari daun tua. f. Jumlah jari daun buah Jumlah jari daun dihitung dari daun tua. g. Jumlah buah per pohon buah Jumlah buah per pohon diperoleh dari satu kali pengamatan dalam satu tahun. Buah yang masih hijau ataupun yang sudah menghitam dihitung jumlahnya secara serentak dari tiap tanaman per genotipe baik tanaman yang memiliki cabang ataupun tidak. h. Lebar, panjang, dan tebal biji cm Biji jarak kepyar berbetuk agak lonjong memanjang, namun sisi diameternya tidak bulat sempurna. Dimensi pengukuran yang dapat menggambarkan bentuk bijinya adalah lebar, panjang, dan tebal biji. Lebar biji adalah sisi melintang terpanjang biji, sedangkan panjang biji adalah sisi yang membujur. Tebal biji menggambarkan sisi melintang terpanjang. Alat pengukur yang digunakan adalah jangka sorong. i. Bobot 100 butir biji g Biji yang ditimbang adalah yang dipanen secara bulk dari tiga tanaman per genotipe. Bobot 100 butir biji diperoleh dengan mengkonversikan bobot 10 butir biji, dengan rumus: Bobot 100 butir biji = bobot 10 butir biji x 10

3. Analisis hubungan kemiripan berdasarkan marka molekuler

Analisis hubungan kemiripan genetik berdasarkan marka molekuler dilakukan terhadap plasma nutfah yang dikoleksi menggunakan RAPD Random Amplified Polymorphic DNA. Pelaksanaan analisis RAPD tersebut meliputi beberapa tahapan yaitu isolasi DNA, amplifikasi DNA dengan PCR, dan elektroforesis.

a. Isolasi DNA ekstraksi DNA

Bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah daun pertama yang muncul dari kecambah jarak kepyar. Bahan digunting kecil sebesar kurang lebih 2 x 2 cm lalu dicacah, kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube 2 ml yang telah berisi cairan ekstrak dari kit SIGMA sebanyak 100 µL. Mikrotube dipanaskan pada suhu 95ºC selama 5 menit dalam waterbath. Setelah itu, ditambahkan larutan dilusi dari kit SIGMA sebanyak 100 µL, DD H 2 O sebanyak 300 µL, sambil dikocok manual beberapa saat. Larutan tersebut, dipisahkan ke mikrotube baru dari sisa-sisa daun. Chloroform : Isoamyl alcohol CIA=24 : 1 200 µL ditambahkan ke dalam mikrotube tersebut kemudian dihomogenkan dengan vorteks mixer selama 1 menit. Sentrifugasi 15.000 rpm dilakukan selama 5 menit. Supernatan dipisahkan ke mikrotube 1.5 mL, kemudian ditambah ethanol absolut sebanyak 2 kali dari volume supernatan. Sentrifugasi 15.000 rpm selama 3 detik. Setelah itu DNA dikeringkan dengan cara membalik tabung di atas kertas tissue sampai tidak ada tetesan. DNA dikeringkan dengan vacuum pump, selanjutnya dicairkan dengan 200 μl aquabides.

b. Amplifikasi DNA dengan PCR

Metode amplifikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction PCR dilakukan sesuai yang dilakukan Nisya 2010 pada tanaman jarak pagar Jatropha curcas L yang sefamili dengan jarak kepyar. Tahapan PCR meliputi pre heat, denaturation, annealing, extention, dan pendinginan suhu. Tahapan, penggunaan proses PCR terdapat pada Gambar 3. Keterangan: 1: menit, 11: detik, TA: suhu annealing Tabel 2 Gambar 3. Proses reaksi PCR yang digunakan dalam analisis RAPD jarak kepyar Bahan reaksi yang digunakan dalam amplifikasi dengan PCR disajikan pada Tabel 3. Untuk amplifikasi DNA, 5 μl primer, 5 μl taqpol dari kit SIGMA dimasukkan ke dalam PCR tube dan diamplifikasi pada mesin PCR ASTEC Thermal Cycler PC 707. Proses amplifikasi ini dilakukan sebanyak 45 siklus, yaitu denaturasi selama 1 menit pada suhu 94 C, annealing selama 1 menit pada suhu 36 C dan extention selama 2 menit pada suhu 72 C serta stop PCR post PCR dilakukan pada suhu 72 C selama 7 menit. Hasil dari amplifikasi ini dilanjutkan dengan elektroforesis.