6 disterilkan. Ketika menunggu proses sterilisasi media, hangatkan darah kambing
segar sampai suhu 50 C sebanyak 5 dari volume total media atau sebanyak 50
ml yang sudah didefibrinasi dengan menggunakan larutan Na citrat. Dinginkan pula TSA steril sampai suhu mencapai 50
C Hadioeutomo, 1993. Secara aseptik kemudian darah kambing segar dituangkan ke dalam labu
berisi TSA dan dicampur dengan cara memutar-mutar labu tersebut dengan hati- hati. Kemudian media dituangkan sebanyak 12 ml ke dalam cawan petri steril.
Kemudian biakan bakteri ditanam dengan menggunakan ose dan digoreskan ke media agar darah dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang. Ekspresi dari
gen hemolysin dapat diketahui dari ada tidaknya zona bening di sekitar goresankoloni dari kultur yang ditumbuhkan yang menunjukkan adanya lisis sel
darah merah.
2.3 Ekstraksi DNA
Vibrio harveyi yang dikultur selama 18-24 jam dalam media cair LB luria
bertani lampiran 3 diambil dengan menggunakan mikropipet sebanyak 1 ml
dan dimasukkan ke dalam eppendorf steril. Kemudian eppendorf disentrifuse selama 1 menit pada suhu 4
o
C dan kecepatan 12000 rpm. Selanjutnya bagian supernatan dibuang, pellet disuspensi kembali dengan menambahkan 500 µl
buffer steril dan disentrifuse kembali pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, kemudian ke dalam eppendorf diambahkan 100 µl lysozym
dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Setiap 15 menit sekali eppendorf dibolak-balik perlahan. Kemudian ke dalam eppendorf ditambahkan 100 µl SDS
10 dan 10 µl Prot-K, kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37
o
C selama 1 jam.
Tahap selanjutnya ke dalam eppendorf ditambahkan 100 µl NaCl 5 M larutan dicampur dengan cara dibolak-balik perlahan. Kemudian ke dalam
eppendorf ditambahkan ekstraksi buffer 2 CTAB, 100 mM Tris-HCL pH 8, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65
o
C. Setelah itu ke dalam eppendorf ditambahkan 500 µl phenolchloroform-isoamyl
alkohol. Larutan kemudian dihomogenkan dengan cara eppendorf dibolak-balik
7 selama 1 menit. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu
4
o
C selama 5 menit. Setelah terbentuk tiga lapisan, lapisan paling atas diambil dandi pindahkan
ke dalam eppendorf baru sebanyak 50-100 µl menggunakan mikropipet dan ditambahkan ethanol absolut atau isopropanol dingin dengan volume yang sama
dengan supernatan yang di pindahkan.Kemudian diinkubasi dalam freezer dengan suhu -20
o
C selama 20 menit. Langkah berikutnya eppendorf disentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pellet DNA dicuci
dengan 1 ml ethanol 70 bersuhu -20
o
C. Pellet dikeringkan di steril bench selama 15-30 menit. Kemudian aquabides ditambahkan ke dalam eppendorf
sebanyak 50 µl.
2.4 PCR
