Isolasi Dan Karakterisasi Pewarnaan Gram Bakteri Vibrio harveyi Karakterisasi Ekspresi Gen Hemolysin Isolat Pada Media Agar Darah.

5 II.BAHAN DAN METODE

2.1 Isolasi Dan Karakterisasi Pewarnaan Gram Bakteri Vibrio harveyi

Media TCBS disiapkan dalam keadaan aseptik, sampel udang yang terserang vibriosis dipindahkan menggunakan ose dan digoreskan ke media TCBS kemudian diinkubasi selama 24 jam. Identifikasi bakteri Vibrio harveyi dengan menggunakan metode pewarnaan gram atau secara sederhana yaitu dengan cara media TCBS dimasukkan ke dalam ruang gelap, jika terbentuk warna hijau berpendar maka bakteri yang tumbuh tersebut merupakan bakteri V.harveyi. Bakteri V. harveyi yang diperoleh dikultur murni dan ditumbuhkan pada media TCBS dengan menggunakan agar miring. Selanjutnya, kultur dipindahkan dari media padat ke media cair NB yang ditambahkan dengan NaCl 1,5 dan biakan diletakkan dalam shaker selama 24 jam. Langkah awal dalam pewarnaan Gram Lampiran 2 yaitu bakteri V. harveyi dioleskan diatas gelas objek. Kemudianlarutan kristal violet diteteskan pada preparat olesan bakteri sebanyak 2-3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan kertas isap. Kemudian preparat diteteskan larutan Kalium Iodida sebanyak 2-3 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Preparat dicuci kembali dengan air dan dikeringkan. Tahap selanjutnya preparat diteteskan alkoholdan didiamkan selama 30 detik, kemudian preparat dicuci dan dikeringkan kembali. Selanjutnya larutan safranin diteteskan dan didiamkan selama 30 detik, kemudian safranin dicuci dan dikeringkan dengan kertas isap. Kemudian preparat diamati dibawah mikroskop.

2.2 Karakterisasi Ekspresi Gen Hemolysin Isolat Pada Media Agar Darah.

Media agar darah blood agar, merupakan media differensial yang berfungsi untuk membedakan bakteri berdasarkan kemampuan mereka untuk melisiskan sel-sel darah merah. Pembuatan media agar darah dimulai dengan melarutkan TSA sebanyak 40 gram dalam akuades sebanyak 1000 ml Lampiran 5, kemudian pH media diukur sampai mencapai 7,3. Kemudian media dipanaskan di penangas sampai larut dan diaduk sampai homogen. Setelah itu media 6 disterilkan. Ketika menunggu proses sterilisasi media, hangatkan darah kambing segar sampai suhu 50 C sebanyak 5 dari volume total media atau sebanyak 50 ml yang sudah didefibrinasi dengan menggunakan larutan Na citrat. Dinginkan pula TSA steril sampai suhu mencapai 50 C Hadioeutomo, 1993. Secara aseptik kemudian darah kambing segar dituangkan ke dalam labu berisi TSA dan dicampur dengan cara memutar-mutar labu tersebut dengan hati- hati. Kemudian media dituangkan sebanyak 12 ml ke dalam cawan petri steril. Kemudian biakan bakteri ditanam dengan menggunakan ose dan digoreskan ke media agar darah dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang. Ekspresi dari gen hemolysin dapat diketahui dari ada tidaknya zona bening di sekitar goresankoloni dari kultur yang ditumbuhkan yang menunjukkan adanya lisis sel darah merah.

2.3 Ekstraksi DNA