7 selama 1 menit. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu
4
o
C selama 5 menit. Setelah terbentuk tiga lapisan, lapisan paling atas diambil dandi pindahkan
ke dalam eppendorf baru sebanyak 50-100 µl menggunakan mikropipet dan ditambahkan ethanol absolut atau isopropanol dingin dengan volume yang sama
dengan supernatan yang di pindahkan.Kemudian diinkubasi dalam freezer dengan suhu -20
o
C selama 20 menit. Langkah berikutnya eppendorf disentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pellet DNA dicuci
dengan 1 ml ethanol 70 bersuhu -20
o
C. Pellet dikeringkan di steril bench selama 15-30 menit. Kemudian aquabides ditambahkan ke dalam eppendorf
sebanyak 50 µl.
2.4 PCR
Langkah awal saat PCR adalah mempersiapkan ”master-mix”. Komposisi dalam ”master-mix” dapat dilihat pada tabel berikut :
Tabel 1. ”Master mix” yang digunakan untuk PCR
Reagent Volume µl
dH
2
O steril 18.5
Buffer 10 x 2,5
dNTP 2,5 mM 2.5
Forward primer 5 µM 1
Reverse primer 5 µM 1
Taq DNA Polymerase
0,2 Primer yang digunakan ;
Myhemo F1 5’-GATGGTCAGTGCCTCTCA-3’ Myhemo R1 5’-CCCAGTTGTATAGCGGTA-3’
Template
DNA yang digunakan adalah, V-U5, V-U7, V-U8, V-U9, V-U24, V-U27, V- U41NL dan V-V44.
8 PrimerMyhemo dirancang dengan mengambil potongan DNA gen
hemolysin yang sebelumnya telah dilakukan penelitian oleh Yuhana et al, 2009.
yang dimulai dari urutan basa forward ke-86 dan reverse urutan basa ke-586 Gambar 1 dengan target produk 518 bp.
Vh_hemo
gatggatcatgaataaaactattacgttacttagtgcattattactaccactaagttttgctcacgctgccgagccaacattgtct
ccagagatggtcagtgcctctcaagtaagaagcgcgcaagcgaaacaaacttacacttatgtccgctgctggtaccgcacca
gttattcaaaagatgaacctgcgaccgattgggaatgggcagaaaatccagacggcagttacttcacgcttgatggctactgg tggagttcggtttctttcaagaacatgttctacacagacacaccgcaaagtgttatcaagcaacgttgtgagcaaactctggac
ctagcaaatgaaaacgctgacatcaccttctttgcagccgataaccgtttctcctacaaccatactatctggagcaacgaccct gtcatgcagccagaccaaatcaacaaggtcgtagcattgggtgacagcttgtctgatacaggcaacatctttaatgcatcaca
atggcgattcccgaatccaaatagctggttcttgggacacttctcaaacggttttgtgtggactgagtacattgctcaagcgaaa
aacttaccgctatacaactgggctgtgggtggcgcggcaggcgaaaaccaatacatcgctctgactggtgtaggtgagcaag
tttcctcttacttggcatatgcgaaattagcgaaaaactacaagcctgctaataccctgtttacccttgagtttggtctaaatgac ttcatgaactacaaccgtagcgtgccagaagtgaaatcagactacgcggaagccttgattaaactgaccgatgcaggtgcga
agaacttgttgttgatgacactaccagatgcaacacgtgcaccacagtttacctactcgactcaagaagaaatcaacaagatc cgcgcgaagatcgtggaaatgaatgagttcatcaaagcacaagcggcgtattacactgcacaaggctacaacgttaccttgta
cgatacgcatgcactgtttgaaagcttaacagcaaatccagagcaacacggttttgtaaacgcgagccaagcttgccaagac atcaaccgctcttcatcggtagattacctataccatcactcattgcgttctgagtgtgcgtcttctggctctgataagtttgtattct
gggacgtaacacacccgaccacagcaacacaccactacgtggcagaaaaaatgctagaaagtacgaatcaattgtcaaacc atcctttctaa
Gambar 1.Sekuen Primer hemolysin Yuhana et al, 2009. Master-mix
yang telah dicampur divortex dan dispindown. Pencampuran bahan-bahan dilakukan di atas es on ice. Larutan master mix dimasukkan ke
dalam tabung PCR sebanyak 24,5 µl untuk setiap sampel. Setelah itu, ditambahkan 0,5 µl sampel DNA. Larutan kemudian divortex dan dispindown.
Kegiatan pencampuran harus dilakukan dengan cepat dan berhati-hati agar tidak terjadi kontaminasi silang antar sampel. Kemudian tabung PCR dimasukkan ke
Forward
Revers
9 dalam mesin PCR dengan program sebagai berikut; Pre start 94
o
C selama 2 menit, denaturasi 94
o
Cselama 1 menit, annealing 50
o
Cselama 1 menit dan ektension 72
o
C selama 1 menit yang dilakukan sebanyak 35 siklus. Untuk lebih jelasnya tahapan prosesPCR dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2Siklus pembentukan molekul DNA baru dalam proses PCR.Muladno, 2002.
10
2.5 Elektroforesis
