pengulangan langkah-langkah. Presipitat yang telah terkumpul ditambah dengan PBS sebanyak volume awal kuning telur. Selanjutnya campuran tersebut
dihomogenkan lalu dibagi aliquot 1 ml dalam tabung mikro. IgY yang telah dimurnikan disimpan dalam suhu -20
o
C sebelum digunakan.
3.2.2 Pemurnian Immunoglobulin G IgG
Serum kelinci yang digunakan dalam penelitian ini adalah serum yang telah memberikan reaksi positif terhadap antigen Fasciola gigantica dalam uji
AGPT. Serum dihasilkan dari kelinci yang telah diimunisasi dengan antigen ES Fasciola gigantica
. Sampel yang digunakan merupakan serum kelinci anti- Fasciola gigantica
domba yang diperoleh dari penelitian Satrija et al. 2010. Pemurnian Ig G dilakukan menggunakan Montage® Antibody Purification Kit
and Spin Columns PROSEP®-A Media. Media PROSEP®-A yang digunakan
dipre-ekuilibrasi dengan 10 ml Binding Buffer A dan disentifuse dengan spin column
pada kecepatan 500 x g selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Sampel tersebut disaring menggunakan Steriflip-GP filter 0,
2 µm. Serum sebanyak 10 ml ditambahkan dengan 10 ml Binding Buffer A
dimasukkan ke dalam spin column untuk disentrifuse pada kecepatan 500 x g selama 30 menit. Supernatan yang berada di dasar tabung dibuang dan spin
column dibilas menggunakan 20 ml Binding Buffer A. Larutan disentrifus kembali
pada kecepatan 500 x g selama 30 menit pada suhu 4
o
C untuk menghilangkan kontaminan yang tidak terikat. Supernatan yang berada di dasar tabung kembali
dibuang. Sebanyak 1,3 ml Neutralization Buffer C dan 10 ml Elution Buffer B2
ditambahkan ke dalam spin column. Selanjutnya disentrifuse kembali pada kecepatan 4500 x g selama 40 menit dengan suhu 4
o
C. Supernatan yang berada di dasar tabung diambil dan disaring dengan Amicon 30000, lalu disetrifus dengan
kecepatan 4500 x g selama 25 menit pada suhu 4
o
C. Cairan yang masih berada di saringan diambil untuk disimpan dalam mikrotube pada suhu -20
o
C.
3.2.3 Pengukuran Konsentrasi Immunoglobulin Y IgY
Pengukuran konsentrasi IgY dilakukan dengan menggunakan metode EGGstract® IgY Purrification System
PROMEGA. IgY yang akan diukur konsentrasinya dilarutkan dalam PBS dengan perbandingan volume 1:10.
Selanjutnya dimasukkan dalam kuvet spektrofotometer dan sebagai kontrol pembanding, digunakan aquades pada kuvet yang lain. Pengukuran konsentrasi
dilakukan pada panjang gelombang 280 nm untuk mendapatkan nilai absorbansi. Setelah nilai absorbansi didapatkan, dilakukan perhitungan sesuai dengan
ketentuan perhitungan EGGstract® IgY Purification System PROMEGA yaitu: Konsentrasi IgY mgml = nilai absorbansi OD
280
x 10 1.36
3.2.4 Pengukuran Konsentrasi Immunoglobulin G IgG
