3.2.3 Pengukuran Konsentrasi Immunoglobulin Y IgY
Pengukuran konsentrasi IgY dilakukan dengan menggunakan metode EGGstract® IgY Purrification System
PROMEGA. IgY yang akan diukur konsentrasinya dilarutkan dalam PBS dengan perbandingan volume 1:10.
Selanjutnya dimasukkan dalam kuvet spektrofotometer dan sebagai kontrol pembanding, digunakan aquades pada kuvet yang lain. Pengukuran konsentrasi
dilakukan pada panjang gelombang 280 nm untuk mendapatkan nilai absorbansi. Setelah nilai absorbansi didapatkan, dilakukan perhitungan sesuai dengan
ketentuan perhitungan EGGstract® IgY Purification System PROMEGA yaitu: Konsentrasi IgY mgml = nilai absorbansi OD
280
x 10 1.36
3.2.4 Pengukuran Konsentrasi Immunoglobulin G IgG
Pengukuran konsentrasi IgG dilakukan dengan metode Bradford. Reagen Bradford terdiri dari 100 mg Commasie Briliant Blue yang dilarutkan dalam 50 ml
etanol 95 dan ditambahkan 100 ml asam fosfat 85 wv. Larutan kemudian diencerkan dengan aquabides hingga volume larutan mencapai 1 liter dan disaring
menggunakan kertas saring. Reagen Bradford kemudian diencerkan dengan dua kali pengenceran menggunakan aquades dengan perbandingan 1:4 dan 1:9.
Larutan protein standar yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin BSA. Sebanyak 1 mg BSA dilarutkan ke dalam 1 ml aquades dan dihomogenkan.
Kemudian 11 tabung reaksi steril disiapkan dan diisi dengan larutan BSA serta aquabides steril Tabel 1. Setelah dihomogenkan, diam
bil 100 µl dari setiap tabung dan dimasukkan ke tabung baru yang sebelumnya telah diisi 5 ml larutan
Bradford. Larutan protein BSA digunakan untuk membuat grafik konsentrasi protein
standar, yang diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm sebelum mengukur konsentrasi sampel. Sampel berupa antigen ES yang akan
diperiksa dibuat duplo. Pembacaan konsentrasi sampel dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Tabel 1 Pengenceran larutan BSA dengan aquabides steril Tabung
Larutan BSA Aquabides steril
1 0 µl
1000 µl 2
100 µl 900 µl
3 200 µl
800 µl 4
300 µl 700 µl
5 400 µl
600 µl 6
500 µl 500 µl
7 600 µl
400 µl 8
700 µl 300 µl
9 800 µl
200 µl 10
900 µl 100 µl
11 1000 µl
0 µl
3.2.5 Pengujian ELISA
Pengujian ELISA dilakukan dengan dua konformasi lembar kerja yang bertujuan untuk optimasi hasil kedua konformasi sehingga diketahui konformasi
yang terbaik Gambar 3. Perbedaan kedua konformasi yang digunakan terletak pada antibodi penangkap dan antibodi pendeteksi yang digunakan. Pada ELISA
konformasi pertama menggunakan IgY sebagai antibodi penangkap dan IgG sebagai antibodi pendeteksi. Sebaliknya pada ELISA konformasi kedua
menggunakan IgG sebagai antibodi penangkap dan IgY sebagai antibodi pendeteksi.
A B
Gambar 3 Konformasi pengujian ELISA: A Konformasi pertama, B Konformasi kedua.
IgG antibodi pendeteksi
Substrat Konjugat anti-
rabbit
Microplate IgY antibodi
penangkap
Antigen ES Fasciola gigantica
IgY antibodi pendeteksi
Microplate IgG antibodi
penangkap Substrat
Konjugat anti- chicken
Antigen ES Fasciola gigantica
3.2.5.1 Konformasi 1: IgY sebagai Antibodi Penangkap dan IgG sebagai Antibodi Pendeteksi
IgY anti-Fasciola gigantica domba yang telah diukur konsentrasinya, diencerkan dalam larutan buffer bicarbonate dengan perbandingan 1:1000. Setiap
sumur microplate diisi dengan 100 µl IgY dan diinkubasi selama semalam pada
suhu 4 ºC. Microplate yang telah diinkubasi dibilas sebanyak tiga kali dengan 300 µl PBS Tween 0,05 dan dikeringkan.
Tahap selanjutnya adalah blocking menggunakan PBS-skim 5. Setiap sumur diisi dengan 100 µl susu skim dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Microplate yang telah diinkubasi
dicuci kembali dengan 300 µl PBS Tween sebanyak tiga kali dan dikeringkan.
Antigen ekskretori sekretori Fasciola gigantica yang diperoleh dari penelitian Satrija et al. 2009, diencerkan ke dalam larutan PBS dengan
perbandingan 1:100. Antigen kemudian dimasukkan 100 µl ke dalam sumur sesuai lembar kerja dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ºC dan kemudian
microplate d
icuci dengan 300 µl PBS Tween 0,05 sebanyak tiga kali lalu dikeringkan.
Antibodi pendeteksi yang digunakan adalah IgG anti-Fasciola gigantica domba. IgG diencerkan dengan konsentrasi 1:100, 1:1000, dan 1:10000. Sebanyak
100 µlml IgG anti-Fasciola gigantica domba yang telah diencerkan, dimasukkan ke dalam setiap sumur sesuai dengan lembar kerja dan diinkubasi selama 1 jam
pada suhu 37 ºC. Setiap sumur microplate dicuci kembali dengan 300 µl PBS
Tween 0,05 sebanyak tiga kali lalu dikeringkan Microplate
kemudian diisi dengan konjugate anti-rabbit yang telah diencerkan dengan pengenceran 1:10000 pada setiap sumur. Selanjutnya
microplate diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ºC . Setiap sumur microplate
kemudian dicuci ke mbali dengan 300 µl PBS Tween 0,05 lalu dikeringkan dan
diisi dengan substrat TMB pada setiap sumur dalam keadaan gelap. Selanjutnya diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu ruang. Terakhir dilakukan
pembacaan hasil ELISA dengan menggunakan ELISA reader.
3.2.5.2 Konformasi 2: IgG sebagai Antibodi Penangkap dan IgY sebagai Antibodi Pendeteksi
IgG anti-Fasciola gigantica domba yang telah diukur konsentrasinya, diencerkan dalam larutan buffer bicarbonate dengan perbandingan 1:1000. Setiap
sumur microplate diisi dengan 100 µl IgG dan diinkubasi selama semalam pada
suhu 4 ºC. Microplate yang telah diinkubasi dibilas sebanyak tiga kali dengan 300 µl PBS Tween 0,05 dan dikeringkan.
Tahap selanjutnya adalah blocking menggunakan PBS-skim 5. Setiap sumur diisi dengan 100 µl susu skim dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Microplate
yang telah diinkubasi dicuci kembali dengan 300 µl PBS Tween sebanyak tiga kali dan dikeringkan.
Antigen ekskretori sekretori Fasciola gigantica yang diperoleh dari penelitian Satrija et al. 2009, diencerkan ke dalam larutan PBS dengan
perbandingan 1:100. Antigen kemudian dimasukkan 100 µl ke dalam sumur sesuai lembar kerja dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ºC dan kemudian
microplate dicuci
dengan 300 µl PBS Tween 0.05 sebanyak tiga kali lalu dikeringkan.
Antibodi pendeteksi yang digunakan adalah IgY anti-Fasciola gigantica domba. IgY diencerkan dengan konsentrasi 1:100, 1:1000, dan 1:10000. Sebanyak
100 µlml IgY anti-Fasciola gigantica domba yang telah diencerkan, dimasukkan ke dalam setiap sumur sesuai dengan lembar kerja dan diinkubasi selama 1 jam
pada suhu 37 ºC. Setiap sumur microplate dicuci kembali dengan 300 µl PBS
Tween 0,05 sebanyak tiga kali lalu dikeringkan Microplate
kemudian diisi dengan konjugate anti-chicken yang telah diencerkan dengan pengenceran 1:10000 pada setiap sumur. Selanjutnya
microplate diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ºC . Setiap sumur microplate
kemudian dicuci ke mbali dengan 300 µl PBS Tween 0,05 lalu dikeringkan dan
diisi dengan substrat TMB pada setiap sumur dalam keadaan gelap. Selanjutnya diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu ruang. Terakhir dilakukan
pembacaan hasil ELISA dengan menggunakan ELISA reader.
3.2.6 Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan membandingkan nilai absorbansi dari konformasi pengujian ELISA dengan nilai cut off masing-masing pengujian.
Ratio = rata-rata absorbansi pengujian nilai cut off
Cut off adalah batas nilai absorbansi positif dan negatif dari suatu pengujian. Nilai
cut off ditentukan dengan rata-rata absorbansi kontrol negatif masing-masing
pengujian ditambah dengan tiga kali nilai standar deviasi Ath 1995. Hasil uji yang memiliki nilai perbandingan ratio yang paling besar merupakan pengujian
yang terbaik.
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi immunoglobulin Y IgY yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 9,57 mgml dan immunoglobulin G IgG adalah 3,75 mgml. Pada
penelitian ini, antibodi yang dilapiskan diencerkan 1:1000, sehingga besarnya protein IgY yang dilapiskan adalah 9,
57 µgml dan IgG sebesar 3,75 µgml. Pelapisan antibodi dengan pengenceran 1:1000 tersebut merupakan konsentrasi
yang cukup, karena menurut Stewart et al. 1990 konsentrasi suatu antibodi yang dilapiskan coating pada permukaan microplate berkisar 1-
10 µgml. Konformasi pertama uji ELISA dilakukan dengan menggunakan IgY
sebagai antibodi penangkap antigen ekskretori sekretori ES Fasciola gigantica diikuti IgG sebagai antibodi pendeteksi. Uji ELISA konformasi kedua
menggunakan IgG sebagai antibodi penangkap ES Fasciola gigantica diikuti IgY sebagai antibodi pendeteksi. Pada kedua uji tersebut, batas nilai penentuan deteksi
antigen ES Fasciola gigantica positif terdeteksi, dilihat dari perbedaan cut off pada masing-masing uji. Nilai cut off pada masing-masing uji dihitung dari rataan
nilai absorbansi kontrol negatif yang ditambahkan dengan tiga kali nilai standar deviasi. Kontrol negatif yang digunakan adalah larutan PBS yang tidak
menggunakan antigen ES Fasciola gigantica. Rataan nilai absorbansi hasil pengujian yang lebih besar dari nilai cut off merupakan hasil pengujian yang
bernilai positif. Sebaliknya, rataan nilai absorbansi hasil pengujian yang lebih kecil dari nilai cut off merupakan hasil pengujian yang bernilai negatif.
Nilai cut off pada ELISA konformasi pertama adalah 0,1026, yang didapatkan dengan menjumlahkan nilai absorbansi 0,0735 dengan 3 kali standar
deviasi 0,0097. Nilai cut off pada ELISA konformasi kedua dengan IgG sebagai antibodi penangkap dan IgY sebagai antibodi pendeteksi adalah 0,1172, yang
didapatkan dengan menjumlahkan nilai absorbansi 0,0648 dengan tiga kali standar deviasi 0,0175. Nilai cut off masing-masing pengujian dijabarkan pada Tabel 2.
Kategori