TEKNIK ANALISA MOLEKULER NUKLEOTIDA PENYUSUN GEN-GEN VIRUS AVIAN INFLUENZA

BAB V TEKNIK ANALISA MOLEKULER NUKLEOTIDA PENYUSUN GEN-GEN VIRUS AVIAN INFLUENZA

Untuk menganalisis gen-gen virus AI, langkah pertama yang dilakukan adalah mengamplifikasi gen yang dimaksud dan disekuensing. Pada analisis gen, biasanya panjang nukleotida yang dianalisis cukup panjang (partial) atau bahkan komplit (lengkap) menggunakan primer full leng atau primer lain yang didesain sendiri. Contoh primer untuk mengamplifikasi gen H5 yang didisain khusus adalah 2 pasang primer yaitu primer HA01- HA645 yang mengamplifikasi nukleotida 1-645, dan primer HA548-HA1215 yang mengamplifikasi nukleotida 548-1215 (Tabel 4; Susanti et al. 2008a). Tingginya tingkat mutasi pada gen HA, tidak semua isolat virus dapat diamplifikasi menggunakan primer tertentu. Jika dengan primer yang didesain sendiri tidak dapat teramplifikasi, sebagai alternatif dapat juga dicoba menggunakan primer lain yang telah dipublikasi di jurnal-jurnal ilmiah. Primer untuk amplifikasi secara lengkap masing-masing genom telah banyak dipublikasikan di jurnal-jurnal ilmiah, salah satunya adalah Hoffmann et al. (2001).

Tabel 4. Sekuen nukleotida primer untuk mengamplifikasi gen HA

Primer

Sekuen basa

Fragmen Produk gen

(bp)

1 a HA01: 5‟ H5 645 ATGGAGAAAA TAGTGCTTCTTCTTGC‟3

(basa 1- HA645: 5‟

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

GGAAATATAGGTGGTTGGGTTTTG‟3 2 a HA548F:

H5 667 5‟CCAACCRAGARGATCTTTTGG‟3*

(bada 548- HA1215R:

1215) 5‟AYRGCCTCAAACTGAGTGTTC‟3*

* Y=(CT), R=(AG) a didisain oleh Dr. Drh. IGN Mahardika & Dr. Drh. R. Susanti, MP

Contoh Metode Amplifikasi Gen HA Dengan Primer Spesifik

RNA isolat VAI subtipe H5N1 diekstraksi dengan Trizol ® LS Reagent

dilakukan dengan menggunakan Superscript TM

sesuai manual.

RT-PCR

III One-step RT-PCR system. Reaksi PCR dibuat sebanyak 50 l dengan komposisi 25 l 2x reaction mix, 2 l primer forward (10 M), 2 l primer reverse (10 M), 2 l Superscript III RT/Platinum Taq Mix, 3 l sampel RNA

dan ultrapure H 2 O sampai volume 50 l. Program PCR untuk primer HA01-HA645 adalah 45 o

C reaksi RT 60 menit, predenaturasi 95 o

C 5 menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi 95

C 40 detik, dan post ekstensi 72 o

C 30 detik, anneling 55 o C 30 detik, ekstensi 72

C 10 menit. Program PCR untuk primer HA548- HA1215 menggunakan suhu anneling 51 o

C (Susanti et al. 2008a). Isolat yang tidak dapat diamplifikasi dengan primer HA01-HA645, dilakukan

primer H5-155F (5‟ACACATGCYCAR

amplifikasi

menggunakan

dan H5-699R (5‟CTYTGRTTYAGTGTTGATGT‟3) (Lee et al. 2001) dengan

GACATACT‟3)

anneling 50 o

C (Susanti et al. 2008a). Adanya pita DNA spesifik hasil PCR diidentifikasi dengan elektroforesis pada gel agarose 2%.

60 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Purifikasi produk PCR

Pita-pita DNA spesifik produk PCR pada gel elektroforesis selanjutnya dipurifikasi, sebelum disekuensing. Purifikasi pita

DNA pada gel dapat dilakukan dengan kit, antara lain Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System sesuai manual dari produsen.

Pita DNA target pada gel elektroforesis dipotong dan dimasukkan pada tabung 15 ml, kemudian ditambah membrane binding solution sebanyak 10µl/10mg gel. Setelah divortek, diinkubasi

pada suhu 50-65 o

C sampai gel terlarut sempurna. Larutan gel dimasukkan pada SV minicolumn (pada tabung koleksi), diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit, dan disentrifuse pada 16000 g selama 1 menit. Tabung koleksi dan larutan isinya dibuang, SV minicolumn dipindahkan pada tabung koleksi baru. Pada SV minicolumn dimasukkan 700 ul membrane wash solution, kemudian disentrifus 16000 g selama 1 menit. Larutan di dalam tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali dimasukkan pada tabung koleksi. Pada SV minocolumn dimasukkan 500 µl membrane wash solution, kemudian disentrifus pada 16000 g selama 1 menit. Larutan di dalam tabung koleksi dibuang, SV minicolumn kembali dimasukkan pada tabung koleksi, kemudian disentrifus pada 16000 g selama

1 menit. SV minicolumn dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang bersih, kemudian dimasukkan 50 µl nuclease free water. Setelah

diinkubasi pada suhu kamar selama 1 menit, SV minocolumn disentrifus 16000 g selama 1 menit. DNA hasil purifikasi yang terdapat pada tabung 1,5 ml selanjutnya disimpan pada suhu -20

C sampai dilakukan sekuensing (Susanti et al. 2008a).

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Sekuensing

metode dideoksi menggunakan ABI automatic sequencer sesuai prosedur standart. Runutan nukleotida gen hasil sekuensing dan turunan asam aminonya dianalisis dengan software tertentu seperti MEGA 3.1 (Kumar et al. 2004). Sekuen nukleotida yang diperoleh dengan metode yang standart dan telah diyakini kebenarannya, didaftarkan di GenBank sebagai salah satu bentuk etika moral peneliti terhadap peningkatan khasanah keilmuan secara universal.

Metode analisis nukleotida dengan program MEGA 3.1

Data sekuen nukleotida yang akan dianalisa dapat bersumber dari hasil sekuensing atau data dari GenBank. Jika data berasal dari GenBank, sekuen nukleotida dari Genbank harus dipindahkan dulu dalam file Notepad. Sekuen nukleotida dari Genbank dikopi, kemudian program Notepad dibuka, dan di- klik edit, pilih paste. Semua nomor dan spasi harus dihilangkan sebelum dimasukkan pada program MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Caranya adalah dengan meng- klik edit, kemudian dipilih replace. Selanjutnya isikan pada “find what” dengan nomor atau spasi yang akan dihapus, kemudian klik replace all. Jika nomor yang dihapus banyak, penghapusan dilakukan satu per satu, sampai semua nomor dan spasi tidak ada lagi (yang ada hanya urutan nukleotida). Setelah selesai, kemudian disimpan dengan diberi nama.

62 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Langkah pertama dalam menggunakan program MEGA

3.1 adalah membuka program dengan cara meng-klik Mega 3.1 dua kali (Gambar 14a). Selanjutnya, di-klik alignment dan muncul beberapa pilihan (Gambar 14b). Kemudian dipilih (klik)alignment exploler/ CLUSTAL dan muncul alignment editor (Gambar 14c). Pada alignment editor muncul beberapa pilihan, dan dipilih create a new alignment kemudian di-klik (Gambar 14c). Akan muncul pertanyaan konfirmasi “Are you

building a DNA (yes) sequence alignment (otherwise choose

(No) for protein)? ” (Gambar 14d), dan dijawab/di-klik yes. Setelah diklik “yes” akan muncul menu-menu dari alignment explorer (Gambar 14e).

Untuk memasukkan data dari GenBank yang telah disimpan dalam file notepad, di- klik edit, kemudian dipilih insert sequence from file (Gambar 14f). Selanjutnya dicari file notepad yang akan dianalisis,dan klik open. Nama file dan sekuen nukleotida akan muncul di program (Gambar 14g). Semua sekuen nukleotidyang akan dianalisa, dimasukkan semua ke dalam program alignment, dengan cara yang sama.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gambar 14. Tampilan program MEGA pada persiapan

alignment

Untuk menganalisa data sekuen nukleotida hasil sekuensing, langkah pertama sampai muncul alignment explorer caranya sama dengan penjelasan sebelumnya. Setelah program alignment explorer terbuka, pilih/klik sequencer, kemudian klik edit sequencer file (Gambar 14h). Selanjutnya file

64 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 64 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Jika sekuensing dilakukan 2 arah (2 reaksi dengan 2 primer), hasil sekuen dengan primer F (forward) dan R (reverse) harus disepadankan terlebih dahulu. Sekuen nukleotida hasil sekuensing dengan primer F dan R, masing-masing dimasukkan dalam program alignment explorer. Sebelum disepadankan, sekuen nukleotida dengan primer R harus dibalik terlebih dahulu. Sekuen yang akan dibalik, di-klik kanan kemudian pilih/klik reverse complement. Selanjutnya, blok kedua sekuen (atau tekan Ctrl A), kemudian klik alignment, pilih/klik alignment by ClustalW, pilih/klik Ok. Jika ada pasangan basa yang tidak sama, perlu dicermati lagi. Caranya adalah sekuen di sebelah kanan/kiri dari basa yang meragukan/tidak jelas diblok, kemudian klik kanan, dipilih copy, kemudian nama file (di sebelah kiri) diklik kanan, pilih/klik open sequence file, pilih/klik search, pilih find, klik kanan kotak kosong di bawah sekuen yang disepadankan, klik paste, klik Ok.

Penyepadanan sekuen nukleotida dilakukan setelah semua sekuen dimasukkan dalam program alignment explorer seperti dijelaskan di atas (Gambar 15a). Untuk penyepadanan, semua sekuen nukleotida diblok, kemudian klik alignment, pilih alignment by ClustalW (Gambar 15b). Selanjutnya muncul tampilan seperti Gambar 15c, kemudian klik ok dan terjadi proses alignment (Gambar 15d).

65

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gambar 15. Tampilan prosedur alignment

66 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Untuk menyimpan data alignment, klik data, pilih exit alnExplorer (Gambar 16a) kemudian muncul pertanyaan “save the current alignment session to file? (Gambar 16b), di-klik yes dan diberi nama sesuai keinginan kemudian klik save (file mas) (Gambar 16c). Selanjutnya akan muncul pertanyaan “save the data to MEGA file? (Gambar 16d) Klik yes kemudian disimpan dalam file MEGA (Gambar 16e). Selanjutnya muncul form input data (Gambar 16f), dan setelah diisi klik Ok. Selanjutnya akan muncul pertanyaan konfirmasi “protein coding nucleotide sequence data ?” (Gambar 16g) dan dijawab ok. Selanjutnya akan muncul pertanyaan konfirmasi “open the data in MEGA?” (Gambar 16h). Setelah dijawab ok, akan muncul tampilan data seperti Gambar 17a.

Untuk mengambil data alignment ke file word, klik data dan pilih write data to file (Gambar 17b). Selanjutnya muncul exporting sequence data yang harus diisi (Gambar 17c). Pada kolom site per line diisi sesuai keinginan (biasanya 60; artinya 1 baris berisi 60 nukleotida). Pada kolom missing data and

alignment gabs, dipilih include sites with missing/ambiguous

data and gabs. Pada kolom writing site numbers, dipilih sesuai keinginan, yaitu at the end of line atau for each site. Setelah terisi semua, kemudian tekan ok, dan akan muncul tampilan seperti pada Gambar 17d. Selanjutnya semua data yang akan dikopi diblok, kemudian pilih/klik copy. File word dibuka, kemudian klik paste. Data di file word, font nya diganti courier new, karena ukuran setiap jenis huruf pada tipe courier new adalah sama.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Data alignment dalam bentuk Mega, selanjutnya dapat dianalisis jarak genetik (distance matrix) dan dibuat pohon filogenetiknya. Untuk membuat pohon filogenetik, file mega dibuka kemudian klik phylogeny, pilih construct phylogeny, pilih menu Neighbor-Joining (NJ) (Gambar 18a), sehingga muncul analysis preference (Gambar 18b) kemudian klik compute dan muncul pohon filogeni (Gambar 18c). Untuk menyimpan pohon filogeni tersebut ke file word, klik images dan pilih copy to clipboard. Selanjutnya file word dibuka, kemudian klik paste.

Untuk melihat distance matrix, pilih menu distances pada file mega, kemudian klik compute pairwise dan akan muncul analysis preference (Gambar 18d). Setelah diklik compute akan muncul matrik jarak genetik (Gambar 18e). Untuk menyimpan matrik jarak genetik, klik file dan pilih export/print distances. Selanjutnya akan muncul option pilihan (Gambar 18f), dan setelah diisi semua klik print/save matrix dan akan muncul tampilan seperti Gambar 18g. Matrik distance dapat dikopi dan dipindahkan ke file word. Jarak genetik 0.016 artinya adalah ada perbedaan 1,6% antara 2 unit taksonomi (isolat virus) berdasarkan karakter yang digunakan (dalam hal ini adalah nukleotida) atau ada persamaan (homologi) 98,4% atau 0.984. Untuk mengetahui overall distance dan standart error, klik distance

pilih distance&std.Err kemudian klik compute dan akan muncul hasil

dan pilih

compute

overall mean,

overal mean distance dan standart error.

68 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gambar 16. Proses menampilkan data alignment pada MEGA

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gambar 17. Proses penyimpanan data alignment ke word

70 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

18e

18f

Gambar 18. Pembuatan pohon filogeni dan jarak genetik

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya