DINAMIKA MOLEKULER VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 DI INDONESIA

BAB VI DINAMIKA MOLEKULER VIRUS AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1 DI INDONESIA

Sebagai patogen intraseluler, virus avian influenza (VAI) mempunyai mekanisme untuk menghindari respon imun hospes sehingga virus dapat bertahan hidup dan bereplikasi dalam tubuh hospes. Peningkatan kemampuan virus untuk menghindari sistem imun hospes, secara langsung berkorelasi dengan peningkatan patogenesitas virus. VAI mempunyai berbagai mekanisme untuk menghindar dari sistem imun bawaan dan respon imun perolehan (adaptif) hospes (Coleman 2007). Implikasi dari berbagai mekanisme penghindaran dari sistem kekebalan hospes tersebut, adalah mutasi pada gen-gen yang terlibat pada mekanisme tersebut. Hal inilah yang mengakibatkan terjadinya dinamika molekuler VAI dari berbagai isolat, dari waktu ke waktu. Dari 8 genom VAI, hanya beberapa gen yang terlibat pada mekanisme patogenesitas dan adaptasi lintas spesies.

Berdasarkan analisa data gen virus avian influenza subtipe H5N1 di GenBank diketahui bahwa data yang paling banyak teregristrasi di GenBank adalah gen HA (sebanyak 565 isolat), disusul berturut-turut gen NA (262 isolat), gen NS (173 isolat), gen PB1 (155 isolat), dan gen PB2 (137 isolat). Dari 5 gen yang dianalisa, gen HA yang paling banyak memiliki variasi akibat substitusi nonsinonim (Susanti 2012a).

72 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gen Hemaglutinin (HA)

Glikoprotein yang disandi gen HA, merupakan faktor patogenesitas virus influenza. HA berperan sebagai pengikat reseptor sel, fusi membran serta target utama netralisasi oleh antibodi sel hospes (Cross et al. 2001; Hulse et al. 2004; Hoffman et al. 2005; Gambaryan et al. 2006). Protein HA disintesis sebagai polipeptida 76 kDa. Setelah translasi di retikulum endoplasma, HA mengalami maturisasi di aparatus Golgi menjadi homotrimer HA masing-masing 220 kDa. Setiap monomer

awalnya merupakan prekursor polipeptida tunggal (HA 0 ) kemudian dipotong menjadi 2 subunit yaitu HA 1 dan HA 2 . Kedua subunit ini dihubungkan oleh ikatan disulfida antara residu asam amino 14 dari HA 1 dengan residu asam amino 137 dari HA 2 . Tanpa proteolisis HA menjadi HA 1 dan HA 2 , proses fusi virus dengan membran endosom tidak terjadi sehingga virus bersifat noninfeksius (Steinhauer 1999).

Cleavage site (daerah pemotongan) adalah sekuen asam

amino sebagai daerah pemotongan prekursor HA (HA 0 ) menjadi HA 1 dan HA 2 secara enzimatis oleh protease sel hospes, sehingga proses fusi dengan membran endosom pada saat infeksi VAI ke dalam sel hospes dapat terjadi. Daerah pemotongan

menentukan

VAI. Daerah pemotongan HA 0 tergantung pada keberadaan asam amino basa

patogenesitas

arginin (R) atau lisin (K). Kebanyakan VAI non-virulen atau low pathogenic mempunyai satu asam amino basa (monobasic) pada daerah pemotongan, namun strain highly pathogenic mempunyai lebih dari satu asam amino basa (polybasic) pada posisi tersebut

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

(Munch et al. 2001). Sekuen HA dengan daerah pemotongan monobasic (contoh: HA 1 -PSIQVR-GL-HA 2 ) dapat dipotong oleh tryptase yang dihasilkan sel epitel traktus respirasi dan pencernaan (Whittaker 2001; Chen et al. 2004). Secara in vitro, daerah pemotongan HA monobasic juga dapat dipotong oleh trypsin-like enzyme , seperti faktor pembeku darah “Xa”, mini plasmin dan protease bakteri (Murakami et al. 2001). Protease dari Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa juga dilaporkan dapat memotong daerah pemotongan monobasic (Zhirnov et al. 2002).

Sekuen HA dengan daerah pemotongan polybasic (contoh: HA 1 -KKREKR-GL-HA 2 ), memungkinkan proses proteolitik dapat dilakukan oleh protease lain seperti furin dan proprotein konvertase 6 (PC6) yang terdapat di aparatus Golgi semua sel (Horimoto et al. 1994). Enzim proteolitik furin mengenal sekuen asam amino motif B-X-B-R (B=asam amino basa, X=asam amino nonbasa) (Walker et al. 1994).Virus AI dengan daerah pemotongan polybasic mempunyai jaringan distribusi yang tidak terbatas dan menyebabkan infeksi sistemik yang fatal (Whittaker 2001; Chen et al. 2004). Daerah pemotongan polybasic pada VAI H5N1 bertanggung jawab terhadap infeksi sistemik sehingga virus dapat diisolasi dari darah, cairan serebrospinal dan feses (WHO et al. 2005).

Identifikasi gen penyandi sekuen asam amino cleavage site VAI subtipe H5N1 isolat unggas air di Jawa Barat menunjukkan bahwa semua virus H5N1 (21 isolat) mempunyai asam amino polibasik dengan 2 pola sekuen yaitu QRERRRKKR

74 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

(20 isolat) dan QRESRRKKR (1 isolat). Hal ini menunjukkan bahwa semua isolat tersebut termasuk strain patogenik tinggi (highly pathogenic avian influenza /HPAI) (Susanti et al. 2008c). Sekuen daerah pemotongan QRERRRKKR khas pada strain patogenik VAI H5N1 penyebab kematian unggas di Indonesia dan Vietnam (Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Titik pemotongan QRESRRKKR adalah khas pada VAI H5N1 penyebab kematian manusia di Indonesia tahun 2005-2007 (CDC 2007).

Analisis sekuen asam amino daerah pemotongan HA semua VAI H5N1 penyebab kematian manusia dan unggas di Indonesia

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) menunjukkan bahwa semua VAI H5N1 yang bersirkulasi di Indonesia memiliki karakter molekuler HPAI dengan sekuen daerah pemotongan bervariasi (Tabel 5; Susanti 2012a). Pola sekuen asam amino daerah pemotongan QRERRRKKR adalah khas penyebab wabah kematian unggas di Hong Kong tahun 1997 dan negara-negara Asia (2003-2007) (Guan et al. 2004; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Isolat VAI H5N1 penyebab wabah kematian unggas di Indonesia tahun 2003-2004 mempunyai pola asam amino daerah pemotongan QRERRRKKR, kecuali isolat A/Chicken/Kulonprogo/BBVet-XIII yang mengalami delesi satu asam amino lisin (K) sehingga mempunyai pola daerah pemotongan QRERRK_R. Mulai tahun 2005, muncul isolat VAI H5N1 dengan sekuen daerah pemotongan QRESRRKKR, QIERRRKKR, QRERRREKR,

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

QGERRRKKR, QRERRRK_R dan QRE_RRKKR (Tabel 5; Susanti 2012a).

Tabel 5. Variasi sekuen asam amino daerah pemotongan virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Daerah Tahun Spesies/Isolat Pemotongan

Isolasi

1 QRERRRKKR 2003- Manusia, ayam, itik, puyuh,

kalkun, babi

2 QRESRRKKR 2005- Manusia, ayam, itik, entok,

puyuh

3 QRERRRK_R 2004 A/Chicken/Kulonprogo/BBVet- XIII-1

A/Chicken/Kulonprogo/BBVet- XIII-2

4 QIERRRKKR 2005- A/Duck/Pali/BVW1358/2005 2007

A/Chicken/Badung/BBVD- 302/2007

5 QRERRREKR 2005- A/Duck/Bufeleng BPPVI/2005

A/Chicken/Denpasar/BBVD- 182/2007

6 QRE_RRKKR 2005 A/Chicken/Wates83/2005

7 QGERRRKKR 2005 A/Duck/Badung Bali/05

8 QREGRRKKR 2007 A/Chicken/Inhu/BPPVRII/2007

Sejak Juli 2005 sampai 2007, muncul kasus kematian manusia Indonesia akibat VAI H5N1 dengan sekuen daerah pemotongan QRESRRKKR. Namun pada tahun 2006 juga ditemukan VAI H5N1 dengan sekuen daerah pemotongan QRERRRKKR pada isolat manusia. Substitusi daerah pemotongan HA virus AI subtipe H5N1 (dari QRERRRKKR

76 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 76 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Pada HA1 terdapat daerah antigenik, kantong pengikat reseptor, residu pengikat reseptor dan posisi glikosilasi. Daerah antigenik fungsinya berkaitan erat dengan pertahanan terhadap respon imun hospes, sementara kantong pengikat reseptor fungsinya berkaitan dengan daya adaptasi pada hospes dan patogenesitas strain. Posisi glikosilasi turut menentukan afinitas ikatan reseptor serta pengenalan daerah antigenik oleh antibodi (Hulse et al. 2004; Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Peptida fusi pada ujung N subunit HA2 berperan pada fusi membran saat infeksi virus ke dalam sel hospes (Cross et al. 2001).

Meskipun tingkat mutasi HA paling tinggi dibanding protein lain, namun pada bagian-bagian tertentu dari HA bersifat stabil pada semua influenza A (Wagner et al. 2005). Pada ujung C glikoprotein HA mempunyai 3 residu sistein pada posisi 551, 559, 562 yang bersifat sekuen stabil (Wagner et al. 2005). Bagian transmembran HA terdiri dari 10-11 asam amino, dan 5 diantaranya bersifat stabil pada semua influenza A. Meskipun sekuen ini tidak esensial untuk perakitan dan daya infeksi virus (Jin et al. 1994), namun interaksi bagian transmembran HA dengan protein internal sangat menentukan bentuk virion (Jin et al. 1997). Asam amino pertama (D:aspartat) dan terakhir

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

(P:prolin) dari subunit HA1 juga bersifat stabil pada semua influenza A (Stevens et al. 2006).

Daerah antigenik adalah asam amino sebagai target pengenalan dan netralisasi oleh antibodi. Substitusi asam amino pada daerah antigenik meningkatkan potensi terjadinya hanyutan antigenik (antigenic drift), karena berkaitan dengan mekanisme virus untuk menghindar dari respon imun hospes. Substitusi ini disebabkan tekanan seleksi untuk menghindar dari respon antibodi hospes, termasuk penghindaran pengenalan antibodi yang terbentuk akibat vaksinasi (Plotkin & Dushoff 2003; Smith et al. 2004; Campitelli et al. 2006).

Pada glikoprotein HA dikenal 5 epitop daerah antigenik sebagai target netralisasi antibodi (Smith et al. 2004). Penentuan

5 epitop (A sampai E) daerah antigenik tersebut didasarkan pada struktur HA virus influenza A subtipe H3N2 penyebab pandemi flu di Hongkong 1968. Daerah antigenik tersebut tampaknya tidak bersifat linier, melainkan konformasional. Masing-masing epitop terbentuk pada struktur tersier molekul HA, sehingga asam-asam amino yang saling berjauhan bersama-sama membentuk satu epitop. Kelima epitop tersebut terdapat pada 25 residu asam amino subunit HA1. Epitop A dibentuk oleh residu asam amino 135, 124, 133, 145, 144, 142, dan 131. Epitop B dibentuk oleh asam amino 156, 197, 189, 190, 157, 196, 193 dan 158. Epitop C dibentuk oleh asam amino 276, 278, 275 dan 299. Epitop D dibentuk oleh asam amino 226, 121 dan 172. Epitop E dibentuk oleh residu asam amino 262, 62 dan 83 (penomoran menurut H3) (Plotkin & Dushoff 2003).

78 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Asam amino daerah antigenik pada 5 isolat VAI unggas air (IPB1-RS s/d IPB5-RS) sama dengan isolat Gs/GD/1/96. Isolat VAI IPB6-RS mengalami substitusi nonsinonim pada 4 asam amino daerah antigenik (N45D, S84N, H138Q dan R140S), sementara 3 isolat VAI unggas air lainnya (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS) mengalami substitusi nonsinonim pada 8 asam amino daerah antigenik (N45D, S84N, A86T, N124D, H138L, R140S, S141P dan K189R) (Susanti et al. 2008a). Hasil analisis pada 17 posisi asam amino antigenik site, hanya 3 posisi yang tidak mengalami substitusi (Tabel 6; Susanti 2012a). Demikian juga analisis pada sekuen daerah antigenik, semunya (4 daerah) mengalami substitusi (Tabel 7; Susanti 2012a). Substitusi asam amino pada daerah antigenik merupakan salah satu pendorong evolusi gen hemaglutinin (Shih et al. 2007).

Tabel 6. Variasi asam amino antigenik site virus AI subtipe H5N1

di Indonesia

No Posisi Variasi

Variasi Asam

No Posisi Asam

S, K, R, T,Q,D, N

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Tabel 7. Variasi asam amino daerah antigenik virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Daerah

Variasi

Antigenik

1 Antigenik 1 RINHFEKIQI, RINHFEKIQR, RINHFKKIQI, RIKHFEKIRI, RINRFEKIQI, RINHFEKTQI, RINHFEKLQI, RINHFEKIRI, STNHFEKIRI

2 Antigenik 2 SPSFFRNVVW, KSSFFRNVVW, RSSFFRNVVW, RSSFFRNVMW, TSSFFRNVVW, RASFFRNVVW, DPSFFRNVVW, TPSFFRNVVW, RPSFFRNVVW, SPSFFRNGVW, RSSFFRNGVW, WSSFFRNVVW, QSSFFRNVVW, SPSFFRNVIW, NPSFFRNVVW, SHSFFRNVVW, SSSFFRNVVW

3 Antigenik 3 LYQNPTTYIS, LYQNPTTHIS, LYQNPSTYIS,

LYQNQITYIS, LYQNPITYIS, LYQNLTTYIS, LYQNSITYIS, LYQNPATYIS, LYQNPTTYIF

4 Antigenik 4 SKVN, SKVH, TKVH, PKVN

Substitusi asam amino 138 dan 140 juga berhubungan dengan patogenesitas virus, karena asam amino ini juga terlibat dalam ikatan dengan reseptor (Hulse et al. 2004). Substitusi N124S, L138Q dan K189R pada genotipe Z kemungkinan berhubungan dengan adaptasi virus pada mamalia (Guan et al. 2004). Daerah antigenik pada asam amino 189 (R atau K) pada isolat unggas air dalam penelitian ini sama dengan isolat Hongkong, Vietnam dan Singapura (Hoffman et al. 2005). Daerah antigenik A-E pada asam amino 86, 138, 140 dan 141 isolat unggas dan manusia di Indonesia dan Vietnam mengalami seleksi positif (Smith et al. 2006). Analisis sekuen asam amino subunit HA1 pada virus influenza A tahun 1968-2005 berhasil mengidentifikasi 95 substitusi pada 63 asam amino, dan 57 substitusi diantaranya adalah asam amino daerah antigenik (Shih

80 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 80 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Residu pengikat reseptor adalah asam amino yang berikatan secara langsung dengan reseptor sel hospes. Residu pengikat reseptor menentukan spesifisitas ikatan virus dengan reseptor sel hospes. Bagian dari HA yang berikatan dengan reseptor adalah asam amino nomor 222 dan 224 (penomoran menurut H5). Glikoprotein HA virus influenza strain manusia yang mempunyai asam amino leusin pada posisi 222 dan serin pada 224 hanya dapat berikatan dengan asam sialat α-2,6NeuAcGal. Sementara HA virus influenza strain unggas yang mempunyai asam amino glutamin pada posisi 222 dan glisin pada 224 hanya dapat berikatan dengan asam sialat α-2,3NeuAcGal (Vines et al. 1998; Zhou et al. 1999; Suzuki et al. 2000; Leung 2007). Residu pengikat reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan reseptor avian α-2,3NeuAcGal (Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006; Leung 2007). Namun, teori yang menyatakan bahwa ayam hanya mempunyai reseptor α-2,3NeuAcGal dan manusia hanya mempunyai reseptor α-2,6NeuAcGal tampaknya tidak berlaku lagi. Pada sel epitel tak bersilia dan sel goblet saluran respirasi manusia predominan mempunyai asam sialat α-

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

2,6NeuAcGal (Ibrecevich et al. 2006; Thompson et al. 2006), namun pada jaringan trakheobronkhial bersilia mengandung α- 2,6NeuAcGal dan α-2,3NeuAcGal meskipun dalam proporsi terbatas (Thompson et al . 2006). Pada manusia, reseptor α- 2,3NeuAcGal juga dapat ditemukan pada pneumosit tipe II (Ibrecevich et al. 2006). Pada saluran respirasi dan pencernaan ayam dominan mempunyai reseptor α-2,3NeuAcGal, namun reseptor α-2,6NeuAcGal juga dapat ditemukan pada paru-paru (minor) maupun sel epitel kolon (mayor) (Kim et al. 2005). Seperti juga ayam, sel epitel kolon burung puyuh juga banyak terdapat reseptor α-2,6NeuAcGal. Hal ini menunjukkan bahwa ayam dan puyuh berpotensi sebagai hospes intermediate untuk transmisi VAI ke manusia (Guo et al. 2007).

Residu pengikat reseptor pada VAI H5N1 isolat unggas air di Jawa Barat adalah glutamin (Q) dan glisin (G) berturut-turut pada asam amino nomor 222 dan 224 (Susanti et al. 2008a). Demikian juga residu pengikat reseptor pada semua VAI H5N1 isolat hewan dan manusia di Indonesia adalah glutamin (Q222) dan glisin (G224) (Tabel 8; Susanti 2012a). Residu pengikat reseptor seperti itu dianggap spesifik berikatan dengan reseptor avian α-2,3NeuAcGal (Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006; Leung 2007).

Substitusi asam amino pada residu pengikat reseptor menyebabkan perubahan spesifisitas ikatan reseptor. Substitusi S224G dan L222Q (penomoran menurut H5) pada virus influenza

strain manusia menyebabkan virus ini dapat bereplikasi pada intestinum itik (Vines et al. 1998). Bahkan disebutkan bahwa

82 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 82 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Virus AI yang menginfeksi manusia dapat mengalami mutasi pada residu pengikat reseptor, sehingga afinitas HA terhadap α-

2,3NeuAcGal menurun dan afinitas terhadap α-2,6NeuAcGal meningkat (Harvey et al. 2004). Pergeseran spesifisitas reseptor ini terjadi pada awal setelah transmisi virus pada hospes (Matrosovich et al. 2000). Perubahan spesifisitas reseptor akibat tekanan seleksi juga terjadi pada kultur virus secara in ovo. Virus influenza strain manusia yang ditumbuhkan pada sel amnion (mempunyai reseptor α-2,6NeuAcGal dan α-2,3NeuAcGal), sampai pasase ke-2 masih mempertahankan spesifisitas reseptor pada α-2,6NeuAcGal. Sementara jika dikultur pada sel alantois yang hanya mempunya i reseptor α-2,3NeuAcGal menyebabkan substitusi L222Q sehingga spesifisitas reseptor bergeser dari α- 2,6NeuAcGal menjadi α-2,3NeuAcGal (Ito et al. 1997). Hal ini menunjukkan bahwa defisiensi suatu reseptor spesifik terhadap residu pengikat reseptor virus influenza merupakan tekanan seleksi yang memacu terjadinya substitusi sehingga kompatibel

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Kantong pengikat reseptor adalah residu asam amino yang terlibat mempertahankan integritas struktur residu pengikat reseptor serta mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor sel hospes. Secara struktural, terdapat 3 elemen dasar kantong pengikat reseptor VAI H5N1 ya itu α-helix (asam amino HA1 188- 190), loop-130 (asam amino HA1 134-138) dan loop-220 (asam amino HA1 221-228) (Stevens et al. 2006). Residu asam amino kantong pengikat reseptor yang bersifat stabil adalah Y94, W149, H179. Sekuen stabil ini (Y94, W149 dan H179) (penomoran menurut H5) terlibat kontak secara langsung dengan residu asam sialat reseptor hospes (Stevens et al. 2006). Substitusi asam amino kantong pengikat reseptor menyebabkan perubahan pelipatan protein sehingga mempengaruhi afinitas ikatan virus pada reseptor (Harvey et al. 2004; Gambaryan et al. 2006; Auewarakul et al. 2007).

Virus influenza strain avian yang mengalami perubahan afinitas pada reseptor sel hospes berpeluang memunculkan strain virus yang mempunyai afinitas tinggi pada sel mamalia (Campitelli et al. 2006). Substitusi asam amino 129 dan 134 pada subunit HA1 dari VAI H5N1 isolat manusia menyebabkan pergeseran spesifisitas ikatan reseptor dari α-2,3NeuAcGal menjadi α- 2,3NeuAcGal dan α-2,6NeuAcGal (Auewarakul et al. 2007).

Variasi asam amino kantong pengikat reseptor terjadi dapa VAI isolat manusia dan hewan di Indonesia (Tabel 8; Susanti 2012a). Virus AI subtipe H5N1 isolat unggas air (IPB1-RS, IPB2-

84 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

RS, IPB3-RS, IPB4-RS dan IPB5-RS), mengalami 3 substitusi nonsinonim pada asam amino kantong pengikat reseptor (L175M, E212K dan P217S). VAI H5N1 isolat IPB6-RS mengalami 7 substitusi nonsinonim asam amino kantong pengikat reseptor (D94N, T108I, D126E, H138Q, R140S, E212K dan P217S). Tiga VAI H5N1 isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS) mengalami substitusi nonsinonim pada 10 asam amino pembentuk kantong pengikat reseptor (D94S, T108I, N124D, D126E, H138L, R140S, D183N, K189R, E212K dan P217S) (Susanti et al. 2008a). Patogenesitas VAI H5N1 pada hospes sangat dipengaruhi oleh susunan asam amino kantong pengikat reseptor. VAI H5N1 dengan asam amino D97, I108, E126, L138, K212 dan S217 menunjukkan fenotipe highly pathogenic, sementara asam amino T108, D126, H/Q138 menunjukkan fenotipe patogenik moderat (Hulse et al. 2004). Tiga VAI H5N1 isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS dan IPB9-RS) kemungkinan mempunyai fenotipe patogenik tinggi, karena mempunyai asam amino kantong pengikat reseptor khas D97, I108, E126, L138, K212 dan S217. Sementara 5 VAI H5N1 isolat unggas air lainnya (IPB1-RS s/d IPB5-RS) mempunyai asam amino khas (T108, D126, H138) penanda fenotipe patogenik moderat. Fenotipe patogenesitas VAI H5N1 isolat unggas air dalam penelitian ini perlu dikaji lebih lanjut dengan uji biologis (Susanti et al. 2008a).

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Tabel 8. Variasi asam amino kantong pengikat reseptor virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Nomor Variasi

Variasi asam

28 Alpha helix TRL, TKL, KSL, TML

H 29 Loop 130

ACP, ACS, PKN, SCS

Virus AI subtipe H5N1 garis Asia menunjukkan jumlah asam amino yang mengalami seleksi positif meningkat dari tahun ke tahun, terutama pada daerah antigenik, posisi glikosilasi dan kantong pengikat reseptor. Hal ini kemungkinan berhubungan dengan peningkatan patogenesitas dan kemampuan virus untuk transmisi ke manusia (Campitelli et al. 2006). Mekanisme virus untuk menghindar dari sistem imun hospes merupakan tekanan untuk mutasi secara gradual sehingga muncul strain-strain virus baru yang secara imunologik berbeda (hanyutan antigenik) (Munch et al. 2001; Smith et al. 2004). Hanyutan antigenik berjalan lambat namun progresif dan cenderung menimbulkan

86 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 86 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Peptida fusi adalah peptida yang berperan pada fusi membran virus influenza saat infeksi virus ke dalam sel hospes, terdapat pada ujung N dari HA2. Peptida ini bersifat stabil pada semua influenza A, terdiri dari 23 asam amino hidrofobik kaya glisin (G). Sebelas asam amino pertama ujung N dari HA2 (GLFGAIAGFIE) lebih stabil dibandingkan 12 asam amino berikutnya. Hidrofobisitas asam amino pada peptida fusi sangat diperlukan untuk destabilisasi membran, sehingga fusi membran virus influenza dapat dilakukan dengan mudah. Substitusi glisin (G) menjadi asam amino serin (S), leusin (L) atau fenilalanin (F) secara signifikan menurunkan fusi virus influenza. Namun substitusi asam amino pada peptida fusi menjadi glisin juga menurunkan kemampuan fusi. Hal ini menunjukkan bahwa stabilitas glisin diperlukan bukan hanya karena hidrofobisitasnya tetapi juga strukturnya (Cross et al. 2001).

Sekuen asam amino peptida fusi VAI H5N1 asal hewan

dan manusia di

3 varian, yaitu GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG

Indonesia

ada

isolat), GLFGAIAGFIEG

isolat), GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG (1 isolat) (Tabel 9; Susanti 2012a). Sekuen peptida fusi VAI H5N1 isolat unggas air di Jawa Barat sama dengan isolat VAI H5N1 penyebab wabah di Asia (Susanti et al. 2008a), yaitu GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG. Jika dibandingkan dengan peptida fusi virus influenza subtipe H3N2 penyebab pandemi influenza di Hongkong tahun 1968

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

(GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG), peptida fusi ini hanya mengalami substitusi 3 asam amino selama hampir 40 tahun (Cross et al. 2001; Smith et al. 2006).

Tabel 9. Variasi sekuen asam amino peptida fusi virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Peptida fusi

Isolat, tahun

1 GLFGAIAGFIEGG Ayam, manusia, itik, kalkun, babi, angsa, WQGMVDGWYG entok, puyuh 2003-2010

2 GLFGAIADFIEGG A/Chicken/west jawa 1074/2003 WQGMVDGWYG

3 GLFGAIAGFIEGG A/Chicken/salatiga/BBVet-I/2005 WQGMIDGWYG

A/Chicken/Kulon Progo/BBVW-822-545/2007 A/Chicken/Kulon Progo/BBVW-922-511/2007 A/Chicken/Sleman/BBVW-493-214/2007

Sekuen GLFGAIADFIEGGWQGMVDGWYG (mutasi G8D dari ujung N HA2) kemungkinan mengakibatkan penurunan kemampuan fusi membran virus saat infeksi ke dalam sel hospes. Hidrofobisitas asam amino pada peptida fusi sangat diperlukan untuk destabilisasi membran, sehingga fusi membran virus influenza dapat dilakukan dengan mudah. Substitusi glisin (G) menjadi asam amino serin (S), leusin (L) atau fenilalanin (F) secara signifikan menurunkan fusi virus influenza. Namun substitusi asam amino pada peptida fusi menjadi glisin juga menurunkan kemampuan fusi. Hal ini menunjukkan bahwa stabilitas glisin diperlukan bukan hanya karena hidrofobisitasnya tetapi juga strukturnya (Cross et al. 2001). Sekuen GLFGAIAGFIEGGWQGMIDGWYG pada 4 isolat ayam di Indonesia mempunyai mutasi V18I ujung HA2. Peptida fusi

88 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 88 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Posisi glikosilasi adalah sekuen asam amino yang berpotensi

oligosakarida. Penempelan oligosakarida ini sangat penting dalam orientasi pelipatan HA untuk berikatan dengan reseptor sel atau antibodi. Substitusi asam amino pada posisi glikosilasi merupakan strategi virus untuk mask (menutup) atau unmask (membuka) daerah antigenik dari pengenalan antibodi sel hospes (Rajakumar et al. 1990; Hoffmann et al 2005; Campitelli et al. 2006; Stevens et al. 2006). Penambahan glikan pada posisi berdekatan dengan asam amino residu pengikat reseptor dapat mengubah efisiensi ikatan HA pada reseptor sel (Mishin et al. 2005). Posisi glikosilasi asam amino terkait asparagin (N) dengan pola sekuen NXS dan NXT yang berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida (Hoffman et al. 2005; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Posisi glikosilasi biasanya tidak stabil karena berhubungan dengan patogenesitas dan imunogenesitas. Posisi glikosilasi pada asam amino 154-156 dan 193-195 berdekatan dengan daerah antigenik dan residu pengikat reseptor, sehingga mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor dan mekanisme virus VAI menghindar respon imun hospes (Matrosovich et al. 1999; WHO 2005b; Campitelli et al. 2006; Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006). Penambahan posisi glikosilasi pada asam amino 84-

86 merupakan mekanisme virus untuk menghindar pengenalan

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Posisi glikosilasi dari VAI H5N1 isolat hewan dan manusia di Indonesia menunjukkan bahwa 2 dari 7 posisi glikosilasi masih konserv/stabil dengan pola NNS (posisi 10-12) dan NVT (posisi 23-25) pada semua isolat yang dianalisis (Tabel 10; Susanti 2012a). Posisi glikosilasi dari VAI H5N1 isolat unggas air di Jawa Barat menunjukkan bahwa asam amino nomor 84-86 dan 154- 156 pada 5 isolat unggas air (IPB1-RS s/d IPB5-RS) tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Asam amino isolat unggas air IPB6-RS mengalami substitusi pada A156T, sehingga terbentuk sekuen N-S-T pada asam amino 154- 156 yang berpotensi sebagai posisi glikosilasi. Akibat substitusi pada A86T dan A156T pada 3 VAI isolat unggas air (IPB7-RS, IPB8-RS, IPB9-RS) menginduksi munculnya posisi glikosilasi pada asam amino 84-86 dan 154-156 (Susanti et al. 2008a). Penambahan glikan pada asam amino residu pengikat reseptor menurunkan efisiensi ikatan HA pada reseptor sel (Mishin et al. 2005). Substitusi S223N dapat meningkatkan sensitivitas uji HI melalui perubahan spesifisitas reseptor dan/atau ikatan antigen- antibodi (Hoffmann et al. 2005). Penambahan glikosilasi pada protein NA juga terlibat dalam peningkatan virulensi VAI (Hulse et al. 2004).

Isolat VAI tahun 2003-2006, asam amino posisi 84-86 kebanyakan memiliki sekuen NPA (tidak berpotensi sebagai

90 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 90 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Dari 15 isolat, hanya 2 isolat VAI tahun 2003 (A/chicken/Legok dan A/Ck/Indonesia 2A) yang asam amino posisi 154-156 berpotensi sebagai glikosilasi yaitu NST. Mulai tahun 2004, posisi 154-156 mengalami mutasi sehingga sebagian besar isolat tahun 2004 dan seterusnya memiliki potensi glikosilasi pada posisi tersebut (Tabel 10; Susanti 2012a). Substitusi pada A156T pada VAI H5N1 garis Asia dihubungkan dengan adaptasi virus pada hospes unggas darat dan meningkatkan virulensi pada unggas darat ini (WHO 2005b; Smith et al. 2006; Stevens et al. 2006). Asam amino nomor 154- 156 pada beberapa isolat mengalami mutasi pada satu atau lebih asam amino (dari NST menjadi DSA, NNA, NSA, NSI dan DST) sehingga tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Namun ada beberapa isolat yang mengalami mutasi asam amino pada posisi 154-156, tetap berpotensi sebagai posisi glikosilasi (yaitu dari NST menjadi NNT, NSS dan NRT) (Tabel 10; Susanti 2012a).

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Asam amino nomor 193-195 pada beberapa isolat mengalami mutasi pada satu atau lebih asam amino (dari NPT menjadi NQI, NPE, NPI, NSI dan NPA) sehingga tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida. Namun ada beberapa isolat yang mengalami mutasi salah satu asam amino pada posisi 193-195, tetap berpotensi sebagai posisi glikosilasi (yaitu dari NPT menjadi NPS dan NLT) (Tabel 10; Susanti 2012a). Posisi glikosilasi pada asam amino posisi 154-156 dan 193-195 berdekatan dengan daerah antigenik dan residu pengikat reseptor, sehingga mempengaruhi afinitas ikatan pada reseptor dan mekanisme virus menghindar respon imun hospes (Matrosovich et al. 1999; WHO 2005b; Campitelli et al. 2006; Gambaryan et al. 2006; Smith et al. 2006).

Asam amino nomor 165-167 pada beberapa isolat mengalami mutasi pada salah satu asam amino (dari NNT menjadi SNT, KNT dan NNA) sehingga tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida.Asam amino nomor 286-288 pada 1 isolat mengalami mutasi pada salah satu asam amino (dari NSS menjadi SSS) sehingga tidak berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida (Tabel 10; Susanti 2012a).

Tabel 10. Variasi asam amino posisi glikosilasi HA virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Posisi

Variasi Isolat, Tahun

glikosilasi

1 10-12 NNS Semua isolat tahun 2003-2010

2 23-25 NVT Semua isolat tahun 2003-2010

3 84-86 NPT Ayam, Manusia, itik puyuh, kalkun, babi tahun 2005-2010

92 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

NPA Ayam, manusia, unggas air tahun 2003-2010

SPA, Ayam dan unggas air 2005-2010 SPT, NPI, NPN

4 154-156 NST Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

NNT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2004-2010

NRT

Manusia tahun 2006

NSS

Ayam tahun 2005

DSA, Ayam, itik, puyuh, kalkun, babi NNA,

tahun 2003-2010

NSA, NSI, DST

5 165-167 NNT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

SNT, Ayam 2005-2010, unggas air 1 KNT,N isolat NA

6 193-195 NPT Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

NPS

Ayam tahun 2004

NLT

Ayam tahun 2006

NQI, Ayam 2005-2010, Human tahun NPE,

NPI, NSI,NP

7 286-288 NSS Ayam, Manusia, itik, puyuh, kalkun, babi tahun 2003-2010

SSS

Ayam bali 2007

Analisis filogenetik 1 695 nukleotida gen HA dari 11 virus AI subtipe H5N1 Asia dan 27 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 19. Pohon

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

94 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

A chicken Badung BBVD-175 2007

A chicken Kulon Progo BBVW-453-110

A duck Sleman BBVW-29-32185 2008 A chicken East Kalimantan UT498 A chicken East Java UT551 2010 A chicken Riau UT531 2010

A chicken Indonesia D10014 2010 A Indonesia 5 2005 A Indonesia 292H 2006 A Duck Indramayu BBPW109 2006

A chicken Inhu BPPVRII 2007 A Chicken Papua TA5 2006 A chicken Banten Pdgl-Kas 2004 A Chicken Madiun BBVW1420 2005

A duck Bangli BBVD-246 2007 A Quail Central Java SMRG 2006 A chicken Kupang-1-NTT BPPV6 2004 A Chicken Indonesia Wates83 2005 A chicken Simalanggang BPPVI 2005 A chicken Legok 2003 A chicken Indonesia R60 05 A swine Banten UT3062 2005 A chicken Indonesia 7 2003 A chicken Malang BBVet-IV 2004

A Duck Tabanan BPPV1 2005 A chicken East Java UT1006 2003 A duck East Java UT1046 2004

A duck guangxi 1793 2004 A goose Fujian bb 2003 A chicken Jilin9 2004

A chicken Cambodia LC1AL 2007

A duck Cambodia 072D6 2011 A Vietnam UT3047III 2004 A Thailand1(KAN-1) 2004 HA duck Thailand TS01 2006 A chicken Vietnam200 2005 A muscovy duck Vietnam LBM66 A great crested-grebe Qinghai1 2009

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gambar 19 . Pohon filogenetik 1 695 basa gen HA virus AI H5N1 asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia

Gen NS1

Protein yang disandi gen NS1 merupakan faktor virulensi VAI, berperan s ebagai antagonis IFN α/β. NS1 menghambat pengaktifan dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) dari signal IFN α/β sehingga produksi IFN α/β terhambat (Talon et al. 2000; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006; Hale et al. 2006; Coleman 2007). Hambat an sintesis IFN α/β oleh sel terinfeksi VAI juga terjadi melalui penghambatan NS1 pada pengaktifan 2‟-5‟ oligoadenilat sintetase (2‟-5‟-OAS) (Hale et al. 2006; Min & Krug 2006). Patogenesitas NS1 juga terjadi melalui ikatan langsung NS1 dengan p85β, yaitu subunit regulator fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K), sehingga replikasi virus dalam sel terinfeksi tidak terhambat (Hale et al. 2006).

Patogenesitas infeksi VAI H5N1 pada manusia berbeda dengan influenza biasa (H1N1, H3N2), yaitu adanya hiperinduksi sitokin proinflamasi sehingga menimbulkan hipersitokinemia, yang secara populer disebut „badai sitokin‟ (Guan et al. 2004; Lee et al. 2005). Sintesis berlebihan (overekspresi) protein HA, NP atau M di dalam sel terinfeksi VAI akan memicu NF- кB signaling pathway melalui pengaktifan IкB kinase (IKK) (Flory et al. 2000). Kedua virus influenza A subtipe H5N1 dan H1N1 ini menginduksi produksi sitokin melalui pengaktifan NF- кB atau degradasi IкB-α. Namun, VAI subtipe H5N1 mengaktifkan mitogen activated protein kinase (MAPK) secara dominan, termasuk p38 MAPK dan

96 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 96 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Mutasi NS1 menyebabkan penurunan kemampuan virus menghambat produksi IFN α/β, sehingga NS1 berpotensi besar sebagai target pembuatan antivirus dan vaksin (Solorzano et al. 2005; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006).

Imunitas adaptif juga dihambat NS1 melalui induksi transkripsi faktor-faktor yang terlibat dalam maturasi sel dendritik serta migrasi dan stimulasi sel T. Hal ini menyebabkan maturasi dan kapasitas sel dendritik untuk menstimulasi respon imun sel T terhambat. Imunitas seluler melalui sel T merupakan mekanisme pertahanan tubuh untuk penghilangan virus dari tubuh (Fernandez-Sesma et al. 2006). Sel T sitotoksik (cytotoxic T lymphocyte; CTL) berperan penting mengontrol infeksi virus (Wherry & Ahmed 2004; Thomas et al. 2006). Untuk menghindari respon CTL, VAI mengakumulasi substitusi asam amino pada epitop atau dekat epitop CTL, seperti asam amino 380-388 dan 383-391 pada NP. Substitusi R384G pada NP menyebabkan hilangnya epitop CTL sehingga virus terhindar dari respon CTL (Berkoff et al. 2005).

Di dalam nukleus, NS1 menghambat ekspresi gen sel hospes dengan menghambat ekspor mRNA seluler ke sitoplasma. Mekanisme tersebut dilakukan NS1 melalui penghambatan poliadenilasi mRNA seluler dan interaksi NS1 dengan kompleks protein ekspor nuklear sel hospes (Satterly et al. 2007). Terhambatnya ekspor mRNA seluler dari nukleus

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen NS1 dari 168 virus AI subtipe H5N1 isolat manusia dan hewan di Indonesia yang dianalisis, semuanya mengalami delesi 5 asam amino nomor 80-84, kecuali isolat A/Chicken/Pessel/BPPVRII/2007 (Tabel 11; Susanti 2012a). Namun, asam amino nomor 92 (salah satu marka patogenesitas) dari semua virus yang dianalisis adalah D (aspartat), atau dengan kata lain tidak mengalami mutasi D92E (Tabel 11; Susanti 2012a). Strain H5N1 yang bersifat letal mempunyai mutasi D92E dan atau delesi 80-84 (berdasarkan sistem penomoran H3) atau pada posisi 88-92 (berdasar sistem penomoran H5) pada gen NS1 (Lipatov et al.2005; Seo et al.2004; Viseshakul et al. 2004). Delesi 5 asam amino pada gen NS1 menyebabkan resistensi sitokin namun tidak berpengaruh terhadap virulensi virus (Seo et al. 2002; Lipatov et al. 2005). Mutasi NS1 menyebabkan penurunan kemampuan v irus menghambat produksi IFN α/β, sehingga NS1 berpotensi besar sebagai target pembuatan antivirus dan vaksin (Solorzano et al. 2005; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia- Sastre 2006). Peran antagonis interferon dari gen NS1 terletak pada asam amino nomor 92 dan 149 (Li et al. 2006; Min & Krug 2006; Quinlivan et al. 2005). Hasil penelitian Triyana et al. (2010) menunjukkan bahwa virus AI subtipe H5N1 asal unggas di Purworejo dan Bantul tidak mengalami mutasi D92E, tetapi mengalami delesi 5 asam amino nomor 80-84. Hal ini

98 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 98 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Hasil analisis gen NS1 juga menunjukkan bahwa 168 isolat virus yang dianalisis menunjukkan bahwa asam amino nomor 149 adalah Alanin (A) (Tabel 11; Susanti 2012a). Asam amino A149 merupakan salah satu penentu patogenesitas virus, yaitu bersifat antagonis terhadap induksi interferon (Li et al. 2006). Seperti disampaikan Jia et al. (2010), gen NS1 menghambat signal interferon. NS1 juga berperan menginduksi apoptosis (dependent caspase) pada sel epitel basal paru manusia (Zhang et al. 2010). NS1 menghambat pengaktifan dsRNA-dependent protein kinase R (PKR) dari signal IFN α/β sehingga produksi IFN α/β terhambat (Talon et al. 2000; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006; Hale et al. 2006; Coleman 2007). Hambatan sintesis IFN α/β oleh sel terinfeksi VAI juga terjadi melalui penghambatan NS1pada pengaktifan 2‟-5‟ oligoadenilat sintetase (2‟-5‟-OAS) (Hale et al. 2006; Min & Krug 2006). Patogenesitas NS1 juga terjadi melalui ikatan langsung NS1 dengan p85β, yaitu subunit regulator fosfatidilinositol-3-kinase (PI3K), sehingga replikasi virus dalam sel terinfeksi tidak terhambat (Hale et al. 2006). Mutasi NS1 menyebabkan penurunan kemampuan virus menghambat produksi IFN α/β, sehingga NS1 berpotensi besar sebagai target pembuatan antivirus dan vaksin (Solorzano et al. 2005; Fernandez-Sesma et al. 2006; Garcia-Sastre 2006).

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Tabel 11. Variasi asam amino yang disandi gen NS1 virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun Jumlah Urutan asam amino ke-

8 D A Delesi

2. Manusia 2006

49 D A Delesi

3. Manusia 2007

11 D A Delesi

4. Ayam 2003

15 D A Delesi

5. Ayam 2004

16 D A Delesi

6. Ayam 2005

19 D A Delesi

7. Ayam 2006

9 D A Delesi

8. Ayam 2007

9 D A Delesi (1)

9. Ayam 2008

5 D A Delesi

10. Itik (5), Muscovy duck

9 D A Delesi (4) 2004-2007

11. Babi 2005-2007

12 D A Delesi

12. Puyuh (5), kalkun (1),

6 D A Delesi 2004

Analisis filogenetik 690 nukleotida gen NS dari 15 virus AI subtipe H5N1 Asia dan 27 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 20. Pohon filogenetik pada Gambar 20 menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1) dan klaster goose/Guangdong (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia terbentuk 2 subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1 merupakan kelompok VAI Indonesia-Asia, sedangkan subklaster adalah isolat ayam Pessel/BPPVRII/2007. Nampak bahwa VAI isolat Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan kelompok virus dari negara-negara Asia.

100 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

A Indonesia CDC887 2006 A Indonesia CDC1031T 2007

A chicken Banten Srg-Fadh 2008 A Indonesia 341H 2006

A chicken Indonesia CDC24 2005 A chicken East Java UT6023 2006 A chicken Inhu BPPVRII 2007 A chicken Gunung Kidal BBVW 2005 A chicken Magetan BBVW 2005 A Indonesia 5 2005

A chicken Indonesia 7 2003 A chicken West Java 1074 2003 A chicken Legok 2003

A chicken Salatiga BBVet-I 2005 NS A turkey Kedaton BPPV3 2004 A chicken Malang BBVet-IV 2004 A Dk Indonesia MS 2004 A chicken East Kalimantan UT1035 2004 A chicken East Java BL-IPA 2003 A chicken Kulon Progo BBVW 2005 A swine East Java UT6003 2006

A chicken East Java UT6031 2007 A swine South Kalimantan UT6015 2006 A chicken Dairi BPPVI 2005 A chicken Tebing Tinggi BPPVI 2005 A swine Banten UT3062 2005 A chicken Wonosobo BPPV4 2003 A duck Hubei3 2005

A great crested-grebe Qinghai1 2009 A muscovy duck Vietnam LBM66 A duck Thailand TS01 2006 A Thailand1(KAN-1) 2004 A quail Malaysia 6309 2004 A Vietnam UT3047III 2004

A chicken Vietnam NCVD10 2005 A duck Cambodia 072D6 2011 A chicken Cambodia LC1AL 2007 A goose fujian bb 2003

A duck guangxi 1793 2004 A chicken Jilin9 2004 A Hong Kong97 98

A chicken Pessel BPPVRII 2007 A goose guangdong1 96

Gambar 20 . Pohon filogenetik 690 basa gen NS virus AI H5N1 asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal Asia

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gen PB1-F2 dan PB1

Sesuai dengan namanya, gen PB berfungsi utama sebagai enzim polimerase sintesis mRNA. Selain itu, PB1 juga berperan dalam perampasan tudung (cap snatching), perakitan kompleks RdRp (RNA dependent RNA polimerase) dan menghambar respon imun seluler. Ketika replikasi, inti sel menyediakan lingkungan untuk sintesis mRNA virus influenza melalui proses yang tidak biasa, yaitu inisiasinya memerlukan

7 primer yang mempunyai cap-m m GpppX (Lamb & Krug 2001). Fragmen tudung (7mGppp dan 10-13 nukleotida setelah tudung)

dari pre-mRNA sel hospes dipotong oleh enzim PB1 kemudian dikenal dan diikat oleh enzim PB2. Proses perampasan tudung dari pre-mRNA seluler tersebut disebut dengan cap snatching (Rao et al. 2003; Crow et al. 2004; Hara et al. 2006).

Protein PB1-F2 adalah protein yang diekspresikan dari bingkai pembacaan terbuka (open reading frame:ORF) alternatif pada segmen gen polimerase PB1. Protein PB1-F2 terdiri dari 87 asam amino (Gibbs et al. 2003). ORF alternatif terletak pada basa ke (+)120 setelah ORF gen PB1. Ekspresi ORF alternatif ini melalui mekanisme ribosomal scanning, yaitu pembacaan ribosom pada kodon inisiasi translasi (AUG). Jika ribosom mengenali AUG pada ORF alternatif, polipeptida baru akan terbentuk. PB1-F2 hanya bertahan dalam sel selama 5 jam pascainfeksi (Coleman 2007). Protein ini terlokalisasi di membran mitokondria dan secara dramatik menyebabkan degradasi morfologi mitokondria, menurunkan potensial membran dan menginduksi apoptosis (Garcia-Sastre 2006; Coleman 2007).

102 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Protein ini merupakan faktor patogenesitas virus influenza secara in vivo (Garcia-Sastre 2006; Coleman 2007). Protein PB1-

F2 mampu menginduksi apoptosis makrofag sehingga menurunkan kemampuan sel hospes untuk menghilangkan virus dan meningkatkan infeksi sekunder bakteri oportunistik (Coleman 2007). Menurut Pena et al.(2012), PB1-F2 terlibat dalam mekanisme virulensi, replikasi virus dan respon imun innate. Protein PB1-F2 merupakan target untuk lokalisasi virus pada membran dalam mitokondria sel hospes sehingga mengganggu fungsi mitokondria (Gibbs et al. 2003).

Virus AI yang dihilangkan ORF alternatif PB1-F2 tetap hidup secara in vitro, namun secara in vivo menurunkan kemampuan induksi apoptosis makrofag sampai 50%. Hal ini menunjukkan bahwa protein PB1-F2 hanya meningkatkan patogenesitas virus secara in vivo (Zamarin et al. 2006). Karena PB1-F2 dapat menyebabkan apoptosis makrofag sebagai antigen presenting cell (APC) profesional, kematian makrofag juga mempengaruhi presentasi antigen pada cabang respon imun adaptif (Coleman 2007).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa 148 isolat virus AI subtipe H5N1 asal hewan dan manusia di Indonesia mempunyai asam amino N66 pada gen PB1-F2 (Tabel 12; Susanti 2012a). Disebutkan bahwa PB1-F2 berperan sebagai faktor patogenesitas virus melalui pro-apoptosis mitokondrial. Asam amino N66 PB1- F2 merupakan indikator letalitas tinggi pada virus AI tahun 1918 (Schnolke et al. 2011). Lebih lanjut disebutkan bahwa asam amino N66 berimplikasi patogenesitas pada mamalia (Conello et

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Sebanyak 148 isolat vrus AI subtipe H5N1 asal manusia dan hewan di Indonesia yang dianalisis menunjukkan bahwa asam amino F251 dan F254 dari PB1 (Tabel 12; Susanti 2012a) merupakan sentral dari sekuen konserv untuk proses polimerase (Jung et al. 2006). Sebagai gen yang berperan pada proses vital, biasanya tidak banyak mengalami mutasi yang bermakna. Menurut Xu et al. (2012), asam amino 473V dan 598P PB1 virus AI asam unggas berkontribusi pada mekanisme polimerase terutama pada sel mamalia. Semua virus AI di Indonesia yang dianalisis mempunyai asam amino 473V dan 598L, hanya 1 isolat yang mempunyai 598P. Hal ini kemungkinan merupakan faktor penyebab mudahnya virus asal unggas bereplikasi pada mamalia termasuk manusia.

Asam amino PB1 semua isolat virus di Indonesia yang dianalisis adalah T677 (Tabel 12; Susanti 2012a). Mutasi dua asam amino yaitu T677M dari PB1 dan I63T dari PB2

menurunkan patogenesitas virus. Mutasi T677M menurunkan efisiensi replikasi virus tetapi meningkatkan aktivitas polimerase

104 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

(Li et al. 2011). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa asam amino PB2 semua isolat virus di Indonesia yang dianalisis adalah I63, kecuali 5 isolat yang mengalami mutasi I63V (yaitu A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-1/2004; A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-2/2004;

NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/Kupang 3NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/ Manggarai NTT/BBPV6/2004) (Tabel 12; Susanti 2012a). Mutasi I63T protein PB2 tidak mengubah kemampuan replikasi virus (Li et al. 2011). Dari hasil analisis asam amino posisi 677 PB1, dapat disimpulkan bahwa virus AI di Indonesia tidak mengalami mutasi T677M. Mutasi I63V pada gen PB2 dari 5 isolat VAI di Indonesia perlu dikaji lebih lanjut tentang fenotip virus secara biologis.

A/Chicken

/Kupang2

Tabel 12. Variasi asam amino yang disandi gen PB1 dan PB1-F2 virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun

Jumlah

Urutan asam amino ke-

PB1 PB1 PB1 1. Manusia 2005

PB1-F2 PB1

PB1

F F V L T 2. Manusia 2006

12 N

F F V L(1) T 3. Manusia 2007

42 N

F F V L T 4. Ayam 2003

11 N

F F V L T (9 data) (9 data) 5. Ayam 2004

13 N

F F V L T (1 data) (1 data) 6. Ayam 2005

16 N

F F V L T 7. Ayam 2006

17 N

F F V L T 8. Ayam 2007

F F V L T 9. Itik 2004-2005

F F V L T 10. Babi 2005-2007

F F V L T 11. Puyuh (5),

13 N

F F V L T kalkun (1), 2004 (1) kecuali 1 isolat A/Indonesia/ CDC759/2006: asam amino P

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Analisis filogenetik 2268 nukleotida gen PB1 dari 11 virus AI subtipe H5N1 Asia dan 27 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 21. Pohon filogenetik pada Gambar 21 menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua

klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1) dan klaster Hongkong (klaster 2). Pada klaster 1 (Indonesia-Asia) terbentuk 2 subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1 merupakan kelompok VAI Indonesia-Asia, sedangkan subklaster

2 adalah isolat ayam Jilin9/2004. Nampak bahwa VAI isolat Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan kelompok virus dari negara-negara Asia.

106 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

A chicken East Java UT6020 2006 A duck Parepare BBVM 2005 A chicken Bali UT2091 2005

A chicken Gunung Kidul BBVW 2005 A chicken Magetan BBVW 2005

A chicken Banten UT6025 2006 A chicken Jakarta DKI-Nurs 2007

A Indonesia 5 2005 A Indonesia 160H 2005

A Indonesia CDC184 2005 A chicken Purworejo BBVW 2005 A chicken Kulon Progo BBVW 2005

A chicken Central Java UT3091 2005 PB1 A Indonesia CDC326T 2006 A duck East Java UT1046 2004 A duck East Java UT1107 2004

A chicken Legok 2003 A chicken West Java UT1001 2003 A chicken East Java UT1006 2003

A chicken Indonesia 3 2007 A chicken Indonesia 7 2003

A chicken Dairi BPPVI 2005 A chicken Simalanggang BPPVI 2005

A chicken Deli Serdang BPPVI 2005 A chicken Tarutung BPPVI 2005

A chicken East Java UT6031 2007 A great crested-grebe Qinghai1 2009 A duck Cambodia 072D6 2011 A chicken Cambodia LC1AL 2007 A Vietnam UT3047III 2004 A duck Thailand TS01 2006 A Thailand1(KAN-1) 2004 A chicken Vietnam200 2005 A goose fujian bb 2003 A duck Hubei3 2005 A chicken Jilin9 2004

A Hong Kong97 98

Gambar 21 . Pohon filogenetik 2268 basa gen PB1 virus AI H5N1 asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal

Asia.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gen PB2

Protein yang disandi oleh gen PB2, berperan sebagai

7 pengenalan cap-m m GpppX pada RNA sel (Lamb & Krug 2001).Domain pengikat cap telah diidentifikasi pada posisi 242-

252 dan 533-564 (Honda et al. 1999; Li et al. 2001). Perubahan adaptif protein PB2 diperlukan untuk mengatasi barier spesies dan letalitas strain (Solomon et al. 2006). Asam amino nomor 627 disebutkan sangat menetukan letalitas suatu virus. Pada posisi tersebut, virus yang teradaptasi dengan baik pada mamalia mempunyai residu lisin (K), sedangkan virus avian mempunyai asam amino glutamate (E) (Hatta et al. 2001; Shinya et al. 2004; Solomon et al. 2006).

Hasil analisis 158 isolat VAI di Indonesia menunjukkan bahwa

AI asal manusia (A/Indonesia/CDC759/2006;

A/Indonesia/CDC390/2006; A/Indonesia/ CDC370E/2006; A/Indonesia/321H/2006; dan A/Indonesia/CDC1031/2007) yang asam amino pada posisi 627 adalah K (Tabel 13; Susanti 2012a). Hal ini menunjukkan bahwa bukan hanya mutasi E627K dari PB2 yang berkontribusi pada mekanisme adaptasi virus dari unggas ke manusia. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa virus yang diisolasi dari kasus kematian manusia akibat H5N1 sangat sedikit yang menunjukkan mutasi E627K (de Jong et al. 2006; Guan et al. 2004; Li et al. 2004; Shinya et al.2005; Steel et al. 2009).

108 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Tabel 13. Variasi asam amino yang disandi gen PB2 virus AI

subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun

Jumlah

Urutan asam amino ke-

F F E 2. Manusia 2006

12 I QMPYTPGGEVR

F F E (1) 3. Manusia 2007

55 I QMPYTPGGEVR

F F E(2) 4. Ayam 2003

11 I QMPYTPGGEVR

F F E 5. Ayam 2004

12 I QMPYTPGGEVR

16 I QMPYTPGGEVR

6. Ayam 2005

F F E 7. Ayam 2006

19 I QMPYTPGGEVR

9 I QMPYTPGGEVR

8. Ayam 2007

4 I QMPYTPGGEVR

9. Itik 2004-2005

F F E 10. Babi 2005-2007

4 I QMPYTPGGEVR

F F E 11. Puyuh (3), kalkun (1),

11 I QMPYTPGGEVR

F F E feline(1) 2004-2006

5 I QMPYTPGGEVR

(1) 4 isolat asam amino K: A/Indonesia/CDC759/2006; A/Indonesia/CDC390/2006; A/Indonesia/CDC370E/2006; A/Indonesia/321H/2006

(2) 1 isolat asam amino K: A/Indonesia/CDC1031/2007 (3) 5 isolat asam amino V: A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-

1/2004; A/Chicken/Bangli Bali BBPV6-2/2004; A/Chicken/Kupang 2 NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/Kupang 3 NTT/BBPV6/2004; A/Chicken/Manggarai- NTT/BBPV6/2004

(4) 1 isolat asam amino QMPYTPGGDVK : A/Chicken/South

Kalimantan/UT6029/2006 (5) 1 isolat asam amino QMPYTPGGEVR : A/Chicken/Indonesia/3/2007)

Dua asam amino yaitu F363 dan F404 dilaporkan membentuk „sandwich aromatic‟ yang terlibat dalam „cap binding‟

(Fechter et al. 2003). Hasil penelitian menunjukkan bahwa asam

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

QMPYTPGGDVK (A/Chicken/SouthKalimantan/UT6029/2006)

mutasi

yaitu

dan QMPYTPGGEVK (A/Chicken/Indonesia/3/2007) (Tabel 13; Susanti 2012a). Peran mutasi pada fenotip virus perlu dikaji lebih lanjut.

Analisis filogenetik 20 nukleotida gen PB2 dari 11 virus AI subtipe H5N1 Asia dan 22 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 22. Pohon filogenetik pada Gambar 22 menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1) dan klaster Hongkong (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia terbentuk 2 subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1 merupakan kelompok VAI Indonesia-Asia, sedangkan subklaster

2 adalah isolat itik Guangxi1793/2004. Nampak bahwa VAI isolat Indonesia tidak membentuk kelompok terpisah dengan kelompok virus dari negara-negara Asia.

110 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

A chicken Kulon Progo BBVW 2005 A chicken Mangarai-NTT BPPV6 2004

A duck East Java UT1046 2004 A chicken West Java UT1001 2003 A chicken Indonesia 7 2003 A chicken Salatiga BBVet-I 2005 A chicken Dairi BPPVI 2005

A chicken Tebing Tinggi BPPVI 2005 A chicken Legok 2003

A chicken Purworejo BBVW 2005 A feline Indonesia CDC1 2006 A Indonesia CDC370E 2006

A Indonesia 5 2005 A Indonesia CDC7 2005 A chicken Banten UT6025 2006 A chicken Indonesia CDC24 2005

A chicken Magetan BBVW 2005 A chicken Wajo BBVM 2005

A duck Parepare BBVM 2005 A swine Banten UT2071 2005

A chicken East Java UT6031 2007 A swine East Java UT6003 2006 A chicken Jilin9 2004 A Vietnam UT3047III 2004

A duck Cambodia 072D6 2011

A duck Thailand TS01 2006 A Thailand1(KAN-1) 2004

A chicken Vietnam200 2005

A great crested-grebe Qinghai1 2009 A muscovy duck Vietnam LBM66

A goose fujian bb 2003 A duck guangxi 1793 2004

A Hong Kong97 98

Gambar 22 . Pohon filogenetik 20 basa gen PB2 virus AI H5N1 asal Indonesia baik dari hewan dan manusia, serta virus asal

Asia.

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Gen Neuraminidase (NA)

Pada protein NA, semua virus H5N1 Indonesia asal manusia dan hewan tahun 2003-2010, mempunyai delesi 20

Susanti 2012b). Tempat glikosilasi pada regio stalk dari protein neuraminidase berperan dalam menjaga struktur tetramer dari protein (Luo et al. 1993). Virus AI H5N1 asal unggas dan manusia di Hongkong tahun 1997-1998 semuanya mengalami delesi 19 asam amino regio stalk NA (Bender et al. 1999). Hasil penelitian Nga et al. (2011) menunjukkan bahwa virus AI subtipe H5N1 yang diisolasi tahun 2004-2009 di Vietnam mengalami delesi 20 asam amino, sama seperti strain virus tahun 2003. Namun isolat yang beredar sebelum tahun 2003 tidak mengalami delesi 20 asam amino, sehingga mempunyai 1410 nukleotida (469 asam amino). Delesi 20 asam amino pada regio stalk juga terjadi pada isolat H5N1 berbagai spesies unggas di Thailand tahun 2003- 2004. Hal ini sangat berbeda dengan strain virus H5N1 penyebab outbreak di Asia Timur tahun 1996-1997 dan 2000-2001 (Keawcharoen et al. 2005). Mutasi drift pada NA ini kemungkinan merupakan bagian dari proses evolusi virus sehingga memiliki varian yang penting pada mekanisme patogenesitas virus (Nga et al. 2011).

Posisi glikosilasi asam amino terkait asparagin (N) dengan pola sekuen NXS dan NXT yang berpotensi sebagai tempat penempelan oligosakarida (Hoffman et al. 2005; Smith et

al. 2006; Stevens et al. 2006). Penambahan glikosilasi pada protein NA juga terlibat dalam peningkatan virulensi VAI (Hulse et

112 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya 112 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Tabel 14. Variasi asam amino posisi glikosilasi yang disandi gen NA virus AI subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun

Jumlah

Urutan asam amino ke-

145- 234- 147

NGT(1) NGS

NGT(2) NGS

20 Delesi NSS(3)

NGT(4) NGS

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

11 Itik (25), swan

NSS NGT(5) NGS (1), muscovy duck (5)2004- 2008

31 Delesi

12 Babi 2005-

NSS NGT NGS 2007

12 Delesi

13 Puyuh (5),

NSS NGT(6) NGS kalkun (2), pigeon(1), tree sparow (2) 2004-2010

10 Delesi

(1) 8 isolat asam amino NET: A/Indonesia/534H/2006; A/Indonesia/535H/2006; A/Indonesia/536H/2006; A/Indonesia/538H/2006; A/Indonesia/546H/2006; A/Indonesia/546bH/2006; A/Indonesia/560H/2006; A/Indonesia/CDC599/2006; A/Indonesia/CDC625/2006; A/Indonesia/CDC625L/2006

(2) 2 isolat asam amino NET: A/chicken/Dairi BPPVI/2005; A/chicken/Langkat BBPVI/2005 (3) 1 isolat asam amino SSS: A/chicken/Sleman BBVW 626- 233/2007 (4) 2 isolat asam amino NGS: A/chicken/East Kalimantan UT581/2010; A/chicken/East Kalimantan UT581/2010 (5) 1 isolat asam amino NET: A/duck/Madium BBVW 109/2004 (6) 1 isolat asam amino NET: A/turkey/Langkat BBPVI/2005

Sekuen asam amino pembentuk oseltamifir binding pocket pada protein NA adalah E119, R224, H274, E276, R292 dan N294 (Moscona 2005a; 2005b). Binding pocket yang sama juga digunakan oleh zanamivir, obat anti influenza yang lain (Moscona 2005a). Mutasi pada bagian ini dilaporkan menyebabkan resistensi terhadap tamiflu. Hasil penelitain pada virus AI subtipe H5N1 isolat hewan dan manusia tahun 2003- 2010 menunjukkan bahwa asam amino pembentuk oseltamivir binding pocket yang dapat diidentifikasi adalah R224, H274,

114 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

E276, R292 dan N294.Asam amino posisi tersebut masih konserv pada semua virus di Indonesia yang datanya terdaftar di Genbank, kecuali 1 isolat yang mengalami mutasi H274Y yaitu isolat A/Indonesia/560H/2007. Asam amino posisi 119 mengalami mutasi E119R pada semua isolat virus yang diidentifikasi (Tabel 15; Susanti 2012b).

Tabel 15. Variasi asam amino oseltamifir binding pocket virus AI

subtipe H5N1 di Indonesia

No Isolat, Tahun

Jumlah

Urutan asam amino ke-

H E R N 2. Manusia 2006

10 R

E R N 3. Manusia 2007

49 R

H (1)

H E R N 4. Ayam 2003

11 R

H E R N 5. Ayam 2004

13 R

H E R N 6. Ayam 2005

15 R

H E R N 7. Ayam 2006

43 R

H E R N 8. Ayam 2007

25 R

H E R N 9 Ayam 2008

20 R

H E R N 10 Ayam 2010

H E R N 11 Itik (25), angsa (1), entok

H E R N (5)2004-2008 12 Babi 2005-2007

31 R

H E R N 13 Puyuh (5), kalkun (2),

12 R

H E R N burung dara (1), tree sparow (2) 2004-2010

10 R

(1) 1 isolat Y, yaitu A/Indonesia/560H/2007

Mutasi NA pada posisi 116, 117, 274, dan 294 menurunkan kepekaan virus terhadap oseltamivir karboksilat

(IC 50 s meningkat 5-940 fold). Mutasi pada posisi Y252H pada NA berkontribusi pada penurunan kepekaan virus H5N1 terhadap oseltamivir (Ilyushina et al. 2010). Tingkat resistensi tinggi

Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

Analisis filogenetik 1404 nukleotida gen NA dari 12 virus AI subtipe H5N1 Asia dan 29 isolat VAI H5N1 Indonesia baik asal hewan maupun manusia ditampilkan pada Gambar 23. Pohon filogenetik pada Gambar 23 menunjukkan bahwa dari semua virus yang dianalisa, secara umum membentuk dua klaster (cluster) terpisah, yaitu klaster Indonesia-Asia (klaster 1) dan klaster Asia (klaster 2). Pada klaster Indonesia-Asia terbentuk 2 subklaster, yaitu subklaster 1 dan 2. Subklaster 1 merupakan kelompok VAI Indonesia, sedangkan subklaster 2 merupakan kelompok VAI Asia. Nampak bahwa VAI isolat Indonesia membentuk kelompok terpisah dengan kelompok virus dari negara-negara Asia.

116 Virus Avian Influenza dan Dinamika Molekulernya

A chicken East Java UT6031 2007 A swine Banten UT6008 2007 A chicken Kupang-1-NTT BPPV6 2004 A Dk Indonesia MS 2004 A chicken Indonesia R134 03 A chicken Indonesia 11 2003

A Indonesia 6 2005 A chicken Indonesia R60 05 A swine Banten UT2071 2005 A chicken Legok 2003

A chicken Purworejo BBVW 2005 A chicken Salatiga BBVet-I 2005 A chicken Deli Serdang BPPVI 2005 A chicken Tarutung BPPVI 2005 A chicken Tebing Tinggi BPPVI 2005

A chicken Indonesia 7 2003 A quail Tasikmalaya BPPV4 2004

A chicken East Java UT6021 2006 A chicken Bali UT2092 2005 A swine East UT6005 2006 NA A swine North Sumatra UT6004 2006 A Indonesia 175H 2005

A chicken EastKalimantan UT581 2010