Tempat Pengujian Alat Bahan Sampel Penetapan Kadar Kotrimoksazol Interpretasi Hasil

BAB III METODE PERCOBAAN

3.1 Tempat Pengujian

Pengujian penetapan kadar kotrimoksazol dalam suspensi dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT dilakukan di Laboratorium Obat, Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di Medan yang berada di Jalan Willem Iskandar Pasar V Barat I No. 2 Medan.

3.2 Alat

Alat yang digunakan adalah Seperangkat alat KCKT dengan kolom L1 25 cm x 4,6 mm, detektor 254 nm; sonikator, penyaring membrane PTFE 0,45 μm, penyaring vakum, timbangan analitik, beaker glass, piknometer 25 ml, batang pengaduk, labu tentukur 50 ml, 100 ml, 1000 ml, membran filter ukuran 0,45 μm, pH meter, dan pipet volume ukuran 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml.

3.3 Bahan

Bahan yang digunakan adalah akuabides, asetonitril, metanol, asam asetat glasial, NaOH 0,2 N, trietilamin, sulfametoksazol baku pembanding, dan trimetoprim baku pembanding.

3.4 Sampel

− Nama contoh : Bactoprim Combi Universitas Sumatera Utara − WadahKemasan : BotolSuspensi 50 ml − No. Batch : 006189 − No Reg : DKL 8304116833A1 − Komposisi : setiap 5 ml suspense mengandung sulfametoxazol 200 mg dan trimetoprim 40 mg − Kadaluarsa : Jun 2013 − Produksi : PT. Combiphar, Bandung – Indonesia

3.5 Prosedur

3.5.1 Penentuan Bobot jenis

Sediakan piknometer 25 ml. Diatur suhu termometer hingga mencapai suhu kamar 25 C. Ditimbang dalam keadaan kosong. Diisi piknometer tersebut dengan air hingga penuh. Diatur suhu termometer hingga mencapai suhu kamar. Ditimbang kembali. Dikeluarkan air dalam piknometer dan bersihkan. Lalu piknometer tersebut diisi dengan sampel yang diuji hingga penuh. Diatur suhu termometer hingga mencapai suhu kamar. Ditimbang dan hitung bobot jenisnya. Data perhitungan bobot jenis dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 37.

3.5.2 Pembuatan Fase Gerak

Campuran 400 ml asetonitril dan 2,0 ml trietilamin dimasukkan ke dalam gelas ukur 2000 ml. Kemudian diadkan dengan air sampai garis tanda. Biarkan hingga suhu kamar dan atur pH hingga 5,9±0,1 menggunakan natrium hidroksida Universitas Sumatera Utara 0,2 N atau asam asetat glasial P 1:100. Disaring menggunakan penyaring vakum yang sudah dilapisi membran 0,45 μm. 3.5.3 Larutan Baku Pembanding 3.5.3.1 Sulfametoksazol Ditimbang seksama ± 8 mg sulfametoksazol BP, masukkan ke dalam labu tentukur 5 ml, tambahkan 3 ml metanol, sonikasi selama 15 menit, didinginkan. Diadkan dengan metanol sampai garis tanda.

3.5.3.2 Trimetoprim

Ditimbang seksama ± 3 mg trimetoprim BP, masukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, tambahkan 5 ml metanol, sonikasi selama 15 menit, didinginkan. Diadkan dengan metanol sampai garis tanda. Masing-masing larutan baku sulfametoksazol dan larutan baku trimetoprim dipipet 1,0 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml dan diadkan dengan fase gerak sampai garis tanda. Kemudian dikocok dan disaring dengan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm kedalam vial.

3.5.4 Larutan Uji

Dipipet 2,0 ml suspensi setara lebih kurang 80 mg sulfametoksazol. Dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, tambahkan 30 ml metanol dan disonikasi selama 10 menit, didiamkan sampai suhu ruang dan diadkan dengan metanol sampai garis tanda. Kemudian dipipet 5,0 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml dan diadkan dengan fase gerak sampai garis tanda, dan disaring dengan penyaring membran dengan porositas 0,45 µm ke dalam vial. Universitas Sumatera Utara

3.6 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

3.6.1 Pengaturan Kondisi Sistem

Sistem diperiksa dan dicek untuk meyakinkan apakah sistem pengalir pelarut telah disambungkan dengan baik, kolom telah dipasang, tersedia cukup pelarut di dalam botol pelarut, sistem pengawasan pelarut bekerja dengan baik untuk menghilangkan gelembung udara, penyaring pelarut sudah dipasang, dan detektor yang sesuai sudah terpasang dengan benar.

3.6.2 Mengaktifkan Sistem

Setelah masing-masing sistem diatur, hubungkan setiap sistem dengan sumber arus listrik. Tekan tombol power pada pompa, detektor UV-VIS ke posisi ON dan CBM Communication Bus Module ke posisi ON.

3.6.3 Penentuan Garis Alas

Bila nilai absorbansi yang ditampilkan pada detektor UV-VIS telah menunjukkan 0,000 lalu biarkan beberapa menit sampai diperoleh garis alas yang relatif cukup lurus yang menandakan sistem telah stabil.

3.7 Penetapan Kadar Kotrimoksazol

Kemudian larutan uji dan baku diinjeksikan secara terpisah kedalam kolom kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dan dilakukan elusi dengan kondisi menggunakan kolom fase balik L 1 ODS berukuran 25 cm x 4,6 mm, detektor dengan panjang gelombang 254 nm, dengan laju alir 2 mlmenit, dengan volume injeksi 20 µl, dengan fase gerak campuran air:asetonitril:trietilamin 1400:400:2 vv dan diinjeksikan kedalam KCKT. Universitas Sumatera Utara Hasil yang diperoleh dapat dilihat dari terbentuknya puncak yang direkam oleh CBM Communication Bus Module yakni sejenis penghubung dengan sistem komputer yang dilengkapi dengan pencetak kromatogram. Kromatogram larutan baku dan larutan uji dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 35 dan Lampiran 6 halaman 35.

3.8 Interpretasi Hasil

Kadar kotrimoksazol dalam suspensi dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi KCKT dapat dihitung dengan rumus: Keterangan: Au : Luas puncak larutan uji Ab : Luas puncak larutan baku Bb : Bobot baku yang ditimbang dalam mg Bu : Bobot uji yang ditimbang dalam mg Fu : Faktor pengenceran larutan uji Fb : Faktor pengenceran larutan baku 5 : Menunjukkan bahwa takaran setiap 5 ml suspensi mengandung 200 mg sulfametoksazol dan 40 mg Trimetoprim Bj : Berat jenis sampel Ki : Kadar Sulfametoksazol dan Trimetropim dalam setiap 5 ml suspensi Universitas Sumatera Utara

3.9 Persyaratan