Pengembangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pada Penetapan Kadar Simvastatin Tablet Menggunakan Fase Gerak Asetonitril : Air

PENGEMBANGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN TABLET

MENGGUNAKAN FASE GERAK ASETONITRIL : AIR

SKRIPSI

OLEH:

DIFA ANANDA

NIM 111524065

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

PENGEMBANGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN TABLET

MENGGUNAKAN FASE GERAK ASETONITRIL : AIR

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH: DIFA ANANDA

NIM 111524065

PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

PENGESAHAN SKRIPSI

PENGEMBANGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN TABLET

MENGGUNAKAN FASE GERAK ASETONITRIL : AIR

OLEH: DIFA ANANDA

NIM 111524065

Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: Juli 2014

Pembimbing I,

Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002

Pembimbing II,

Prof. Dr. rer.nat. E. De Lux Putra, SU., Apt.

NIP 195306191983031001

Panitia Penguji,

Prof. Dr. Siti Morin S, M.Sc., Apt. NIP 195008281976032002

Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002

Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.

NIP 195006071979031001

Dra. Sudarmi, M.Si., Apt. NIP 195409101983032001

Medan, Juli 2014 Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Dekan,

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, karunia dan ridhoNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Pengembangan

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pada Penetapan Kadar Simvastatin

Tablet Menggunakan Fase Gerak Asetonitril : Air. Skripsi ini diajukan sebagai

salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih yang tulus dan

ikhlas kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan. Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt., dan Bapak Prof. Dr. rer.nat. Effendy De Lux Putra, SU., Apt., selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan dan nasehat selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Ibu Prof. Dr. Siti M. Sinaga, M.Sc., Apt., Ibu Dra. Sudarmi, M.Si., Apt., dan Bapak Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan saran, arahan, kritik, dan masukan kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi USU Medan yang telah mendidik selama perkuliahan.

Selain itu, penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada terhingga kepada Ayahanda Effendy A.S. dan Ibunda Adja Fauziah B.A tercinta, kedua mertua dan istriku Sri Widya Astuti S.S tercinta, anakku Fathir

bagi kesuksesan penulis, juga kepada kakak, abang, dan teman-teman mahasiswa Farmasi khususnya Farmasi Ekstensi 2011 yang selalu memberi doa, dorongan, dan motivasi selama penulis melakukan penelitian.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih belum sempurna,

sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk penyempurnaannya. Harapan saya semoga skripsi ini dapat bermanfaaat bagi ilmu pengetahuan kefarmasian.

Medan, Juli 2014

Penulis,

Difa Ananda

PENGEMBANGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN TABLET

MENGGUNAKAN FASE GERAK ASETONITRIL : AIR

ABSTRAK

Simvastatin merupakan obat antihiperlidemia yang termasuk golongan penghambat HMC-CoA reduktase. Monografi sismvastatin tablet tidak terdapat pada Farmakope Indonesia edisi IV, tetapi pada USP 32 tahun 2009 penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet ditentukan secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan fase gerak asetonitril : buffer asetat dengan sistem

isokratik, sedangkan pada penelitian sebelumnya menggunakan fase gerak

asetonitril : air dengan sistem elusi gradien. Adapun kelemahan dari kedua metode tersebut adalah pemakaian buffer yang tidak ramah terhadap kolom dan pemakain sistem elusi gradien yang rumit. Tujuan penelitian ini adalah pengembangan metode penetapan kadar simvastatin tablet secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang lebih aman terhadap kolom dan relatif lebih mudah digunakan.

Penetapan kadar simvastatin tablet dilakukan dengan sampling purposif dengan menggunakan dua sediaan tablet generik dan dua sediaan tablet nama dagang. Penelitian ini menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) , fase gerak asetonitril : air berbagai perbandingan dengan sistem elusi isokratik, laju alir 1,5 ml/menit, suhu kolom 50ºC dan panjang gelombang 238 nm. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak asetonitril : air untuk mendapatkan hasil yang terbaik secara KCKT dengan parameter tailing factor,

waktu retensi, nilai lempeng teori dan resolusi. Untuk menguji validitas metode ini, dilakukan uji validasi dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi.

Hasil pengembangan metode dengan menggunakan sistem elusi isokratik diperoleh fase gerak yang paling baik dengan perbandingan asetonitril : air (80:20). Hasil uji validasi diperoleh % recovery 99,67%, presisi (RSD) 1,89%, ini menunjukkan bahwa metode ini memiliki akurasi dan presisi yang baik dengan batas deteksi (LOD) 2,314 µg/ml dan batas kuantitasi (LOQ) 7,713 µg/ml. Dari hasil penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet diperoleh berturut-turut kadar dari yang tercantum di etiket untuk nama dagang Ethicol® 100,58 ± 0,17%, Selvim® 99,45 ± 1,23% dan dengan nama generik Dexa Medica 100,67 ± 0,02%, Bernofarm 101,70 ± 0,06%. Dapat disimpulkan bahwa semua sampel tablet simvastatin memenuhi persyaratan kadar menurut United Stated Pharmacopeia

(USP) 32 tahun 2009 yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

Kata kunci:Pengembangan metode, Validasi, Simvastatin, Tablet, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Isokratik.

METHOD DEVELOPMENT HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ASSAY OF SIMVASTATIN TABLETS IN USING

MOBILE PHASE ACETONITRILE : WATER ABSTRACT

Simvastatin is a drug that belonged to antihiperlidemia HMC-CoA reductase inhibitors. In the fourth edition of the Pharmacopoeia of Indonesia the sismvastatin’s tablet monograph is not available, but it is available in United States Pharmacopeia (USP) 32:2009. The assay of simvastatin tablet in the USP determined by high performance liquid chromatography (HPLC) using a mobile phase of acetonitrile: acetate buffer with an isocratic system, whereas in the previous study using a mobile phase of acetonitrile : water with gradient elution system. The limitation of both methods is the use of buffer that is not friendly to the column and the complication of gradient elution system usage. The purpose of this research is the development of HPLC assay method for simvastatin tablet where is more secure against column and relatively easy to use, this method is validated and is further applied to the determination of concentrations of simvastatin in tablet using generic and trade name as the sampels.

The Assay has been developed using a Waters X-Bridge column (250 x 4.6 mm), mobile phase of acetonitrile: water with isocratic elution system, a flow rate of 1.5 ml/min, column temperature 50ºC and a wavelength of 238 nm. In this study the optimation of this assay is done by changing the compotition of mobile phase to gain the best result of analysis. The validation parameters such as accuracy, precision, limit of detection and limit of quantitation is also performed.

This study shows the best result of simvastatin assay with a retention time of 2.7 minutes from isocratic elution system using acetonitrile : water (80:20) as the mobile phase. The validation test shows the % accuracy (recovery) and precision (RSD) of 99.67% and 1.89% respectively, indicating that the method has good accuracy and precision. The limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) is found to be 2.314 µg/ml and 7.713 µg/ml respectively. The determination using the developed procedure result concentration of simvastatin of 100.58 ± 0.17% for Ethicol®, 99.45 ± 1.23% for Selvim®, the 100.67 ± 0.02% for Simvastatin generic from Dexa Medica, 101.70 ± 0.06% for Simvastatin generic from Bernofarm. It can be concluded that all samples meet the requirement of the concentration of simvastatin in tablet according to the USP 32:2009, no less than 90.0% and not more than 110.0% of the amount listed on the label.

Keyword:Method development, Validation, Simvastatin, Tablet, High Perfomance Liquid Chromatography, Isocratic.

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... v

ABSTRACT ... vi

DAFTAR ISI ... vii

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xvi

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 3

1.3 Hipotesis ... 4

1.4 Tujuan Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

2.1 Uraian Bahan ... 6

2.1.1 Sifat Fisiko Kimia Simvastatin ... 6

2.1.2 Mekanisme Kerja ... 6

2.1.3 Efek Samping ... 7

2.2.1 Sejarah Kromatografi ... 8

2.2.2 Pemakaian Kromatografi ... 8

2.2.3 Pembagian Kromatografi ... 9

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ... 9

2.3.1 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ... 11

2.3.2 Komponen KCKT ... 12

2.3.2.1 Wadah Fase Gerak ... 12

2.3.2.2 Pompa ... 13

2.3.2.3 Injektor ... 13

2.3.2.4 Kolom ... 15

2.3.2.5 Detektor ... 15

2.3.2.6 Alat Pengolah Data ... 16

2.3.2.7 Fase Gerak ... 16

2.3.2.8 Elusi Gradien dan Isokratik ... 17

2.3.2 Parameter penting dalam KCKT ... 12

2.3.3.1 Tinggi dan luas puncak ... 19

2.3.3.2 Waktu tambat ... 19

2.3.3.3 Faktor kapasitas ... 20

2.3.3.4 Selektifitas ... 20

2.3.3.5 Efisiensi kolom ... 21

2.3.3.6 Resolusi ... 21

2.3.3.7 Faktor asimetri ... 22

2.4 Penentuan Kadar Simvastatin Secara KCKT ... 23

2.5.1 Akurasi ... 24

2.5.2 Presisi ... 25

2.5.3 Spesifisitas ... 25

2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 25

2.5.5 Linearaitas ... 26

2.5.6 Rentang ... 27

2.5.7 Kekuatan ... 27

BAB III METODE PENELITIAN ... 28

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 28

3.2 Alat-alat ... 28

3.3 Bahan-bahan ... 28

3.4 Sampling Tablet Simvastatin ... 29

3.5 Prosedur Analisis ... 30

3.5.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ... 30

3.5.2 Pembuatan Pelarut ... 30

3.5.3 Penyiapan Alat KCKT ... 30

3.5.4 Optimasi Komposisi Fase Gerak ... 30

3.5.5 Analisis Kualitatif ... 31

3.5.6 Analisis Kuantitatif ... 31

3.5.6.1 Pembuatan Larutan Induk Baku I Simvastatin ... 31

3.5.6.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II Simvastatin .. 31

3.5.6.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi ... 32

3.5.6.4 Penetapan Kadar Simvastatin ... 32

3.6.1 Akurasi ... 33

3.6.1.1 Prosedur Akurasi ... 33

3.6.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi untuk Akurasi ... 38

3.6.2 Presisi ... 39

3.6.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 40

3.7 Analisis Data Secara Statistik ... 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 42

4.1 Panjang Gelombang Analisis ... 42

4.2 Optimasi Komposisi Fase Gerak ... 43

4.3 Analisa Kualitatif ... 46

4.4 Analisa Kuantitatif ... 49

4.4.1 Kurva Kalibrasi ... 49

4.4.2 Kadar Analit pada Sampel yang Dianalisis ... 49

4.5 Hasil Uji Validasi ... 50

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 53

5.1 Kesimpulan ... 53

4.2 Saran ... 54

DAFTAR PUSTAKA ... 55

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Pengaruh Komposisi Fase Gerak Terhadap Parameter

Kromatogram ... 43 Tabel 2. Hasil Penetapan Kadar Simvastatin dalam Sediaan Tablet ... 50 Tabel 3. Hasil Pengujian Validasi dengan Parameter Akurasi, Presisi, Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Simvastatin Pada Tablet Simvastatin Produksi Bernofarm dengan Menggunakan

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Diagram Skematik Alat KCKT ... 11 Gambar 2. Tipe Injektor dan Katup Putaran ... 14 Gambar 3. Kurva serapan maksimum simvastatin BPFI dengan pelarut

Asetonitril : air (80:20) ... 42 Gambar 4. Kromatogram Sampel Ethicol secara KCKT menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan

Fase gerak asetonitril : air (40:60), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 44 Gambar 5. Kromatogram Sampel Ethicol secara KCKT menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan

Fase gerak asetonitril : air (60:40), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 44 Gambar 6. Kromatogram larutan simvastatin sebelum spiking secara

KCKT menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20), laju alir volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 45 Gambar 7. Kromatogram larutan simvastatin sebelum spiking secara

KCKT menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20), laju alir volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 47 Gambar 8. Kromatogram larutan simvastatin hasil spiking secara KCKT menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20), laju alir volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 47 Gambar 9. Kromatogram larutan baku seri simvastatin secara KCKT

menggunakan Kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20), laju alir

1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, panjang gelombang

Gambar 10. Kurva Kalibrasi Baku Simvastatin ... 49 Gambar 11. Kurva Kalibrasi Baku Simvastatin untuk Validasi Metode ... 51 Gambar 12.Kromatogram penentuan kurva kalibrasi secara KCKT

menggunakan kolom Waters X- Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan

20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 57 Gambar 13.Kromatogram hasil penentuan kurva kalibrasi untuk sampel

Ethicol menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4, mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan

20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 59 Gambar 14. Kromatogram hasil penyuntikan sampel simvastatin

Produksi Dexa Medica secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan Fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan 20 µL dan deteksi pada panjang gelombang 238 nm dan

suhu 50°C ... ... 61 Gambar 15. Kromatogram hasil penyuntikan Selvim secara KCKT

menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril: air (80:20), laju alir 1,5ml / menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan 20 µL dan deteksi pada panjang gelombang

238 nm dan suhu 50°C ... 65 Gambar 16. Kromatogram hasil penyuntikan sampel tablet simvastatin

Produksi Bernofarm secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan

perbandingan fase gerak asetonitril: air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan 20 µL dan deteksi pada panjang gelombang 238 nm dan

suhu 50°C ... ... 68 Gambar 17. Kromatogram hasil penyuntikan sampel Ethicol secara KCKT

Menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan 20 µL dan deteksi pada panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... ... 71

Gambar 18. Kromatogram 1,2 dan 3 adalah sampel sebelum penambahan baku secara KCKT menggunakan kolom . Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan dan deteksi

pada panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 77

Gambar 19. Kromatogram 1,2 dan 3 adalah sampel sebelum penambahan baku secara KCKT menggunakan kolom . Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan dan deteksi pada panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 80

Gambar 20.Kromatogram hasil penentuan kurva kalibrasi untuk validasi Metode menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5ml/menit, volume penyuntikan 20 µL, penyuntikan 20 µL, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50°C ... 84

Gambar 21. Instrument KCKT (Shimadzu Prominence Series) ... 93

Gambar 22. Instrument Spektrofotometer (Shimadzu UV 1800) ... 93

Gambar 23. Heating Magnetic Stirrer (VELP) ... 94

Gambar 24. Alat Ultrasonic SONICA ... 94

Gambar 25. Pompa vakum (Boeco) ... 95

Gambar 26. Neraca Analitik Presica ... 95

Gambar 27. Micro Balance Mettler Toledo ... 96

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Gambar Kromatogram Penentuan Kurva Kalibrasi ... 57

Lampiran 2. Perhitungan Persamaan Regresi Simvastatin ... 58

Lampiran 3. Gambar kromatogram penentuan kurva kalibrasi untuk sampel Ethicol ... 59

Lampiran 4. Perhitungan persamaan kurva kalibrasi baku simvastatin Sampel Ethicol ... 60

Lampiran 5. Kromatogram Hasil Penyuntikan sampel Tablet Simvastatin Produksi Dexa Medica ... 61

Lampiran 6. Perhitungan Kadar Simvastatin Produksi Dexa Medica ... 62

Lampiran 7. Analisis Data Secara Statistik dari Hasil Penyuntikan Sampel Tablet Simvastatin Produksi Dexa Medica ... 63

Lampiran 8. Kromatogram Hasil Penyuntikan sampel Selvim ... 65

Lampiran 9. Perhitungan Kadar Tablet Selvim ... 66

Lampiran 10. Analisis Data Secara Statistik dari Hasil Penyuntikan Sampel Selvim ... 66

Lampiran 11. Kromatogram Hasil Penyuntikan sampel Tablet Simvastatin Produksi Bernofarm ... 68

Lampiran 12. Perhitungan Kadar Tablet Simvastatin Produksi Bernofarm ... 69

Lampiran 13. Analisis Data Secara Statistik dari Hasil Penyuntikan Sampel Tablet Simvastatin Produksi Bernofarm ... 69

Lampiran 14. Kromatogram Hasil Penyuntikan sampel Ethicol ... 71

Lampiran 15. Analisis Data Secara Statistik dari Hasil Penyuntikan Sampel Ethicol ... 72

Lampiran 16. Data Kadar Simvastatin dalam Sampel ... 74

Lampiran 17. Kromatogram Analisis Perolehan Kembali ... 75

Lampiran 19. Contoh Perhitungan untuk mencari Kadar Tablet Simvastatin

Generik (PT. Bernofarm) ... 82

Lampiran 20. Hasil Pengolahan Data Penetapan Kadar Simvastatin . ... 83

Lampiran 21. Gambar Kromatogram Penentuan Kurva Kalibrasi untuk Validasi Metode ... 84

Lampiran 22. Perhitungan Persamaan Regresi Recovery ... 85

Lampiran 23. Data Hasil Penyuntikkan Simvastatin Tablet Sebelum dan Sesudah Penambahan Analit ... 86

Lampiran 24. Data Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) ... 89

Lampiran 25. Tabel Distribusi t ... 90

Lampiran 26. Sertifikat Pengujian Baku Simvastatin ... 91

Lampiran 27. Spesifikasi Sampel ... 92

PENGEMBANGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN TABLET

MENGGUNAKAN FASE GERAK ASETONITRIL : AIR

ABSTRAK

Simvastatin merupakan obat antihiperlidemia yang termasuk golongan penghambat HMC-CoA reduktase. Monografi sismvastatin tablet tidak terdapat pada Farmakope Indonesia edisi IV, tetapi pada USP 32 tahun 2009 penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet ditentukan secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan fase gerak asetonitril : buffer asetat dengan sistem

isokratik, sedangkan pada penelitian sebelumnya menggunakan fase gerak

asetonitril : air dengan sistem elusi gradien. Adapun kelemahan dari kedua metode tersebut adalah pemakaian buffer yang tidak ramah terhadap kolom dan pemakain sistem elusi gradien yang rumit. Tujuan penelitian ini adalah pengembangan metode penetapan kadar simvastatin tablet secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) yang lebih aman terhadap kolom dan relatif lebih mudah digunakan.

Penetapan kadar simvastatin tablet dilakukan dengan sampling purposif dengan menggunakan dua sediaan tablet generik dan dua sediaan tablet nama dagang. Penelitian ini menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) , fase gerak asetonitril : air berbagai perbandingan dengan sistem elusi isokratik, laju alir 1,5 ml/menit, suhu kolom 50ºC dan panjang gelombang 238 nm. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak asetonitril : air untuk mendapatkan hasil yang terbaik secara KCKT dengan parameter tailing factor,

waktu retensi, nilai lempeng teori dan resolusi. Untuk menguji validitas metode ini, dilakukan uji validasi dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi dan batas kuantitasi.

Hasil pengembangan metode dengan menggunakan sistem elusi isokratik diperoleh fase gerak yang paling baik dengan perbandingan asetonitril : air (80:20). Hasil uji validasi diperoleh % recovery 99,67%, presisi (RSD) 1,89%, ini menunjukkan bahwa metode ini memiliki akurasi dan presisi yang baik dengan batas deteksi (LOD) 2,314 µg/ml dan batas kuantitasi (LOQ) 7,713 µg/ml. Dari hasil penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet diperoleh berturut-turut kadar dari yang tercantum di etiket untuk nama dagang Ethicol® 100,58 ± 0,17%, Selvim® 99,45 ± 1,23% dan dengan nama generik Dexa Medica 100,67 ± 0,02%, Bernofarm 101,70 ± 0,06%. Dapat disimpulkan bahwa semua sampel tablet simvastatin memenuhi persyaratan kadar menurut United Stated Pharmacopeia

(USP) 32 tahun 2009 yaitu tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

Kata kunci:Pengembangan metode, Validasi, Simvastatin, Tablet, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Isokratik.

METHOD DEVELOPMENT HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ASSAY OF SIMVASTATIN TABLETS IN USING

MOBILE PHASE ACETONITRILE : WATER ABSTRACT

Simvastatin is a drug that belonged to antihiperlidemia HMC-CoA reductase inhibitors. In the fourth edition of the Pharmacopoeia of Indonesia the sismvastatin’s tablet monograph is not available, but it is available in United States Pharmacopeia (USP) 32:2009. The assay of simvastatin tablet in the USP determined by high performance liquid chromatography (HPLC) using a mobile phase of acetonitrile: acetate buffer with an isocratic system, whereas in the previous study using a mobile phase of acetonitrile : water with gradient elution system. The limitation of both methods is the use of buffer that is not friendly to the column and the complication of gradient elution system usage. The purpose of this research is the development of HPLC assay method for simvastatin tablet where is more secure against column and relatively easy to use, this method is validated and is further applied to the determination of concentrations of simvastatin in tablet using generic and trade name as the sampels.

The Assay has been developed using a Waters X-Bridge column (250 x 4.6 mm), mobile phase of acetonitrile: water with isocratic elution system, a flow rate of 1.5 ml/min, column temperature 50ºC and a wavelength of 238 nm. In this study the optimation of this assay is done by changing the compotition of mobile phase to gain the best result of analysis. The validation parameters such as accuracy, precision, limit of detection and limit of quantitation is also performed.

This study shows the best result of simvastatin assay with a retention time of 2.7 minutes from isocratic elution system using acetonitrile : water (80:20) as the mobile phase. The validation test shows the % accuracy (recovery) and precision (RSD) of 99.67% and 1.89% respectively, indicating that the method has good accuracy and precision. The limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) is found to be 2.314 µg/ml and 7.713 µg/ml respectively. The determination using the developed procedure result concentration of simvastatin of 100.58 ± 0.17% for Ethicol®, 99.45 ± 1.23% for Selvim®, the 100.67 ± 0.02% for Simvastatin generic from Dexa Medica, 101.70 ± 0.06% for Simvastatin generic from Bernofarm. It can be concluded that all samples meet the requirement of the concentration of simvastatin in tablet according to the USP 32:2009, no less than 90.0% and not more than 110.0% of the amount listed on the label.

Keyword:Method development, Validation, Simvastatin, Tablet, High Perfomance Liquid Chromatography, Isocratic.

BAB I PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Simvastatin merupakan obat antihiperlidemia yang bekerja dengan cara menghambat enzim HMG-CoA reduktase. HMG-CoA merupakan pembentuk kolesterol dengan bantuan katalis enzim HMG-CoA reduktase. Obat ini mempunyai aktivitas menghambat pembentukan kolesterol atau mempromosikan degradasi kolesterol sehingga dapat menurunkan kadar kolesterol dan serum trigliserida dalam darah serta meningkatkan kadar HDL dalam darah (Yassin, 2007), namun kelebihan dosis dari simvastatin dapat menyebabkan myophaty (Brenner dan Stevens, 2010).

Pada pembuatan obat, pemeriksaan kadar zat aktif merupakan persyaratan yang harus dipenuhi untuk menjamin kualitas obat. Sediaan obat yang berkualitas baik akan mendukung tercapainya efek terapeutik yang diharapkan. Salah satu persyaratan mutu adalah kadar yang dikandung harus memenuhi persyaratan kadar yang tercantum dalam literatur yang berlaku seperti Farmakope Indonesia (Depkes RI, 1989).

Tablet simvastatin dalam perdagangan dijumpai dengan nama dagang dan generik, dimana obat dengan nama generik harganya jauh lebih murah dibanding dengan obat dengan nama dagang. Sementara masyarakat cenderung menilai bahwa kualitas obat identik dengan harga yang lebih tinggi, obat yang lebih mahal mutunya lebih baik daripada obat yang lebih murah harganya (Depkes RI, 1989).

Monografi simvastatin tablet tidak terdapat pada Farmakope Indonesia edisi IV, tetapi terdapat pada USP 32 tahun 2009 yaitu penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) menggunakan fase gerak asetonitril : buffer (65:35) dengan sistem elusi isokratik.

Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan penetapan kadar simvastatin tablet

dengan menggunakan kolomPhenomenex ODS Luna (250 mm x 4,6 mm) pada

suhu 50ºC dengan laju alir 1,5 ml/menit pada panjang gelombang 238 nm secara sistem elusi gradien. Metode tersebut menggunakan larutan buffer sebagai pelarut

pada perbandingan fase gerak asetonitril : air (40:60) yang dimulai pada menit ke 0 dan berakhir pada menit ke 10 dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (100:0) menghasilkan waktu retensi diantara menit ke 9 sampai 10 (Guzik dkk, 2010).

Metode dengan prosedur tersebut di atas memiliki berbagai kelemahan, seperti pemakaian larutan buffer bersamaan dengan asetonitril yang tidak ramah

terhadap kolom (USP, 2009) dan sistem elusi gradien yang lebih rumit dari sistem isokratik (Guzik dkk, 2010). Sistem elusi isokratik lebih disukai karena komposisi fase gerak tetap konstan selama pengujian, sehingga sistem dan kolom dalam keadaan yang seimbang sepanjang waktu dan terjaga dari kemungkinan kerusakan akibat terjadinya perubahan kimia yang cepat seperti pada sistem elusi gradien, tetapi sistem gradien lebih banyak dipakai karena menghasilkan pemisahan yang lebih baik (Anonim, 1997).

Berdasarkan hal diatas, peneliti tertarik untuk mengembangkan suatu metoda penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet yang lebih sederhana, murah dan lebih ramah terhadap kolom dengan menggunakan pelarut dan fase

gerak asetonitril-air. Pengembangan metode tersebut dilakukan dengan menggunakan metode elusi isokratik dengan berbagai perbandingan komposisi fase gerak untuk memperoleh hasil yang optimal. Untuk menguji validitas dari metode ini dilakukan pengujian antara lain uji akurasi dengan parameter

%recovery, uji presisi dengan parameter koefisien variasi (RSD), uji sensitifitas

dengan parameter limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ), selanjutnya metode yang tervalidasi ini diaplikasikan pada penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet dengan nama dagang dan nama generik yang beredar di pasaran.

1.2Perumusan Masalah

Adapun yang menjadi permasalahan dalam penelitian ini adalah:

1. Berapakah perbandingan komposisi fase gerak asetonitril : air yang optimal (waktu elusi lebih cepat) dengan sistem elusi isokratik secara KCKT pada penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet dan memenuhi uji persyaratan validasi metode?

2. Apakah kadar simvastatin dalam sediaan tablet baik nama dagang maupun nama generik yang beredar dipasaran memenuhi persyaratan kadar menurut USP 32 tahun 2009?

1.3Hipotesis

Hipotesis penelitian ini adalah:

1. Metode KCKT menggunakan fase gerak asetonitril : air dengan

perbandingan tertentu dan sistem elusi isokratik akan memberikan hasil yang optimal untuk digunakan pada penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet memenuhi persyaratan uji validasi metode.

2. Kadar simvastatin dalam sediaan tablet baik nama dagang maupun nama generik yang beredar dipasaran memenuhi persyaratan kadar menurut USP 32 tahun 2009.

1.4Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah:

1. Untuk menentukan perbandingan yang optimal dari fase gerak asetonitril :

air dengan sistem elusi isokratik pada penetapan kadar

simvastatintabletsecara KCKT dan menguji dari validitas metode tersebut. 2. Untuk mengetahui kesesuaian kadar simvastatin dalam sediaan tablet

nama dagang dan nama generik yang beredar dipasaran dengan persyaratan kadar menurut USP 32 tahun 2009.

1.5Manfaat Penelitian

Penelitian ini dapat digunakan sebagai metode alternatif pada penetapan kadar simvastatin dalam sediaan tablet secara KCKT untuk industri farmasi dan Badan Pengawas Obat dan Makanan karena lebih hemat dan efisien.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Uraian Bahan

2.1.1 Sifat fisiko kimia simvastatin

Menurut Moffat, et al., (2004), sifat fisiko kimia simvastatin adalah sebagai berikut:

Rumus struktur:

Gambar 1. Struktur Simvastatin Rumus Molekul : C25H38O5

Berat Molekul : 418,6

Titik Lebur : 135o sampai 138oC

Pemerian : Serbuk kristal putih

Kelarutan : Tidak larut dalam air, n-heksana, dan asam klorida; larut dalam kloroform, dimetil sulfoksida, metanol,

2.1.2. Mekanisme kerja

Simvastatin merupakan obat antihiperlidemia yang strukturnya beranalog dengan HMG-CoA reduktase sehingga dapat menghambat kerjanya. HMG-CoA (3-hydroxy-3-methglutaryl coenzyme A) reduktase adalah suatu enzim yang

perubahan) dalam pembentukan kolesterol. Obat ini mempunyai aktivitas menghambat pembentukan kolesterol atau mempromosikan degradasi kolesterol. Aktivitas obat ini dapat menurunkan kadar kolesterol dan serum trigliserida dalam darah serta meningkatkan kadar HDL dalam darah (Katzung, dkk., 2008).

HMG-CoA reduktase dapat mengubah HMG-CoA menjadi asam mevalonat yang merupakan enzim dalam biosintesis kolesterol. Simvastatin bekerja secara kompetitif menghambat enzim ini sehingga dapat mengurangi biosintesis kolesterol di hati dan jumlah kolesterol yang dapat diubah menjadi VLDL. Kejadian ini akan berujung kepada meningkatnya masukan LDL-kolesterol di hati (Brenner dan Stevens, 2010).

Simvastatin berdaya menurunkan kadar Low Density Lipoprotein (LDL)

dan kolesterol total dalam 2-4 minggu. Kadar Very Low Density Lipoprotein

(VLDL) dan Trigliserida (TG) juga dapat diturunkan, sedangkan High Density

Lipoprotein (HDL) dinaikkan sedikit. Digunakan tersendiri atau dikombinasi

dengan damar. Khasiat menurunkan LDL-nya kuat, tetapi lebih lemah daripada atorvastatin. DosisPermulaan 10 mg pada malam hari, bila perlu dinaikkan dengan interval 4 minggu sampai maksimal 40 mg (Tan dan Rahardja, 2007).

2.1.3 Efek samping

Simvastatin umumnya dapat ditoleransi baik di tubuh, tetapi mungkin dapat menimbulkan efek samping yang serius kepada sedikit orang. Efek samping yang paling sering terjadi adalah masalah gastrointestinal, meliputi keram bagian perut dan konstipasi. Efek samping yang jarang terjadi adalah hepatitis yang disebabkan meningkatnya kadar enzim hepatik. Efek samping yang paling serius adalah rhabdomyolisis, yang berawal dari myophaty (Brenner dan Stevens, 2010).

2.2 Teori Kromatografi 2.2.1 Sejarah kromatografi

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan, yaitu berdasarkan absorbs sampel diantara suatu fase gerak dan fase diam. Penemukromatografi adalah Tswett pada tahun 1903 mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan Tswett untuk

melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Tswett adalah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi (Johnson dan Stevenson, 1978).

2.2.2 Pemakaian kromatografi

Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya senyawa tertentu dalam cuplikan. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing komponen campuran, sedangkan pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran dalam jumlah memadai dalam keadaan murni (Gritter dkk, 1985).

2.2.3 Pembagian kromatografi

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam, tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi : (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi eksklusi ukuran dan (f) kromatografi afinitas (Johnson dan Stevenson, 1978).

Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis, yang kedua sering disebut

kromatografi planar; (c) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan (d) kromatografi gas (KG) (Johnson dan Stevenson, 1978; Gandjar dan Rohman, 2007).

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995). KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan

analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling

sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain.

Menurut De Lux Putra (2007), kelebihan KCKT antara lain:

a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran. Resolusinya

baik.

b. Mudah melaksanakannya.

d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis. e. Dapat digunakan bermacam-macam detektor.

f. Kolom dapat digunakan kembali. g. Mudah melakukan rekoveri cuplikan.

h. Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan

reprodusibilitasnya lebih baik.

i. Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan

kuantitatif.

j. Waktu analisis umumnya singkat.

k. Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar. l. Ideal untuk molekul besar dan ion.

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Munson, 1984).

2.3.1 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Instrumentasi KCKT terdiri atas wadah fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor, dan pengolah data. Diagram skematik alat KCKT ditunjukkan oleh Gambar 1.

Gambar 1. Diagram Skematik Alat KCKT (Gandjar dan Rohman, 2009).

2.3.2 Komponen KCKT 2.3.2.1 Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus dapat memuat fase gerak untuk KCKT dalam jumlah yang cukup untuk jalannya sistem secara terus menerus. Wadah fase gerak dapat dilengkapi dengan sistem degassing terhubung dengan alat KCKT

serta saringan khusus untuk memisahkan fase gerak dari pengaruh lingkungan (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

Wadah fase gerak harus bersih dari lembam (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak

sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada

fase gerak, sebab dengan adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka akan sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi,

dan lebih terpilih lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan

pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau dalam tabung sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar dan Rohman, 2009).

2.3.2.2 Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat pelarut yakni harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit (Gandjar dan Rohman, 2009).

Pompa harus menjamin tersedianya aliran fase gerak yang secara terus menerus melewati sistem. Kebanyakan pompa modern memungkinkan untuk mencampur berbagai fase gerak yang diambil dari wadah yang berbeda (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

2.3.2.3 Injektor

Menurut Kazakevich dan Lobrutto (2007), larutan sampel masuk ke arus fase gerak melalui injektor sebelum mencapai kolom untuk pemisahan analit;

kebanyakan injektor modern adalah autosampler, yang memungkinkan

pengaturan program untuk penginjekan larutan sampel dalam volume yang berbeda. Larutan sampel diletakkan di dalam vial pada wadah autosampler.

Sedangkan untuk injektor konvensional terdiri dari 3 jenis, yaitu :

a. Hentikan aliran/stop flow: aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja

atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b. Septum: injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Disamping itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Katup putaran (loop valve): tipe injektor ini umumnya digunakan untuk

menginjeksi volume lebih besar daripada 10 μl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi Load, sampel loop

(cuplikan dalam putaran) diisi pada tekanan atmotsfir. Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.

Gambar 2. Tipe injektor dan katup putaran

2.3.2.4 Kolom

Kolom merupakan jantung dari sistem kromatografi cair kinerja tinggi yang fungsinya adalah melakukan pemisahan analit dari campuran. Kolom adalah tempat dimana fase gerak berkontak dengan fase diam, membentuk suatu antarmuka dengan permukaan yang besar. Sebagian besar pengembangan kolom akhir-akhir ini dititik beratkan pada cara untuk meningkatkan kontak antar muka (Kazakevich dan Lobrutto, 2007).

Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok:

1. Kolom analitik: diameter khas adalah 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis kemasan. Untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm. Untuk kemasan mikropartikel berpori, umumnya 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom tergantung pada mode KCKT yang digunakan.

2.3.2.5 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, rentang respons linier yang

luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1978).

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 254 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor indeks refraksi juga secara luas digunakan, terutama dalam kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif dari pada detektor spektrofotometer UV. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan (Johnson dan Stevenson, 1978).

2.3.2.6 Alat pengolah data

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor dan memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dievaluasi oleh seorang analis (Gandjar dan Rohman, 2009).

2.3.2.7 Fase gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan daya resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2009).

Pada KCKT, susunan pelarut atau fase gerak merupakan salah satu hal penting yang mempengaruhi proses pemisahan. Berbagai macam pelarut dipakai dalam semua jenis KCKT, tetapi ada beberapa syarat fase gerak yang digunakan dalam KCKT. Menurut Jhonson dan Stevenson (1978), kriteria fase gerak yang ideal adalah sebagai berikut:

a. Murni, tanpa cemaran;

b. Tidak bereaksi dengan kemasan; c. Sesuai dengan detektor;

d. Dapat melarutkan cuplikan; e. Mempunyai viskositas rendah;

f. Memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah, jika diperlukan; g. Harganya wajar.

Pada umumnya, pelarut dibuang setelah digunakan karena tata kerja pemurniannya memakan waktu dan mahal. Dari semua persyaratan di atas, 4

persyaratan pertama merupakan yang paling penting (Jhonson dan Stevenson, 1978).

2.3.2.8 Elusi isokratik dan gradien

Menurut Gritter, dkk., (1985), elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi 2 sistem yaitu:

1. Sistem elusi isokratik

Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap (komposisi fase gerak tetap selama elusi). 2. Sistem elusi gradien

Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan perbandingan fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi).

Analisis isokraktik sudah umum dipakai pada aplikasi quality control.

Kelemahan dari sistem ini adalah kapasitas puncak pada kromatogram yang terbatas (jumlah puncak maksimum yang dapat diakomodasi pada kromatogram) dan masalah pada sampel yang mempunyai polaritas yang berbeda, juga lambat mengelusi (contohnya pada dimer) sangat sulit di hitung pada analisis dengan sistem isokratik karena bentuk puncak yang sangat melebar dan waktu retensi yang lama (Ahuja dan Dong, 2005).

Berlawanan dengan sistem isokratik, analisis dengan sistem gradien yang memungkinkan untuk menaikkan kekuatan dari fase gerak selama proses elusi sangat baik untuk sampel kompleks dan sampel yang mempunyai analit dengan polaritas yang luas. Sistem gradien dapat digunakan untuk screening dengan hasil

yang baik untuk puncak yang keluar pada waktu-waktu awal elusi dan memberikan puncak yang lebih tajam pada puncak yang keluar pada akhir elusi. Kekurangannya adalah memerlukan peralatan yang lebih kompleks dan keahlian yang lebih tinggi untuk mengembangkan metode serta kesulitan dalan mentransfer metode (Ahuja dan Dong, 2005).

2.3.3 Parameter penting dalam KCKT 2.3.3.1 Tinggi dan luas puncak

Tinggi dan luas puncak berkaitan secara proporsional dengan kadar atau jumlah analit tertentu yang terdapat dalam sampel (memiliki informasi kuantitatif). Namun demikian, luas puncak lebih umum digunakan dalam perhitungan kuantitatif karena lebih akurat/cermat daripada perhitungan menggunakan tinggi puncak (Ahuja dan Dong, 2005). Hal ini dikarenakan luas puncak relatif tidak banyak dipengaruhi oleh kondisi kromatografi, kecuali laju alir. Sementara itu, tinggi puncak dipengaruhi oleh banyak faktor seperti misalnya faktor tambat, suhu kolom serta cara injeksi sampel (Miller, 2005). Hal ini akan menyebabkan tinggi puncak relatif labil selama analisis. Namun demikian tinggi puncak masih dapat digunakan dalam perhitungan kuantitatif bila puncak analit simetris (Meyer, 2004).

2.3.3.2 Waktu tambat

Periode waktu antara penyuntikan sampel dan puncak maksimum yang terekam oleh detektor disebut sebagai waktu tambat.Waktu tambat dari suatu komponen yang tidak ditahan oleh fase diam disebut sebagai waktu hampa/void time (t0). Waktu tambat merupakan fungsi dari laju alir fase gerak dan panjang

kolom. Jika fase gerak mengalir lebih lambat atau kolom semakin panjang, waktu hampa dan waktu tambat akan semakin besar, dan sebaliknya bila fase gerak mengalir lebih cepat atau kolom semakin pendek, maka waktu hampa dan waktu tambat akan semakin kecil (Meyer, 2004).

2.3.3.3 Faktor kapasitas

Waktu tambat dipengaruhi oleh laju alir, ukuran kolom dan parameter yang lain. Oleh karena itu, diperlukan suatu ukuran derajat tambatan dari analit yang lebih independen yakni faktor kapasitas (Meyer, 2004). Dalam beberapa literatur lain, faktor kapasitas juga disebut sebagai faktor tambat (k’). Idealnya, analit yang sama jika diukur pada dua instrumen berbeda dengan ukuran kolom yang berbeda namun memiliki fase diam dan fase gerakyang sama, maka faktor tambat dari analit pada kedua sistem KCKT tersebut secara teoritis adalah sama (Meyer, 2004). Faktor tambat yang disukai berada di antara nilai 1 hingga 10. Jika nilai k’ terlalu kecil menunjukkan bahwa analit terlalu cepat melewati kolom sehingga tidak terjadi interaksi dengan fase diam dan oleh karena itu tidak akan muncul dalam kromatogram. Sebaliknya, nilai k’ yang terlalu besar mengindikasikan waktu analisis akan panjang. Nilai k’ dari analit yang lebih besar dari 10 akan menjadi masalah dalam analisis KCKT karena waktu analisis yang terlalu panjang dan sensitifitas yang buruk sebagai akibat dari pelebaran puncak yang berlebihan (Meyer, 2004).

2.3.3.4 Selektifitas

Proses pemisahan antara dua komponen dalam KCKT hanya memungkinkan bila kedua komponen memiliki kecepatan yang berbeda dalam melewati kolom. Kemampuan sistem kromatografi dalam

memisahkan/membedakan analit yang berbeda dikenal sebagai selektifitas (a).Selektifitas umumnya tergantung pada sifat analit itu sendiri, interaksinya dengan permukaan fase diam serta jenis fase gerak yang digunakan. Nilai selektifitas yang didapatkan dalam sistem KCKT harus lebih besar dari 1. Selektifitas disebut juga sebagai faktor pemisahan atau tambatan relatif (Meyer, 2004).

2.3.3.5 Efisiensi kolom

Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis. Bilangan lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya semakin kecilnya nilai H. Istilah H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP (high equivalent

theoretical plate) yang mana merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk

menghasilkan satu lempeng teoritis. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng yang tinggi dan nilai H yang rendah, untuk mencapai hal ini ada beberapa faktor yang mendukung yaitu kolom yang dikemas dengan baik, kolom yang lebih panjang, partikel fase diam yang lebih kecil, viskositas fase gerak yang lebih rendah dan suhu yang lebih tinggi, molekul-molekul sampel yang lebih kecil, dan pengaruh di luar kolom yang minimal (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.3.3.6 Resolusi

Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan, untuk hasil pemisahan yang baik puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara

sempurna dari puncak lainnya. Resolusi adalah perbedaan waktu retensi 2 puncakyang saling berdekatan, dibagi dengan rata-rata lebar puncak, dengan rumus sebagai berikut:

Keterangan:

t = waktu retensi puncak W = lebar puncak

Nilai Rs mendekati atau lebih dari 1,5 akan memberikan pemisahan yang baik (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.3.3.7 Faktor Asimetri

Adanya puncak yang asimetris dapat disebabkan oleh hal–hal berikut:

a. Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka fase gerak tidak mampu membawa solut dengan sempurna karenanya terjadi pengekoran atau tailing.

b. Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.

c. Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu

sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting) (Gandjar dan

Rohman, 2007).

2.4 Penentuan Kadar Simvastatin Secara KCKT

Menurut Abu-Nameh, et al., (2006) simvastatin tablet dapat ditentukan kadarnya dengan metode KCKT menggunakan kolom C18 Hypersil, fase gerak

W2)

(W1

t1)

-2(t2

RS

+

=

asetonitril-buffer fosfat-metanol (5:3:1) dan dideteksi pada panjang gelombang 230 nm. Metode tersebut telah divalidasi dan memenuhi syarat linearitas, presisi, akurasi, spesifisitas dan sensitivitas. Serta diperolehnya koefisien regresi sebesar 0,9995. Pada penelitian Guzik, et al., (2010) dilakukan perbandingan dan validasi dua metode untuk analisis simvastatin dengan KCKT menggunakan campuran pelarut yang berbeda yaitu asetonitril-air dan metanol-air dalam sistem elusi gradien. Percobaan juga dilakukan pada beberapa jenis kolom dan temperatur yang berbeda-beda. Parameter validasi memenuhi persyaratan untuk kedua metode tersebut.

Pada penelitian Kumar dan Gowda (2012), dilakukan juga penetapan kadar simvastatin dengan KCKT menggunakan campuran pelarut metanol-0,1% asam ortofosfat di dalam air (10:90) pada panjang gelombang 238 nm. Waktu retensi berada pada menit ke 3,106. Metode tersebut divalidasi dengan parameter spesifisitas, linearitas, presisi, akurasi dan kekasaran. Dimana diperoleh %

recovery 97,45-98,32 % serta koefisien korelasi sebesar 0,9999.

2.5 Validasi Metode

Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang di analisis. Suatu metode analisis harus di validasi untuk verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi masalah dalam analisis. Parameter analisis yang ditentukan pada vaidasi adalah akurasi, presisi, batas deteksi, batas kuantitasi, spesifiksi, linieritas dan rentang, kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan

2.5.1 Akurasi

Akurasi/kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery). Akurasi/kecermatan dapat

ditentukan dengan dua metode, yakni spiked placebo recovery dan standard

addition method. Pada spiked placebo recovery atau metode simulasi, analit murni

ditambahkan (spiked) ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu

campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit hasil analisis dibandingkan dengan jumlah analit teoritis yang diharapkan. Jika plasebo tidak memungkinkan untuk disiapkan, maka sejumlah analit yang telah diketahui konsentrasinya dapat ditambahkan langsung ke dalam sediaan farmasi otentik. Metode ini dinamakan

metode standard addition method atau metode penambahan baku. Jumlah

keseluruhan analit kemudian diukur dan dibandingkan dengan jumlah teoritis, yaitu jumlah analit yang murni berasal dari sediaan farmasi otentik tersebut, ditambah dengan jumlah analit yg di-spiked ke dalam sediaan (Harmita, 2004).

2.5.2 Presisi

Presisi diekspresikan dengan standar deviasi atau standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian data. Data untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian dari kajian-kajian lain yang berkaitan dengan presisi seperti linearitas atau akurasi. Biasnya replikasi 6-15 dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap-tiap konsentrasi. Pada pengujian dengan KCKT, nilai RSD antara 1-2% biasanya dipersyaratkan untuk senyawa-senyawa aktif dalam jumlah yang banyak

sedangkan untuk senyawa-senyawa dengan kadar sekelumit RSD berkisar antara 5-15% (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.3 Spesifitas

Penentuan spesifitas metode dapat diperoleh dengan dua jalan. Cara pertama adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju > 1,5). Cara kedua untuk memperoleh spesifitas adalah dengan menggunakan detektor selektif terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama-sama sebagai contoh detektor elektrokimia hanya akan mendeteksi senyawa tertentu, sementara senyawa yang lainnya tidak terdeteksi. Penggunaan detektor UV pada panjang gelombang yang spesifik juga merupakan cara yang efektif untuk melakukan pengukuran selektifitas (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat ditentukan dengan 2 metode yakni metode non instrumental visual dan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatografi lapis tipis dan metode titrimetri. Metode perhitungan didasarkan pada simpangan baku respon (SB) dan derajat kemiringan/slope (b) dengan rumus perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi sbb:

Batas deteksi (LOD) =

slope X SY x 3

Batas kuantitasi (LOQ) =

slope X SY x 10

Simpangan baku respon dapat ditentukan berdasarkan simpangan baku blanko, simpangan baku residual dari garis regresi atau simpangan baku intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.5 Linearitas

Lineritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linearitas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.6 Rentang

Rentang atau kisaran suatu metode didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan linearitas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.7 Kekuatan

Kekuatan/ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti persentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, suhu, dan sebagainya. Suatu praktek yang baik untuk mengevaluasi ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasi parameter-parameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan (Gandjar dan Rohman, 2007).

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Pengujian Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di Medan pada bulan Maret 2013 sampai Juni 2013.

3.2 Alat–alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (Shimadzu prominence series) dengan pompa

(LC-20AD),degasser (DGU- 20As), injektor (Rheodyne 7225i), kolom Waters X-Bridge C18 (250mm x 4,6 mm), detektor UV/Vis (SPD-20A), Auto Sampler for HPLC Shimadzu 20A HT, spektrofotometer UV-Vis (UV Probe 1800 Shimadzu), wadah fase gerak, sonifikator (SONICA), pompa vakum (Gast DOA - P604-BN), neraca analitik (Mettler Toledo), membran filter PTFE 0,5 dan 0,2 µm,

cellulose nitrat membran filter 0,45µ m dan alat-alat gelas laboratorium.

3.3 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simvastatin (BPFI), metanol grade HPLC (Merck), asetonitril grade HPLC (Merck), aqua

bidestilata (PT.Ikapharmindo Putramas), tablet simvastatin 10 mg produksi Dexa medica, tablet simvastatin 10 mg Produksi Bernofarm, tablet simvastatin 10 mg Selvim® dan tablet simvastatin 10 mg Ethicol®.

3.4 Sampling Tablet Simvastatin

Pengambilan sampel secara purposif yaitu tanpa membandingkan antara satu tempat dengan tempat lain, karena tempat pengambilan sampel dianggap homogen (Sudjana, 2001). Menurut Torbeck (1997), proses sampling dilakukan dengan menggunakan rumus:

1

+

= N

n

Keterangan:

n = jumlah sampel yang diteliti N = jumlah sampel dalam populasi

Sampel tablet simvastatin yang berhasil di data oleh peneliti dan beredar di kota Medan berjumlah 10 sampel, yang terdiri dari 5 sampel dengan nama dagang dan 5 sampel dengan nama generik. Sehingga perhitungannya menjadi sebagai berikut:

� =√�+ 1 � =√10 + 1 = 4

maka jumlah sampel yang dipakai dalam penelitian ini adalah sebanyak 4 sampel yang terdiri dari 2 sampel obat dengan nama dagang dan 2 sampel obat dengan nama generik. Pengambilan sampel dengan nama dagang dimaksudkan untuk mewakili harga dari yang termahal (Ethicol) dan yang termurah (Selvim), sedangkan dalam pemilihan sampel dengan nama generik, dasar pertimbangannya adalah produk yang sudah banyak beredar di apotik kota Medan (Dexa Medica) dengan produk yang baru beredar (Bernofarm).

3.5 Prosedur Analisis

3.5.1 Penentuan panjang gelombang maksimum

Pengukuran absorbansi maksimum simvastatin dilakukan dengan membuat larutan simvastatin BPFI dalam pelarut asetonitril : air (80:20) dengan konsentrasi 8,0 µg/ml. Larutan diukur pada rentang panjang gelombang 200-350 nm menggunakan spektrofotometer ultraviolet.

3.5.2 Pembuatan pelarut

Dicampurkan asetonitril dan air dengan komposisi yang disesuaikan dengan perbandingan fase gerak yang di optimasi, kemudian diawaudarakan selama ± 20 menit.

3.5.3 Penyiapan alat KCKT

Kolom yang digunakan Waters X-Bridge (250mm x 4,6 mm), dan detektor UV-Vis. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan low-pressure gradient

system untuk memperoleh komposisi fase gerak yang konstan selama analisis.

Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar yang menandakan sistem tersebut telah stabil.

3.5.4 Optimasi komposisi fase gerak

Optimasi komposisi fase gerak dilakukan dengan menginjeksikan 20 µL analit ke sistem KCKT. Kondisi pengukuran adalah metode isokratik dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (40:60 ; 60:40 dan 80:20), laju alir 1,5 ml/menit yang diukur pada panjang gelombang 238 nm menggunakan suhu 50ºC.

3.5.5 Analisis kualitatif

Larutan baku simvastatin diinjeksikan terlebih dahulu, dilanjutkan dengan larutan sampel masing-masing sebanyak 20µl, dianalisis pada kondisi KCKT dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air yang terpilih dengan laju alir 1,5 ml/menit pada panjang gelombang 238 nm dan suhu 50ºC. Selanjutnya untuk identifikasi, pada larutan sampel tersebut ditambahkan sejumlah tertentu larutan simvastatin BPFI (spiking) kemudian diinjeksikan dan dianalisis kembali pada

kondisi KCKT yang sama. Diamati kembali luas area dan dibandingkan antara kromatogram hasil spiking dengan kromatogram larutan sampel sebelum spiking.

Sampel dinyatakan mengandung simvastatin, jika terjadi peningkatan tinggi puncak dan luas area pada kromatogram hasil spiking.

3.5.6 Analisis kuantitatif

3.5.6.1 Pembuatan larutan induk baku I simvastatin

Ditimbang secara seksama 10 mg simvastatin BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan simvastatin BPFI dengan konsentrasi 1000 µg/ml.

3.5.6.2 Pembuatan larutan induk baku II simvastatin

Dipipet 5 ml dari larutan induk baku I ke dalam labu tentukur 10 ml. Diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 µg/ml.

3.5.6.3 Pembuatan kurva kalibrasi

Dipipet masing-masing sebanyak 2,0ml; 4,0 ml; 6,0 ml dan 8,0 ml dari larutan induk baku II ke dalam labu tentukur 10 ml. Diencerkan dengan fase gerak

hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 20 µg/ml, 60 µg/ml, 40 µg/ml, dan 80 µg/ml. Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2µ m kemudian diawaudarakan selama ± 30 menit. Masing-masing larutan diinjeksikan ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20µ l diukur pada panjang gelombang 238nm dengan laju alir 1,5ml/menit dan suhu 50ºC. Kemudian dihitung regrasi (y = ax + b), dimana y adalah luas area puncak kromatogram dan x adalah konsentrasi baku yang disuntikkan.

3.5.6.4 Penetapan kadar simvastatin

Ditimbang dan diserbukkan 20 tablet simvastatin kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara 10,0 mg simvastatin lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan fase gerak asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda. Dari larutan tersebut di pipet 6,0 ml, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml lalu diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda. Dikocok-kocok ±5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m. Larutan sampel disuntuikkan ke dalam sistem KCKT. Konsentrasi diperoleh dengan cara mensubtitusi luas area yang diperoleh kedalam persamaan regresi. Sedangkan kadar dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Konsentrasi simvastatin per tablet (Cp) = Cs x V

Keterangan :

Cs = Konsentrasi simvastatin dari larutan yang diencerkan (µg/ml)

Cu = Konsentrasi larutan uji saat diinjeksi (µg/ml) Cp = Konsentrasi simvastatin per tablet (mg)

Ce = Konsentrasi simvastatin yang tertera pada etiket (mg) V = Volume awal larutan uji (ml)

x 100 (%)

=

Kadar simvastatin terhadap kadar yang tercantum di etiket

Cp x Bu Ce x Br

Cu x Fp x Kadar Baku (%) Cs =

Br = Bobot uji (mg)

Bu = Bobot rara-rata penimbangan 20 tablet (mg)

3.6 Validasi Metode 3.6.1 Akurasi

Ditimbang 20 tablet kemudian ditentukan pada rentang spesifik 80%, 100% dan 120% terhadap berat yang sama seperti pada penetapan kadar sampel yaitu setara 10 mg simvastatin. Ditimbang serbuk yang mengandung 70% analit dari rentang spesifik lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Ditimbang lagi serbuk yang mengandung 70% analit rentang spesifik dan 30% bahan baku lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Dilakukan 3 kali replikasi untuk masing-masing rentang spesifik tersebut.

3.6.1.1 Prosedur Akurasi

Berat 1 tablet simvastatin mengandung 10 mg simvastatin Berat 20 tablet: 2526,6 mg

Rentang spesifik 80%, 100%, 120% dimana setiap rentang mengandung 70% analit dan 30% baku pembanding

A. Perhitungan Pembuatan Larutan sampel + baku simvastatin 10 mg

1. Rentang 80%

80 % = 80/100 x 10 mg = 8 mg

- Berat analit 70 % = 70/100 x 8 mg = 5,6 mg Berat sampel yang ditimbang = 5,6 ��

20 � 10 ��� 2,5266 � = 70,7448 mg

- Baku 30 %

Cara Pembuatan Larutan Sampel

Ditimbang serbuk sampel 70,7 mg setara dengan 5,6 mg simvastatin, lalu dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 112 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 22,4 µg/ml. Dikocok 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

Cara Pembuatan Larutan Sampel Ditambah Dengan Baku

Ditimbang 2,4 mg bahan baku dan 70,7 mg sampel kemudian dimasukkan

kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 160 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 32 µg/ml. Dikocok 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

2. Rentang 100 %

100 % = 100/100 x 10 mg = 10 mg

- Berat analit 70 % = 70/100 x 10 mg = 7 mg Berat sampel yang ditimbang = 7 ��

20 � 10 ��� 2,5266 � = 88,4310

mg

- Baku 30 %

= 30/100 x 10 mg = 3 mg

Cara Pembuatan Larutan Sampel

Ditimbang serbuk sampel 88,4 mg setara dengan 7 mg simvastatin, lalu

dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 140 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 28 µg/ml. Dikocok 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

Cara Pembuatan Larutan Sampel Ditambah Dengan Baku

Ditimbang 3 mg bahan baku dan 88,4 mg sampel kemudian dimasukkan

(80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 40 µg/ml. Dikocok 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

3. Larutan sampel + baku simvastatin 120 % 120 % = 120/100 x 10 mg = 12 mg

- Berat analit 70 % = 70/100 x 12 mg = 8,4 mg Berat sampel yang ditimbang = 8,4 ��

20 � 10 ��� 2,5266 � = 106,1172

mg

- Baku 30 %

= 30/100 x 12 mg = 3,6 mg

Cara Pembuatan Larutan Sampel

Ditimbang serbuk sampel 106,1 mg setara dengan 8,4 mg simvastatin, lalu dimasukkan kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 168 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 33.6 µg/ml. Dikocok 5 menit

lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

Cara Pembuatan Larutan Sampel Ditambah Dengan Baku

Ditimbang 3 mg bahan baku dan 106,1 mg sampel kemudian dimasukkan

kedalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan asetonitril : air (80:20) hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 240 µg/ml, dikocok 5 menit kemudian disaring dengan kertas saring. Dipipet 2 ml filtrat, dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dan dicukupkan hingga garis tanda sehingga didapatkan konsentrasi 48 µg/ml. Dikocok 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,45 µm. Disuntikkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm dengan perbandingan fase gerak asetonitril : air (80:20), laju alir 1,5 ml/menit. Dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan.

Menurut Harmita (2004), hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali (%recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:

Keterangan :

CF = Konsentrasiteoritis setelah penambahan baku(µg/ml)

CA = Konsentrasianalit sebelum penambahan baku (µg/ml)

C*A = Konsentrasiteoritis baku yang ditambahkan(µg/ml) %

100 A

* C

CA -CF Recovery) (%

Kembali Perolehan

3.6.1.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi untuk Akurasi

1. Pembuatan Larutan Induk Baku I

Ditimbang secara seksama 10 mg Simvastatin BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan simvastatin BPFI dengan konsentrasi 1000 µg/ml.

2. Pembuatan Larutan Induk Baku II

Dipipet 5 ml dari Larutan Induk Baku I kedalam labu tentukur 50 ml. Diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 µg/ml.

3. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Dipipet 1; 2; 3; 4 dan 5 ml dari Larutan Induk Baku I ke dalam labu tentukur 100 ml. Diencerkan dengan fase gerak hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50, µg/ml.Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µ m kemudian diawaudarakan selama ± 30 menit. Masing-masing larutan diinjeksikan ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µ l diukur pada panjang gelombang 238 nm dengan laju alir 1,5 ml/menit dan suhu 50ºC.

3.6.2 Presisi

Untuk menguji data presisi (RSD), diambil rata-rata % perolehan kembali (9 kali replikasi) kemudian dihitung standar deviasi. Setelah itu, dihitung % RSD

dengan cara standar deviasi dibagi rata-rata % perolehan kembali kemudian di kali 100%.

Menurut Harmita (2004), rumus untuk menghitung simpangan baku relatif adalah :

SD =

(

)

1 -n X -Xi 2

∑

Keterangan: Xi = Kadar sampel

−

X

= Kadar rata-rata sampel n = Jumlah perlakuan

RSD = ×100%

X SD

Keterangan:

−

X

= Kadar rata-rata sampel

SD = Standar Deviasi

RSD = Relative Standard Deviation

3.6.3 Batas deteksi dan batas kuantitasi

Menurut Harmita (2004), batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

SimpanganBaku (

X

SY _{) =}

(

)

2 2 − −

∑

n Yi Y

Batas deteksi (LOD) =

slope X SY x 3

Batas kuantitasi (LOQ) =

slope X SY x 10

3.7 Analisis Data Secara Statistik

Kadar simvastatin yang diperoleh dari hasil pengukuran masing-masing larutan sampel dianalisis secara statistik. Menurut (Sudjana, 2001) deviasi standar dapat dihitung dengan menggunakan rumus:

SD =

(

)

1 -n

X

-Xi 2

∑

Keterangan: Xi = Kadar sampel

−

X

= Kadar rata-rata sampel

n = Jumlah perlakuan

Untuk mencari t hitung digunakan rumus:

t hitung =

n SD

X Xi

/

−

Data diterima jika thitung < tabel.

Untuk menentukan kadar simvastatin di dalam sampel dengan tingkat kepercayaan 99%, α = 0.01, dk = n-1, dapat digunakan rumus:

Kadar simvastatin : µ= X ± t (1-½α) dk SD / √n

Keterangan: µ = Kadar simvastatin

−

X

= Kadar rata-rata sampelµ

SD = Standar Deviasi

dk = Derajat kebebasan (dk = n-1)

α = Tingkat kepercayaan

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Panjang Gelombang Analisis

Hasil penentuan panjang gelombang maksimum dari baku simvastatin diperoleh pada 238 nm dalam pelarut asetonitril : air (80:20) dengan konsentrasi 8,0 µg/ml. Konsentrasi ini diperoleh dari hasil perhitungan E1%1cm dari baku

simvastatin dalam pelarut HCl 0,1N yang mempunyai nilai E1%1cm = 524. Kurva

serapansimvastatin baku dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Kurva serapan maksimum simvastatin BPFI dengan pelarut asetonitril : air (80:20)

Dari kurva serapan tersebut, terlihat bahwa simvastatin memiliki 3 puncak yaitu pada panjang gelombang 246 nm, 238 nm dan 230 nm. Dari ketiga panjang

pengukuran adalah 238 nm karena memeberikan serapan yang paling besar dan selanjutnya digunakanuntuk analisis simvastatin.

4.2 Optimasi Komposisi Fase Gerak

Pada penelitian ini dilakukan optimasi untuk mendapatkan kondisi kromatografi yang optimal pada metode elusi isokratik dengan perbandingan fase

gerak asetonitril : air (40:60 ; 60:40 dan 80:20), volume penyuntikkan 20 µL dengan laju alir 1,5 ml/menit yang diukur pada panjang gelombang 238 nm menggunakan suhu oven 50ºC. Perbandingan fase gerak yang optimal yang dipilih dalam penelitian ini adalah dengan perbandingan asetonitril : air (80:20). Pemilihan fase gerak yang optimal ini didasarkan pada waktu retensi yang singkat, nilai lempeng teoritis (theoretical plate) dan faktor tailing yang

memenuhi persyaratan. Hubungan antara sistem elusi dan komposisi fase gerak terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 1 dan gambar kromatogram dapat dilihat pada Gambar 4, 5 dan 6 dibawah ini.

Tabel 1. Pengaruh komposisi fase gerak terhadap parameter kromatogram

No

Perbandingan fase gerak

Waktu retensi (menit)

Nilai theoritical

plate Resolusi Tailing factor

Asetonitril Air

1 40 60 37,881 779,657 4,782 1,405

2 60 40 5,984 6474,364 3,206 1,037

Gambar 4. Kromatogram Sampel Ethicol secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (40:60) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50oC.

Gambar 5. Kromatogram Sampel Ethicol secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (60:40) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan

Gambar 6. Kromatogram Sampel Ethicol secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50oC.

Kondisi kromatografi yang dipakai dan penelitian ini antara lain kolom tipe C18 Waters X-Bridge (25 cm x 4,6 mm), fase gerak asetonitril : air (80:20)

yang diperoleh dari hasil optimasi, laju alir 1,5 ml/menit, suhu 50oC dan dideteksi pada panjang gelombang 238 nm, sedangkan dalam USP 32 ( 2009), penetapan kadar dilakukan menggunakan kolom tipe C18 (25 cm x 4,6 mm) dengan fase gerak asetonitril :buffer (65:35). Adapun alasan menggunakan fase gerak

asetonitril : air (80:20) adalah untuk menghindari kerusakan kolom akibat pemakaian larutan buffer bersamaan dengan asetonitril.

Penetapan kadar secara KCKT telah dilaporkan oleh Guzik (2010), menggunakan sistem elusi gradien. Pada penelitian ini dilakukan optimasi menggunakan sistem elusi isokratik dengan berbagai perbandingan fase gerak,

dengan tujuan mendapatkan kondisi yang paling optimum sehingga dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar simvastatin yang beredar dipasaran. Optimasi dilakukan dengan variasi perbandingan fase gerak asetonitril : air yaitu untuk sistem elusi isokratik (40 : 60 ; 60 : 40; dan 80 : 20).

4.3 Analisis Kualitatif

Hasil optimasi pada penentuan kondisi kromatografi dengan sistem elusi isokratik yang terbaik untuk simvastatin, diperoleh komposisi fase gerak asetonitril : air (80:20), dengan waktu retensi yang lebih singkat (2,7 menit), suhu 50oC dan laju alir 1,5 ml/menit. Analisis dilakukan dengan menginjeksikan 20 µL larutan sampel dan dianalisis pada panjang gelombang 238 nm. Untuk mengetahui bahwa sampel yang dianalisis mengandung simvastatin maka dilakukan spiking

dengan cara menambahkan simvastatin baku ke dalam sampel dan dianalisis pada kondisi kromatografi yang sama. Hasil kromatogram simvastatin dapat dilihat pada Gambar 7, 8 dan 9 sebagai berikut:

Gambar 7. Kromatogram baku simvastatin sebelum spiking secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50oC.

Gambar 8. Kromatogram sampel bernofarm simvastatin sebelum spiking secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50oC.

Gambar 9. Kromatogram larutan simvastatin hasil spiking secara KCKT menggunakan kolom Waters X-Bridge (250 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak asetonitril:air (80:20) dan laju alir 1,5 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl, panjang gelombang 238 nm dan suhu 50oC.

Hasil analisis menunjukkan bahwa baku, sampel dan sampel spike

memberikan nilai waktu tambat yang sama yaitu pada menit 2,76 dan terjadi peningkatan luas area dan tinggi puncak kromatogram simvastatin yang diamati sebelumnya. Jadi, dapat disimpulkan bahwa kromatogram yang diamati dalam larutan sampel adalah benar merupakan kromatogram simvastatin.

4.4 Analisis Kuantitatif 4.4.1 Kurva kalibrasi

Penentuan kurva kalibrasi simvastatin BPFI ditentukan berdasarkan luas area pada konsentrasi 20, 40, 60, 80, 100 µg/ml, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi, r = 0,9998 dan persamaan regresi Y = 39182,085 X – 45210,9. Nilai r ≥ 0,995 menunjukkan adanyakorelasi linier yang menyatakan adanya hubungan antara X dan Y. Hasil penentuan kalibrasi dapat dilihat pada Lampiran 2.

Gambar 10. Kurva Kalibrasi Baku Simvastatin

4.4.2 Kadar analit pada sampel yang dianalisis

Data hasil penetapan kadar simvastatin dalam tablet dapat dilihat pada tabel 2 dibawah ini, sedangkan contoh perhitungan kadar analit pada sampel yang dianalisis dapat di lihat pada Lampiran 19.

-500000 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000

0 20 40 60 80 100 120

Konsentrasi ( µg/mL)

Y = 39182,085 X - 45210,9 r = 0,9998

Lampiran 27. Spesifikasi Sampel

1. Ethicol

No. Reg : DKL 9906708417B1 No. Bets : 11E040

Pabrik : PT. Ethica

Harga : Rp. 98.000 / kotak (3 blister) Tanggal registrasi : 23 Agustus 2012

Tanggal daluarsa : Juli 2014

Kandungan : Simvastatin 10 mg 2. Selvim

No. Reg : DKL,0409214304A1 No. Bets : 11EAS057

Pabrik : PT. Ifars

Harga : Rp. 57.000 / kotak (3 blister) Tanggal registrasi : 03 Januari 2011

Tanggal daluarsa : Januari 2015 Kandungan : Simvastatin 10 mg 3. Tablet Simvastatin produksi Dexa Medica

No. Reg : GKL9805024217A1 No. Bets : 207SD58

Pabrik : Dexa Medica Harga : Rp. 2.500 / strip Tanggal registrasi : 03 Januari 2012 Tanggal daluarsa : Mei 2015

Kandungan : Simvastatin 10 mg 4. Tablet Simvastatin produksi Bernofarm

No. Reg : GKL 0602339309A1 No. Bets : TSB04142

Pabrik : Bernofarm Harga : Rp. 2.500 / strip Tanggal registrasi : 22 Agustus 2013 Tanggal daluarsa : Januari 2016 Kandungan : Simvastatin 10 mg

Lampiran 28. Gambar Alat yang digunakan

Gambar 21. Instrument KCKT (Shimadzu Prominence Series)

Gambar 23.Heating Magnetic Stirrer VELP

Gambar 25. Pompa vakum (Boeco)

Gambar 27.Micro Balance Mettler Toledo