29 waterbath 120 rpm. Miselium yang dihasilkan dipanen dan dimasukkan kembali
ke media yang berisi cotton seed oil dan kemudian diinkubasi selama 7-10 hari pada suhu kamar. Oospora akan bergerombol di dasar tabung dan siap dipanen.
4. Penghitungan dan pengamatan zoospora dan oospora
Penghitungan zoospora dan oospora yang dihasilkan dengan menggunakan malazzes hemocytometer dan pengamatan dilakukan dengan menggunakan
bantuan mikroskop dengan perbesaran 10x dan 40x. Zat warna yang digunakan Lacto phenol cotton blue LPCB.
HASIL dan PEMBAHASAN
Pemeliharaan isolat Lagenidum giganteum, salah satu tujuannya supaya isolat tersebut tidak mati dan dalam pemeliharaan ini membutuhkan waktu yang
lama karena selama pemeliharaan seringkali ditemukan banyak terjadi kendala. Dalam pemeliharaan ini dari isolat murni dibiakkan ke dalam media biakan agar
seperti yang dilakukan oleh Kerwin dan Wasino 1986. Kuning te lur yang ada dalam media biakan ini digunakan sebagai sumber utama untuk pertumbuhan
kapang L. giganteum yang meliputi lemak, karbohidrat, protein dan elemen organik yang meliputi sulfur, potassium, sodium, fosfor , kalsium, magnesium dan
besi Stadelman dan Cotterill1977 dalam Misman, 1990. Sedangkan sumber karbon untuk pertumbuhan kapang ini selain berasal dari glukosa yang ada pada
kuning telur juga berasal dari glukosa yang ditambahkan pada media diatas. Menurut Bilgrami dan Verma 1981 dalam Misman 1990 bahwa unsur karbon
diperlukan oleh kapang tersebut untuk menyusun komponen miselium kapang.
30 Dari penelitian ini setelah kapang L. giganteum ditumbuhkan pada media
khusus Domnas et al. 1983 yaitu kombinasi antara media PYG pepton, yeast ekstrak dan glukosa dengan pH 6,5 dan Medium Z pH 6,0 dan didiamkan pada
air bebas ion selama 2 hari maka dihasilkan zoospora yang merupakan stadium
infektif , bersifat motil dan merupakan alat reproduksi aseksualnya Gambar 4.
Jumlah zoospora yang dihasilkan sete lah dihitung dengan Malassez
hemocytometer sebesar 15 x 10
7
zoosporaml. Dalam siklus hidupnya Lagenidium mempunyai siklus hidup yang relatif
sederhana, terdiri dua siklus yang terpisah yaitu aseksual sebagai zoospora dan siklus seksual dengan oospora Dwidjoseputro 1978. Dalam lingkungan perairan
kapang L. giganteum mempunyai dua fase yaitu bersifat saprofit ik dan parasitik. Fase parasitik bersifat motil, berbentuk bulat dan mempunyai 2 flagella pada
bagian lateralnya.
Gambar 4. Zoospora 40x
Tahap infektif dari kapang ini adalah tahap spora zoospora. bersifat motil dan memiliki kemampuan untuk mencari sekaligus merusak inangnya dengan cara
menangkap sinyal yang dihasilkan pada bagian epikutikula eksoskeleton bagian
31 luar nyamuk. Zoospora dapat ditemukan menempel pada batang padi, kumbang
air ataupun larva capung. Apabila zoospora belum menemukan inang yang cocok, zoospora akan berenang kembali dan mencari inang yang sesuai Melvin et al.
1987; Kerwin 1990 ; Kerwin 2000. Secara in vitro produksi zoospora akan dapat tercapai apabila ditumbuhkan pada media biakan yang mengandung cukup nutrisi
dan pH yang sesuai. Gugus trehalosa merupakan sumber karbon terbaik selain glukosa,
mannosa, fruktosa, maltosa dan gliserol selain itu kapang ini juga membutuhkan aspartat, glutamat dan glutamin sebagai sumber nitrogen McInnis 1971 dalam
Misman 1990. Kapang akan mempunyai enzim ekstrasel protease apabila ditumbuhkan pada media PYG dan dalam memproduksi enzim ini juga
dibutuhkan suatu perangsang protein. Pada penelitian ini miselium kapang ditumbuhkan dalam media biakan cair yang mengandung PYG dan ditambah
suplemen minyak jagung. Minyak jagung digunakan sebagai sumber sterol yang digunakan sebagai bahan tambahan yang akan digunakan untuk menginduksi
terjadinya proses zoosporogenesis. Menurut Domnas et al. 1977 media biakan yang mengandung PYG perlu ditambahkan unsur protein baik berupa kolesterol
ataupun protein nabati untuk memicu terjadinya zoosporogenesis. Selain itu dengan penambahan protein tersebut akan memicu juga produksi enzim protease
menjadi dua sampai tiga kali lipat dan waktu pertumbuhan akan menjadi dua kali lebih cepat apabila dibandingkan dengan tanpa penambahan suplemen. Enzim
protease membantu proses zoospora dalam melakukan penetrasi ke dalam lapisan kutikula dari nyamuk disamping enzim lipase Domnas et al. 1974. Menurut
Jaronski et al. 1983 bahwa apabila kapang L. giganteum ditumbuhkan pada
32 media yang bebas sterol proses zoosporogenesis akan terhambat dan kemampuan
pembentukkan zoospora akan tertahan apabila kapang ditumbuhkan pada media PYG setelah beberapa bulan Lord dan Robert 1986.
Kisaran pH yang dibutuhkan dalam produksi zoospora secara in vitro adalah 4,5-8,4 Lord dan Robert 1985 sedang menurut Domnas et al. 1982
bahwa produksi zoospora kisaran pH yang digunakan adalah 5,4-7,5 dan pH optimal apabila menggunakan media PYG adalah 6,5-7,5. L. giganteum akan
mampu memproduksi zoospora secara optimal apabila setelah ditumbuhkan ke media PYG, harus ditumbuhkan pada media Z dengan pH 5,5-6,0 Balaraman dan
Hoti 1986 dalam Misman, 1990 . Dalam penelitian ini untuk memperoleh proses zoosporogenesis secara
sempurna, suspensi zoospora dimasukkan kedalam cawan-cawan petri yang berisi air bebas ion steril yang diinkubasikan pada suhu 25
C selama 3 hari dan diperoleh hasil adanya germline pada dasar petri. Menurut Kerwin et al. 1986
bahwa untuk memacu terjadinya zoosporogenesis nutrisi yang terkandung di media biakan, digunakan juga aquades steril, sedangkan Domnas et al. 1977
menggunakan air bebas ion sebagai pemacu zoosporogenesis. Dalam penelitian ini untuk menghasilkan oospora, zoospora yang telah
dihasilkan kemudian dibiakkan kembali kemedia yang mengandung yeast ekstrak 2,8glt, glukosa 2,4 glt, wheat germ 3,2glt, cotton seed oil dan cotton seed flour
serta ditambah beberapa milimolar unsur kalsium dan magnesium. Inkubasi dilakukan selama 7-10 hari. Setelah 7 hari miselium dipanen dan dilarutkan dalam
aquades steril dan diinkubasi kembali selama 7 hari. Pada hari kesepuluh oospora dipanen dan diperoleh hasil 2,1x10
3
oosporaml setelah dihitung dengan
33 menggunakan Malassez hemocytometer. Oospora berbentuk bulat mempunyai
dinding yang jelas dan lapisan halus Gambar 5. Secara normal dalam
pertumbuhannya L. giganteum membutuhkan unsur karbon, nitrogen dan mineral serta vitamin. Untuk dapat aktif memproduksi oospora dalam media cair yang
digunakan untuk pertumbuhan dibutuhkan sterol, kalsium dan asam lemak tak jenuh. Sterol akan merubah pertumbuhan vegetatif menjadi pertumbuhan
reproduktif. Sumber sterol dapat berasal dari minyak sayur, minyak jagung ataupun minyak ga ndum dan ketiga sumber sterol ini yang sangat optimum dalam
memproduksi oospora Kerwin et al. 1986. Oospora dapat dihasilkan dan dapat bertahan lama dengan memberikan asam lemak dalam media pertumbuhannya
khususnya unsur trigliserida. Jumlah oospora yang diproduksi dipengaruhi suhu, pH, nutrisi, salinitas, cahaya ataupun komponen organik. Dalam penelitian ini
oospora yang dihasilkan sedikit, hal ini kemungkinan disebabkan oleh faktor sterol yang digunakan ataupun asam lemaknya kurang optimal sehingga
berpengaruh dalam proses oosporogenesis. Menurut Kerwin et al. 1986 bahwa dalam produksi oospora hasil akan optimum apabila jumlah sterol yang
ditambahkan cukup besar yaitu 60 mglt dan diproduksi menggunakan fermentor. Tipe dan konsentrasi asam lemak yang digunakan juga berpengaruh dalam proses
oosporogenesis. Asam lemak kemungkinan mempengaruhi proses fisiologi yang berkaitan dengan terjadinya oosporogenesis. Asam lemak tergabung dalam
golongan fospolipid yang mungkin berpengaruh dalam aktivitas pengikatan antara membran sel dengan enzim adenil siklase yang diketahui terlibat dalam
merangsang terjadinya proses oosporogenesis. Kandungan fospolipid juga berpengaruh dalam fusi antara anteridia dan oogonia , menghambat terjadinya
34 gametangia sehingga menyebabkan terjadinya kegagalan dalam pembentukkan
oospora. Vegetables oil kaya akan asam oleic , linoleic dan linolenic, ketika
ditambahkan kholesterol, yang mana keduanya cocok sebagai sumber asam lemak untuk produksi oospora yang aktif dalam media cair. Menurut Kerwin e t al.
1986 bahwa asam linolenic yang terkandung dalam ekstrak hemp seed mendekati 60, sehingga apabila minyak ini ditambahkan pada media dasar yang
telah ditambah kolesterol akan sangat berpengaruh dalam memproduksi oospora. Selain itu dalam proses oosporogenesis juga dibutuhkan adanya unsur kalsium
dan magnesium. Menurut Brey 1985 dengan menggunakan media biakan yang sama oospora yang dihasilkan 5,0 x 10
3
dan Kerwin et al. 1983 menggunakan medium padat yang berisi PYG dan ditambah suplemen kolesterol dan lesitin
mampu menghasilkan oospora sejumlah 4,1x10
5
10 cm diameter petri.
Gambar 5. Oospora perbesaran 10x Oospora mampu bertahan hidup dan bersifat dorman spora istirahat serta
stabil, dapat bertahan terhadap kondisi lingkungan yang kurang baik, tahan terhadap kekeringan dan mampu bertahan sampai 7 tahun Kerwin 2000. Pada
35 kondisi lingkungan yang tepat, oospora akan ber kecambah dan menghasilkan
zoospora.
KESIMPULAN
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa : 1. Media biakan yang terdiri dari Media PYG yaitu media yang berisi pepton,
yeast ekstrak dan glukosa yang kemudian dipindahkan kemedia yang mengandung sumplemen vegetable oil serta dipindahkan ke media air bebas
ion mampu menghasilakn zoospora sebanyak 15 x 10
7
zoosporaml. 2. Media cair yang berisi 1,25 gr pepton, 1,25 gr ardamin, 3 gr glukosa, 0,05 gr
lesitin, 0,025 mg kholesterol, 0,075 CaCl
2.2
H
2
O dan 0,15 gr Mg. Cl
2.6
H
2
O dan media yang mengandung 2,8glt yeast ekstrak, 2,4 gr glukosa , 3,2 grlt tepung
gandum, 300 mglt cottonseed oil, 100 ml ekstrak cotton seed flour , 0,15 gr. CaCl
2.2
H
2
O dan 0,15 gr Mg.Cl
2.6
H
2
O menghasilkan oospora sebanyak 2,1x10
3
oosporaml selama 7 hari masa inkubasi.
36
Percobaan 3 Uji Patogenisitas Zoospora dan Oospora Kapang
Lagenidium giganteum terhadap Larva Instar 2 Nyamuk
Ae. aegypti Skala Laboratorium
METODE PENELITIAN
1. Pemeliharaan Nyamuk Ae. aegypti