AKTIVITAS SENYAWA-SENYAWA KITOOLIGOMER TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

54 aktivitas immunoenhancing atau anti kanker terbaik adalah senyawa kitooligo mer dengan unit heksamer.

C. AKTIVITAS SENYAWA-SENYAWA KITOOLIGOMER TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

Sel limfosit darah merupakan jenis sel yang tersuspensi dalam darah, mudah diisolasi dan merupakan jenis sel yang sangat sensitif Kresno 1996, Oleh karena itu pengujian aktivitas komponen bioaktif secara in vitro dapat dilakukan untuk menguji sifat sitotoksik suatu komponen bioaktif terhadap sel limfosit. Hipotesis tentang pengaruh sitotoksik komponen uji terhadap sel limfosit dapat diberlakukan juga untuk sel normal, sehingga apabila komponen bioaktif yang diberikan ternyata tidak membunuh sel limfosit, dapat disimpulkan bahwa komponen tersebut juga tidak bersifat sitotoksik bagi sel normal. Jika hal ini tercapai, maka bahan bioaktif yang memiliki sifat tersebut merupakan bahan yang potensial untuk dikembangkan sebagai obat kemoterapi bagi penyakit kanker, karena selama ini obat kemoterapi biasanya tidak hanya membunuh sel kanker tetapi juga membunuh sel normal Meiyanto et al. 2003. Hidrolisat enzimatik yang mengandung campuran enzim dan senyawa- senyawa kitooligomer Tabel 6 digunakan untuk menguji aktivitas proliferasi terhadap sel limfosit dan sel kanker. Tabel 6 Konsentrasi enzim dari beberapa hidrolisat No. Hidrolisat Konsentrasi Unitmg kitosan 1. FBS 0.0085 2. FBSMn 0.0085 3. AS 0.005 0.005 4. AS 0.0085 0.0085 5. AS 0.10 0.10 6. AS 0.17 0.17 7. EM 0.0085 0.0085 Keterangan : FBS = Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C, konsentrasi 0.0085 Umg kitosan FBSMn = Fltrat bebas sel yang ditambah katalisator MnCl 2 10 mM, konsentrasi 0.0085 unitmg kitosan. AS 0.005 = Enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.005 unitmg kitosan AS 0.0085 = Enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 unitmg kitosan. AS 0.10 = Enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.10 unitmg kitosan AS 0.17 = Enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.17 unitmg kitosan EM 0.0085 = Enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan Beberapa hidrolisat pada tahap awal dilakukan skrining pada beberapa tingkat pengenceran Gambar 18, untuk melihat aktivitas proliferasi terhadap sel limfosit. 55 a. b. c. d. Gambar 18. Hasil pemilihan konsentrasi hidrolisat a F BS 0.0085 3j DD85, b EM 0.0085 6j DD90, c AS 0.0085 3j DD85, dan d AS 0.10 3j DD85 terhadap proliferasi sel limfosit Hasil skrining terhadap hidrolisat dengan berbagai seri pengenceran menunjukkan hidrolisat-hidrolisat dengan konsentrasi kitosan DD 85 pada 85 ì gml larutan atau 17 ìgml kultur ternyata telah menunjukkan adanya respon 20 40 60 80 100 120 140 160 10 17 25 Konsentrasi ugml kultur proliferasi FBS 0.0085 3j DD85 FBS 0.0085 3j DD70 20 40 60 80 100 120 140 160 180 10 17 25 Konsentrasi ugml kultur Proliferasi EM 0.0085 6j DD90 20 40 60 80 100 120 140 160 180 10 17 25 Konsentrasi ugml kultur Proliferasi AS 0.10 3j DD85 50 100 150 200 10 17 25 Konsentrasi ugml kultur Proliferasi AS 0.0085 3j DD85 AS 0.0085 3j DD70 56 aktivitas proliferasi yang cukup baik terhadap sel limfosit dibanding penggunaan hidrolisat berkonsentrasi lebih tinggi atau lebih rendah. Tabel 7 Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat terhadap proliferasi sel limfosit Proliferasi Hidrolisat dan konsentrasi enzim IUmg kitosan Konsentrasi hidrolisat µgml kultur DD substrat DD Hidrolisat 1j Hidrolisat 3j AS 0.005 FBS 0.0085 FBSMn 0.0085 EM 0.0085 AS 0.0085 AS 0.10 AS 0.17 17 17 17 17 17 17 17 85 70 85 70 85 70 85 90 70 85 90 70 85 90 70 85 - - 288.06 48.14 247.56 79.31 123.48 230.79 45.92 130.79 118.43 31.84 181.88 122.33 46.51 155.10 66.70 138.01 123.09 154.54 70.69 - - 184.54 162.47 169.00 132.03 96.04 144.23 118.99 100.25 142.52 Kontrol Con A PWM - 17 17 100.00 184.47 205.27 Glukosamin Kitosan DD70 Kitosan DD 85 Kitosan DD 90 Kitosan DD 100 17 17 17 17 17 113.87 106.31 107.23 98.70 105.82 Enzim kitosanase Bromo deoksi - uridin - 17 78.30 71.31 Enzim murni inkubasi 6 jam berada pada kolom 1 jam, inkubasi 9 jam berada pada kolom 3 jam . Keterangan : FBS 0.0085 = filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C, FBSMn = filtrat bebas sel yang ditambah katalisator MnCl 2 10 mM, AS 0.005 = enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.005 unitmg kitosan DD85 AS 0.0085 = enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 unitmg kitosan DD85 AS 0.10 = enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.10 unitmg kitosan DD 85 As 0.17 = enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.17 unitmg kitosan DD 85 EM 0.0085 = Hasil pemurnian pemurnian dengan unit 0.0085 Umg kitosan DD90. 57 Con A = Mitogen Concanavalin A PWM = Mitogen Pokeweed Bromo deoksi uridin = Senyawa anti kanker komersial Sigma. Kontrol = medium dan suspensi sel. Menelaah hasil pengujian proliferasi sel limfosit pada Tabel 7, terlihat berbagai hidrolisat enzim, substrat kitosan dengan berbagai derajat deasetilasi DD, preparat enzim, senyawa anti kanker 2 - Bromo deoksi uridin BrDu dan mitogen Con A serta PWM memberikan respon proliferasi limfosit yang berbeda dengan kontrol, dimana preparat enzim dan senyawa anti kanker BrDu ternyata tidak memacu proliferasi sel limfosit bahkan bersifat sitotoksik atau membunuh sel limfosit. Fenomena respon sitotoksik ini juga ditemukan pada beberapa hidrolisat dan umumnya respon ini ditemui pada hidrolisat yang menggunakan substrat kitosan DD 70, yaitu sebanyak 5 lima buah hidrolisat yang berasal dari inkubasi dengan substrat kitosan selama 1 satu jam dan 1 satu buah hidrolisat yang berasal dari inkubasi dengan substrat kitosan selama 3 tiga jam, fenomena sitotoksik dari hidrolisat yang menggunakan substrat kitosan DD85 hanya ditemukan sebanyak 2 dua buah hidrolisat. Jumlah perbandingan hidrolisat yang bersifat sitotoksik dibanding hidrolisat yang tidak bersifat sitotoksik terhadap sel limfosit adalah 5 : 9 pada hidrolisat yang dihasilkan selama 1 satu jam, dan 3 : 11 untuk hidrolisat yang dihasilkan selama 3 tiga jam. Hasil perbandingan tersebut mencerminkan bahwa hidrolisat yang diproduksi selama 3 tiga jam nampaknya lebih baik menstimulasi proliferasi sel limfosit daripada hidrolisat yang diproduksi selama 1 satu jam, hal ini kemungkinan disebabkan oleh kandungan komposisi senyawa kitooligomer mono sampai trimer yang lebih banyak daripada kandungan senyawa kitooligomer tetra sampai heksamer pada hidrolisat yang diproduksi selama 3 tiga jam. Sehingga dapat disimpulkan bahwa hidrolisat yang bersifat tidak sitotoksik masih lebih besar jumlahnya dibanding hidrolisat yang bersifat sitotoksik. Pengaruh hidrolisat yang bersifat sitotoksik didominasi oleh hidrolisat yang menggunakan substrat kitosan DD 70, tetapi kitosan DD 70 sendiri beserta kitosan dengan derajat deasetilasi 85, 90 dan 100 tidak bersifat sitotoksik dan tidak menstimulasi proliferasi terhadap sel limfosit. Hal ini berarti bahwa kitooligomer yang dihasilkan dari reaksi yang menggunakan substrat kitosan DD 70 bersifat sitotoksik terhadap sel limfosit, karena hasil ini nampak cukup berbeda dengan pengaruh senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat yang menggunakan derajat deasetilasi substrat DD 85 dan 90 58 yang sebagian besar tidak memberi respon sitotoksik terhadap sel limfosit. Kemungkinan sifat sitotoksik dari senyawa-senyawa kitooligomer yang berasal dari degradasi kitosan DD70 disebabkan oleh konsentrasi senyawa-senyawa kitooligomer bergugus asetil yang lebih tinggi dibandingkan dengan senyawa- senyawa kitooligomer bergugus asetil lebih rendah yang terdapat pada senyawa- senyawa kitooligomer dalam hidrolisat yang menggunakan kitosan dengan derajat deasetilasi lebih tinggi. Hipotesis ini terjawab dengan melihat kemampuan stimulasi proliferasi oleh senyawa -senyawa kitooligomer dalam hidrolisat FBS 0.0085 1j DD85 hasil reaksi preparat enzim dari filtrat bebas sel yang telah dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan substrat kitosan DD 85 selama 1 jam memiliki proliferasi sebesar 288.06, hasil ini merupakan proliferasi sel limfosit yang tertinggi. Hasil ini memberi implikasi bahwa telah terjadi peningkatan jumlah sel sebesar 2.88 kali dari jumlah sel awal 1 x 10 6 selml. Senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat FBSMn 0.0085 1j DD85 dan hidrolisat EM 0.0085 6j DD90 dan EM 0.0085 9j DD90 masing-masing juga menunjukkan kemampuan stimulasi proliferasi yang cukup tinggi dibandingkan hidrolisat lainnya yaitu berturut-turut sebesar 247.56, 230.79 dan 184.54. Tingginya proliferasi limfosit yang dihasilkan merupakan indikasi kemampuan imunitas sel Zakaria et al. 1997. Hipotesis terjadinya stimulasi proliferasi ini dapat terjawab dengan membandingkan respon stimulasi proliferasi terhadap hidrolisat yang mengandung campuran enzim dan senyawa-senyawa kitooligomer dan respon sitotoksik terhadap senyawa kitooligomer murni yang telah difraksinasi Tabel 8. Fenomena berbeda yang ditemukan pada hidrolisat yang tidak difraksinasi menunjukkan kemungkinan enzim kitosanase yang berada dalam hidrolisat masih aktif dan bersifat bifungsional yaitu disamping memiliki kemampuan mendegradasi kitosan menjadi unit-unit senyawa kitooligomer juga memiliki kemampuan transglikosilasi, yaitu aktivitas untuk menggabungkan kembali senyawa -senyawa kitooligomer yang telah dihidrolisis oleh enzim kitosanase sehingga membentuk kembali polimer kitosan yang tidak bersifat sitotoksik terhadap sel limfosit. Fenomena tersebut dimungkinkan karena telah ditemukannya jenis enzim kitosanase bifungsional yang memiliki aktivitas transglikosilasi tersebut. Hasil penelitian tentang enzim kitosanase dengan aktivitas bifungsional saat ini masih sangat terbatas. Sifat bifungsional kitosanase telah dilaporkan antara lain oleh Reyes dan Corona 1997 dan Tanabe et al. 59 2003. Keberadaan enzim kitinase bifungsional juga telah dilaporkan oleh Wang dan chan 1997 dan Xia et al. 2001. Untuk memperjelas profil sel limfosit dari hasil aktivitas stimulasi proliferasi sel limfosit oleh senyawa -senyawa kitooligomer campuran dalam hidrolisat EM 0.0085 6j DD 90 dibandingkan dengan aktivitas sitotoksik dari senyawa-senyawa kitooligomer campuran dalam hidrolisat AS 0.0085 1j DD 70 serta kontrol proliferasi limfosit diperlihatkan pada Gambar 19. a b c Keterangan : a Profil sel tanpa sampel setelah inkubasi 3 hari. b Profil kultur sel limfosit yang mengalami pengaruh sitotoksik dari hidrolisat AS 0.0085 1j DD 70. c Profil kultur sel limfosit yang mengalami stimulasi proliferasi dari hidrolisat EM 0.0085 6j DD 90. Gambar 19 Profil sel limfosit pada pembesaran dengan inverted microscope 200 kali 60 Tabel 8 Aktivitas hasil fraksinasi senyawa-senyawa kitooligomer terhadap proliferasi sel limfosit Sampel hidrolisat Unit molekul Kitooligomer Konsentrasi kitooligomer µgml kultur Proliferasi Kontrol Standar FBS 0.0085 1j DD85 FBS 0.0085 3j DD85 EM 0.0085 6j DD90 EM 0.0085 9j DD90 AS 0.10 3j DD85 - Trimer Tetramer Pentamer Heksamer Trimer Tetramer Pentamer Heksamer Trimer Tetramer Pentamer Heksamer Trimer Tetramer Pentamer Heksamer Trimer Tetramer Pentamer Heksamer Trimer Tetramer Pentamer Heksamer 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 100.00 69.11 70.61 78.87 84.24 98.85 140.50 120.71 140.07 79.17 81.64 72.87 73.87 66.73 70.31 69.62 80.93 69.78 72.97 73.83 74.52 72.48 72.82 72.63 71.83 Keterangan : FBS 0.0085 1j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 1 jam. FBS 0.0085 3j DD85 = Hasil reaksi enzim Filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60 o C dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85 selama 3 jam. EM 0.0085 6j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 6 jam EM 0.0085 9j DD90 = Hasil reaksi enzim murni dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD 90, 9 jam AS 0.0085 1j DD85 = hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.0085 Umg kitosan DD85, 1 jam AS 0.10 3j DD85 = Hasil reaksi enzim hasil pekatan amonium sulfat dengan konsentrasi 0.10 Umg kitosan DD85, 3 jam. Br-dU = 2-Bromo deoksi uridin senyawa anti kanker komersial, Sigma Standar = Senyawa-senyawa kitooligomer murni dari Seikagaku Corp,Jepang. 61 Hasil pengujian proliferasi limfosit dengan menggunakan sampel senyawa- senyawa kitooligomer yang telah difraksinasi menjadi unit trimer - heksamer pada Tabel 8, menunjukkan bahwa senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi umumnya tidak dapat memacu proliferasi lebih baik daripada kontrol, Berarti dapat disimpulkan bahwa senyawa-senyawa kitooligomer murni ternyata bersifat sitotoksik terhadap sel limfosit. Fenomena ini dapat terjadi berdasarkan dugaan bahwa senyawa-senyawa kitooligomer hasil fraksinasi merupakan komponen tunggal yang murni, sehingga tidak lagi mengandung enzim kitosanase bifungsional yang kemungkinan memiliki aktivitas transglikosilasi Reyes dan Corona 1997 dan Tanabe et al. 2003, yaitu mampu merepolimerisasi kembali senyawa-senyawa kitooligomer menjadi polimer kitosan yang tidak bersifat sitotoksik. Kemampuan senyawa -senyawa kitooligomer dalam hidrolisat menstimulasi proliferasi limfosit didukung oleh hasil penelitian Hertriyani 2005 yang menemukan aktivitas proliferasi sel limfosit tertinggi terdapat pada hidrolisat yang memiliki komposisi heksamer paling tinggi. Hasil ini didukung pula oleh laporan Tokoro et al. 1986; Kobayashi et al. 1990; dan Suzuki et al. 1992 yang melaporkan aktivitas immunoenhancing atau anti kanker terbaik adalah senyawa kitooligosakarida dengan unit heksamer. Wu dan Tsai 2004 melaporkan hidrolisat kitin yang mengandung kitooligomer dengan derajat polimerisasi 1-6 mampu menginduksi proliferasi dan sekresi IgM dari sel hibridoma manusia HB4C5 secara in vitro, sedangkan secara in vivo hidrolisat ini mampu meningkatkan sekresi IgG dan IgM. Pada Tabel 9 diperlihatkan pengaruh inkubasi bersama antara senyawa- senyawa kitooligomer hasil reaksi enzimatik dan mitogen pada kultur sel limfosit. Secara umum terlihat pengaruh yang sinergis dari hasil pencampuran senyawa- senyawa kitooligomer dalam hidrolisat, yaitu terjadi peningkatan proliferasi sel limfosit yang lebih tinggi bila dibandingkan pemb erian mitogen Concanavalin A dan Pokeweed masing-masing secara tunggal. Mitogen adalah agen yang mampu menginduksi pembelahan sel baik sel T maupun sel B dalam persentase yang tinggi, aktivasi mitogen adalah tidak spesifik. Mitogen biasa dikenal sebagai aktivator poliklonal karena dapat mengaktivasi banyak klon sel T atau sel B tanpa tergantung pada spesifitas antigennya. 62 Tabel 9 Pengaruh inkubasi bersama hidrolisat kitooligomer dan mitogen terhadap proliferasi sel limfosit Stimulasi proliferasi Hidrolisat Mitogen Con A Mitogen PKW FBS 0.0085 1j DD85 FBSMn 0.0085 1j DD85 AS 0.0085 D85 1j DD85 AS 0.10 1j DD85 AS 0.17 1j DD85 EM 0.0085 1j DD85 Con A PKW 215.90 198.57 207.12 268.43 218.96 116.39 184.48 - 263.90 196.56 308.26 267.14 318.77 - - 205.26 Menurut Herscowitz 1993 mitogen atau antigen tidak spesifik seperti Con A dan PWM mempunyai daya mengaktifkan sejumlah besar limfosit-limfosit tanpa memandang reaktifitas antigenik sel-sel yang bersangkutan. Hal ini terjadi karena adanya gangguan pada membran yang diransang oleh ikatan silang makromolekul permukaan tertentu yang meransang limfosit untuk membelah. Mitogen PWM dapat mengaktifkan sel T dan sel B mencit dan manusia. Mitogen Con A dapat meransang terjadinya transformasi blast subpopulasi sel limfosit T Bellanti, 1993. Transformasi blast atau perubahan menjadi blast adalah sederetan peristiwa dimana sel-sel bertambah besar, nukleus membesar, retikulum endoplasmik menjadi kasar dan tubulus mikro menjadi jelas, kecepatan sintesis DNA bertambah dan terjadi mitosis. Mekanisme umum terjadinya proses proliferasi dapat diduga berdasarkan terikatnya polimer kitosan rantai pendek pada reseptor permukaan sel T dan sel B. Pengikatan antigen pada reseptor permukaan sel T bersama interleukin 1IL- 1 dari APC Antigen Presenting Cell dapat mengaktivasi G-protein yang kemudian memproduksi fosfolipase C. Enzim ini menghidrolisis fosfatidil inositol bifosfat PIP2 menjadi produk reaktif diasil gliserol DAG dan inositol trifosfat IP3. Reaksi tersebut berlangsung dalam membran plasma. IP3 kemudian menstimulasi pelepasan Ca 2+ ke dalam sitoplasma sehingga konsentrasi Ca 2+ meningkat. Peningkatan Ca 2+ ini berperan penting dalam menstimulasi kerja enzim protein kinase C dan 5-lipoxygenase. Protein kinase C menstimulasi produksi interleukin-2 IL-2, IL-2 ini kemudian mengaktivasi sel B maupun sel T untuk berproliferasi Tejasari 2000. Perbandingan hasil penelitian ini dibandingkan dengan hasil penelitian lain, dapat dilihat pada Tabel 10 berikut : 63 Tabel 10 Beberapa hasil penelitian proliferasi sel limfosit No Sampel proliferasi Referensi 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Ekstrak air kayu secang Caesalpinia sappan Linn Teh daun cincau Cyclea Serbuk gel cincau Cyclea Bunga kumis kucing Orthosimphon stamineus benth Bunga knop Gomphrena globosa L. Hidrolisat kitooligomer kitin Hidrolisat kitooligomer FBS 0.0085 1j DD85 150 141 122 240 107 136 288 Puspaningrum 2003 Setiawati 2003 Setiawati 2003 Aquarini 2005 Aquarini 2005 Hertriyani 2005 penelitian ini Berdasarkan hasil-hasil yang telah dilaporkan tersebut, nampak aktivitas proliferasi sel limfosit dari senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat tertentu cukup baik, oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat yang berasal dari hasil reaksi enzimatik yang menggunakan enzim kitosanase dari Bacillus licheniformis MB2 dengan mengunakan substrat kitosan dengan derajat deasetilasi 85 dan 90 ternyata tidak bersifat toksik bagi sel limfosit, bahkan mampu memacu proliferasi sel limfosit. Tingginya proliferasi limfosit yang dihasilkan merupakan indikasi kemampuan imunitas sel Zakaria et al. 1997. Aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer terutama senyawa-senyawa kitooligomer murni yang ditemukan toksik pada sel limfosit dapat diaplikasikan untuk menghambat proliferasi sel kanker, walaupun model ideal untuk menemukan obat kanker potensial adalah senyawa yang tidak membunuh sel normal tetapi dapat membunuh sel kanker. Dengan dasar hasil tersebut, penelitian ini dilanjutkan untuk mengevaluasi kemungkinan senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat dan hasil fraksinasi memiliki aktivitas sebagai bahan anti kanker dengan melakukan pengujian pada beberapa galur sel kanker. 64 Berdasarkan hasil yang telah diperoleh, diajukan beberapa saran berkaitan dengan hasil yang telah diperoleh dari hasil pengujian senyawa-senyawa kitooligomer dari hidrolisat enzimatik dan hasil fraksinasi terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit, yaitu perlu adanya pengujian aktivitas proliferasi sub sel limfosit, misalnya terhadap aktivitas proliferasi sel B, sel T H , sel T C dan sel NK. Diperlukan juga adanya pengujian aktivitas proliferasi pada selsistim imun lain, misanya terhadap makrofag. Selanjutnya diperlukan klarifikasi sifat sitotoksik dari senyawa-senyawa kitooligomer terutama yang telah terfraksinasi dengan menggunakan parameter molekuler seluler, misalnya dengan menganalisis jenis- jenis protein yang terekspresi setelah pemberian senyawa-senyawa kitooligomer pada sel, sehingga diperoleh kesimpulan pengaruh kitooligomer terhadap sel limfosit yang cukup akurat.

D. AKTIVITAS