37
dan antibiotik penisilin-streptomisin 0.2, kemudian dilakukan sterilisasi dingin dengan membran steril berukuran 0,22 ìm. Jika digunakan sebagai media
pertumbuhan, komposisi medium dita mbahkan 10 FBS steril Zakaria 1997. Persiapan sampel dilakukan untuk menguji aktivitas proliferasi sel limfosit
oleh senyawa-senyawa kitooligomer, yaitu terlebih dahulu ditetapkan besarnya konsentrasi hidrolisat senyawa-senyawa kitooligomer yang akan digunakan. Dari
hasil pengujian pendahuluan terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit, diperoleh konsentrasi yang cukup baik pada nilai 17 ìgml kultur, sehingga semua sampel
diuji pada besaran nilai konsentrasi yang sama yaitu 17 ìgml kultur. Sampel- sampel yang digunakan adalah beberapa hidrolisat enzimatik yang berasal dari
reaksi dengan berbagai konsentrasi enzim per miligram kitosan, senyawa- senyawa kitooligomer murni, kitosan DD 70, 85, 90 dan 100
glukosamin, enzim, mitogen Concanavalin A dan Pokeweed, dan senyawa 2- Bromo deoksi uridin.
b. Isolasi sel limfosit
Limfosit manusia diisolasi dari darah perifer dengan sentrifugasi berdasarkan perbedaan densitas larutan ficoll-hypaque sebesar 1.77 ± 0.001
gml. Pertama dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi
sampel darah dalam vacutainer pada 514 x g selama 10 menit dengan menggunakan sentrifus dengan rotor swing. Bagian darah yang lebih berat sel
darah merah berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah di bagian atas. Lapisan buffycoat yang sebagian besar berisi sel limfosit diambil lalu
ditambahkan medium basal. Pada tahap pemisahan selanjutnya suspensi limfosit dalam medium basal dilewatkan pada larutan ficoll-hypaque secara perlahan
sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur. Kemudian tabung disentrifus lagi selama 30 menit pada 1430 x g. Sel limfosit, monosit dan platelet
berada sebagai lapisan di atas permukaan ficoll dan tidak menembus ke bawah. Sedangkan granulosit dan sel darah merah terpisah di dasar tabung sentrifus.
Lapisan atas yang berisi sel limfosit, monosit dan platelet dicuci 2 dua kali dengan media basal dan disentrifugasi pada 228 x g selama 10 menit,
supernatan di buang dan pelet dicuci serta disentrifus sekali lagi pada 228 x g selama 10 menit, sehingga limfosit dalam presipitat terpisah dari platelet,
monosit, dan ficoll dalam supernatan. Pelet sel yang diperoleh langsung ditambah medium pertumbuhan dan dihomogenkan, kemudian dilakukan
38
perhitungan jumlah sel dengan menggunakan pewarna trifan biru dengan perbandingan 1: 1 10 ìl suspensi sel ditambah dengan 10 ì l pewarna trifan
biru. Setelah didiamkan selama 1 menit jumlah sel yang hidup dan mati dihitung dengan menggunakan hemasitometer pada perbesaran mikroskop sebesar 100
kali. Perhitungan jumlah sel dengan menggunakan pewarna trifan biru dimaksudkan untuk menentukan viabilitas sel yang akan diuji, yaitu sebelum
dilakukan pengujian sel harus dalam kondisi hidup sebesar 95. Berdasarkan hasil perhitungan jumlah sel menggunakan hemasitometer, maka dapat
ditetapkan jumlah sel dalam setiap ml suspensi sebagai berikut : N = V4 x F x 10
4
selml N = Jumlah selml
V4 = rata-rata jumlah sel terhitung dari empat bidang pandang F = Faktor pengenceran = 2
10
4
= 1 ml perkapasitas hemasitometer, yaitu 10
4
ml. Palmer et al. 1978, Tejasari 2000.
Suspensi sel 1 x 10
6
selml dimasukkan ke dalam sumur-sumur microplate sebanyak 80 ìl tiap sumur. Suspensi sel dalam media mengandung serum janin
sapi Fetal Bovine Serum FBS 10. Hidrolisat yang mengandung senyawa- senyawa kitooligomer dengan konsentrasi 85 µgml ditambahkan dalam sumur
sebanyak 20 ìl, mitogen concanavalin A Con A dan pokeweed dengan konsentrasi masing-masing sebesar 50 µgml digunakan sebagai sampel
pembanding masing-masing ditambahkan ke dalam sumur sebanyak 20 ìl, kecuali jika perlakuan menggunakan campuran senyawa-senyawa kitooligomer
dalam hidrolisat hasil reaksi enzimatik dan mitogen maka jumlah mitogen dan sampel kitooligomer yang digunakan sebanyak 10 ìl. Jumlah total volume dalam
tiap sumur sebanyak 100 ìl. Kultur diinkubasi pada inkubator dengan kondisi 5 CO
2
, 37
o
C, dan RH 90 selama 3 tiga hari. Setelah masa inkubasi berakhir dilakukan pengujian dengan metode MTT,
yaitu ditambahkan 10 ìl larutan pereaksi garam tetrazolium MTT 5 mgml pada tiap sumur microplate, selanjutnya diinkubasi selama 4 empat jam. Sebelum
pembacaan dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm, dilakukan pelarutan senyawa formazam yang terbentuk dengan larutan
isopropanol pada tiap sumur sebanyak 100 ìl.
39
5. Pemeliharaan kultur sel kanker Ananta 2000
