35
panjang gelombang 595 nm. Blanko berisi pereaksi Bradford dan akuades sebagai pengganti larutan sampel.
Elektroforesis dan Pewarnaan Perak . Elektroforesis dan pewarnaan
perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim yang paling tinggi dari fraksi hasil kolom kromatografi hidrofobik. Elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamida-sodium dodesil sulfat SDS-PAGE, dengan konsentrasi gel pemisah poliakrilamida 10 dan gel penahan poliakrilamida 4 Bollag dan
Edelstein 1991. Sampel fraksi-fraksi hasil pemurnian enzim sejumlah 20 ìl terlebih dahulu diinkubasi selama 5 menit pada temperatur 55
o
C dalam bufer sampel 5 ìl bufer sampel tanpa â-mercaptoetanol. Selanjutnya dilakukan
Loading sampel pada tiap sumur gel, kemudian proses elektroforesis dilakukan
dengan kondisi tegangan listrik 100 Volt dan arus sebesar 100 mili Amper. Setelah selesai, gel difiksasi dengan larutan fiksasi metanol 25 dan asam
asetat 12 selama semalam. Perendaman gel selanjutnya diganti dengan larutan etanol 50, 30, 30 masing-masing selama 20 menit. Selanjutnya
perendaman diganti dengan larutan enhancer 0.1 gram Na
2
S
2
O
3
dalam 500 ml akuabides selama satu menit. Setelah gel dicuci dengan akuabides sebanyak
tiga kali masing-masing selama 20 detik, gel diwarnai dengan larutan perak nitrat HgNO
3
dalam formaldehid yang dilakukan selama 30 menit. Terakhir larutan perendam gel diganti dengan larutan Na
2
CO
3
dalam formaldehid selama 10 menit. Kemudian dilakukan penghentian reaksi dengan larutan fiksasi Bollag dan
Edelstein 1991.
2. Produksi Senyawa-senyawa Kitooligomer
Senyawa-senyawa kitooligomer diproduksi dari kitosan terlarut 1 DD70, DD85, dan DD90 yang dipersiapkan sebagai berikut : Kitosan sebanyak 0.5
gram ditambahkan asam asetat 1M sebanyak 4.5 ml, lalu disuspensikan dalam 20 ml air bebas ion dan diaduk sampai homogen selama tiga jam. Larutan
ditambahkan sodium asetat 0.05 M sampai mencapai pH 6.0 kemudian ditepatkan volumenya menjadi 50 ml dengan bufer asetat 0.05 M pH 6.0 Yoon
et al . 2000.
Berbagai preparat enzim yang digunakan yaitu : preparat enzim kasar, berasal dari hasil pemanasan supernatan bebas sel pada suhu 60
o
C selama 20 menit, konsentrasi enzim yang digunakan adalah 0.0085 Unit per miligram
36
kitosan, preparat amonium sulfat hasil pemekatan enzim dengan amonium sulfat 80 jenuh menggunakan konsentrasi enzim sebesar 0.005, 0.0085, 0.10, dan
0.17 Unit per miligram kitosan. Preparat enzim murni dari hasil pemurnian dengan kolom kromatografi hidrofobik menggunakan konsentrasi enzim sebesar
0.0085 Unit per miligram kitosan. Reaksi hidrolisis enzim dengan substrat dilakukan pada suhu 70
C suhu optimum enzim selama 1, 2, dan 3 jam. Reaksi enzimatik dihentikan dengan
cara pendidihan selama 10 menit. Setelah itu hidrolisat kitooligomer disentrifus dan dipekatkan sampai setengah volume awal. Sampel senyawa-senyawa
kitooligomer yang akan diuji aktivitas proliferasi sel limfosit dan anti proliferasi sel kanker kemudian diencerkan dan disterilisasi dingin dengan filter membran
ukuran 0.2 mikron.
3. Identifikasi dan Fraksinasi Komponen Kitooligomer
Produk hasil hidrolisis berbagai preparat enzim dan substrat diidentifikasi pada tahap awal berdasarkan konsentrasi glukosamin yang dihasilkan. Tahap
selanjutnya dilakukan identifikasi dengan alat HPLC High Performance Liquid Cromatography
. Sampel senyawa-senyawa kitooligomer dalam hidrolisat sebelum dianalisis dengan HPLC terlebih dahulu disentrifus untuk
menghilangkan pengotor-pengotor yang dapat mempengaruhi pembacaan alat HPLC.
Identifikasi dan fraksinasi dengan HPLC menggunakan kolom karbohidrat Waters sebagai fase diam, dan pelarut asetonitril 60 dalam air sebagai fase
gerak. Deteksi dilakukan berdasarkan waktu retensi, dengan detektor UV model 440 dual lamdha. menggunakan volume injeksi sampel sebanyak 20 ìl dan laju
alir 1mlmenit. Sebagai standar digunakan senyawa kitooligomer campuran dari Seikagaku Japan, dengan unit monomer sampai heksamer pada konsentrasi 25
mgml. Jeon dan Kim 2000; Chasanah 2004.
4. Pengujian Aktivitas Senyawa-senyawa Kitooligomer terhadap Proliferasi
