32
3. Kajian aktivitas senyawa-senyawa kitooligomer terhadap proliferasi sel limfosit dan sel kanker, melalui pengujian aktivitas proliferasi limfosit dan proliferasi
sel-sel kanker secara in vitro. 4. Kajian potensi anti kanker melalui :
a. Analisis terjadinya kematian sel akibat apoptosis dengan metode - pewarnaan sel dengan agen fluorosens Hoechts staining.
b. Analisis kerusakan membran sel melalui pengukuran konsentrasi protein absorbansi 280 nm dan asam nukleat absorbansi 260 nm pada
supernatan kultur sel, kemudian konfirmasi dengan pengamatan Scanning Electron Mycroscop
SEM. c. Analisis aktivitas penghambatan enzim serin protease inhibitor serin
protease
1. Produksi Enzim Kitosanase
Enzim kitosanase dihasilkan melalui beberapa tahap yang meliputi : pembuatan tepung kitosan dari tepung kitin, pembuatan kitosan koloidal sebagai
substrat, persiapan media, persiapan isolat B. Licheniformis yang digunakan sebagai starter, dan produksi enzim pada kondisi optimumnya. Enzim fraksi
supernatan bebas sel diproses lebih lanjut dengan pemanasan pada 60
o
C selama 20 menit. Enzim fraksi amonium sulfat diperoleh melalui proses
pengendapan menggunakan garam amonium sulfat dengan konsentrasi 80 jenuh, sedangkan enzim murni dihasilkan melalui kolom kromatografi interaksi
hidrofobik.
Pembuatan Tepung Kitosan dari Tepung Kitin. Pe mbuatan tepung
kitosan dilakukan secara kimia Kolodziejska et al. 2000. Tepung kitin sebanyak
10 g dicampurkan dengan 100 ml larutan NaOH 50, lalu dipanaskan 100
o
C selama 60 menit. Setelah itu dilakukan pencucian dengan air sampai mencapai
pH netral. Pengeringan dilakukan menggunakan oven suhu 60
o
C selama 48 jam sehingga diperoleh tepung kitosan.
Pembuatan Kitosan Koloidal. Tepung kitosan dicampurkan dengan 20
kali volume HCl pekat, dilarutkan dan disimpan selama semalam pada suhu dingin. Air dingin sebanyak 10 kali berat kitosan ditambahkan dan difiltrasi
dengan glass wool, setelah itu ditambahkan NaOH 12 N dan ditepatkan pHnya sampai 7.0. Kemudian disentrifus 7000 rpm selama 20 menit, ditambahkan air
33
dingin, disentrifus kembali pada 7000 rpm selama 20 menit. Koloidal kitosan yang diperoleh disimpan pada suhu dingin Arnold dan Solomon 1986.
Produksi En zim Fraksi Supernatan Bebas Sel Fbs.
Isolat bakteri Bacillus licheniformis
MB2 ditumbuhkan pada media cair yang mengandung kitosan terlarut 1, MgSO
4
0.5, KH
2
PO
4
0.3, K
2
HPO
4
0.7, yeast extract 0.25, dan casitone 0.25. Biakan diinkubasi pada inkubator berpenggoyang
120 rpm suhu 55
o
C selama tujuh hari Chasanah 2004. Biakan disentrifugasi dingin pada kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan mengandung
enzim ekstrak kasar dipisahkan dari endapannya untuk digunakan dalam tahap selanjutya.
Produksi Enzim Fraksi Amonium Sulfat AS 80. Enzim fraksi amonium
sulfat 80 jenuh diperoleh dengan menambahkan garam amonium sulfat teknis sebanyak 561 g ke dalam 1 liter enzim supernatan bebas sel sedikit demi sedikit
sambil dilakukan pengadukan secara perlahan. Homogenat disimpan selama semalam dalam ruang berpendingin dengan suhu 4
o
C, kemudian disentrifus dingin 4
o
C 10.000 rpm selama 15 menit. Bagian supernatan dibuang sedangkan endapan diambil dan dilarutkan ke dalam bufer fosfat 0.5 M pH 6.0
sebanyak 10 ml yang dinyatakan sebagai pekatan enzim fraksi amonium sulfat.
Produksi Fraksi Enzim Murni EM. Enzim murni dihasilkan dengan teknik
kromatografi kolom hidrofobik Chasanah 2004. Proses pemurnian di awali dengan pemberian amonium sulfat 30 pada supernatan bebas sel. 75 ml
supernatan tersebut dimasukkan pada kolom hidrofobik ber matriks butil separose yang sebelumnya telah di-ekuilibrasi dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.0 yang
juga mengandung amonium sulfat 30 bufer A. Elusi dilakukan menggunakan bufer fosfat 0.05 M pH 6.0, yang ditempatkan dalam bejana berhubungan, yang
masing-masing tabungnya berisi bufer fosfat dengan konsentrasi amonium sulfat 15 dan 0, dengan laju alir 2 mljam. Volume fraksi yang ditampung masing-
masing sebanyak 3 ml. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar protein pada panjang gelombang 280 nm dan aktivitas kitosanase pada panjang gelombang
420 nm pada tiap fraksi. Penggunaan SDS-PAGE dengan pewarnaan perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim. Fraksi dengan posisi pita yang
sama kemudian dikumpulkan dan digunakan untuk produksi senyawa-senyawa kitooligomer.
34
Pengukuran Aktivitas Kitosanase.
Aktivitas kitosanase di uji dengan metode Yoon et al. 2000 yang dimodifikasi. Kitosan koloidal 1, bufer fosfat
0.05 M pH 6.0, dan larutan enzim kitosanase filtrat bebas sel masing-masing sebanyak 100 ìl diinkubasi pada suhu 55
o
C selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan inkubasi pada suhu -10
o
C selama 15 menit. Jumlah gula reduksi ditentukan dengan metode Schales dengan glukosamin sebagai standar Uchida
dan Ohtakara 1998. Sebanyak 200 ìl campuran reaksi ditambahkan 1 ml pereaksi Schales dan 800 ìl akuades, Setelah ditutup dengan aluminium foil,
tabung yang berisi campuran reaksi dipanaskan pada 100
o
C selama 15 menit, disentrifus pada 3000 x g selama 10 menit. Absorbansi supernatan dibaca
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Blanko berisi pereaksi Schales dan akuades sebagai pengganti larutan sampel.
Satu unit aktivitas kitosanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 ìmol glukosamin per menit. Penentuan konsentrasi glukosamin
sampel berdasarkan kurva standar glukosamin. Nilai konsentrasi glukosamin ìgml dalam sampel dimasukkan ke dalam rumus untuk menghitung aktivitas
enzim seperti di berikut ini : Aktivitas A B 1 konsentrasi 1
Enzim = x x x glukosamin x Uml B C waktu inkubasi ìgml BM glukosamin
Keterangan : A = Volume awal enzim, substrat dan bufer yang direaksikan ìl
B = Volume reaksi yang diambil untuk diukur jumlah glukosamin ìl C = Volume enzim yang digunakan dalam pengujian aktivitas enzim ìl
Waktu inkubasi = 30 menit Berat molekul BM Glukosamin = 215.6 gmol
Konsentrasi glukosamin yang dimasukkan ke dalam rumus adalah konsentrasi glukosamin sampel dikurangi konsentrasi glukosamin kontrol dan blanko.
Pengukuran Kadar Protein. Kadar Protein dalam sampel enzim dianalisis
berdasarkan metode Bradford 1976 menggunakan Bovine serum albumin BSA pada kisaran konsentrasi 0 – 100 ìgml sebagai standar protein.
Campuran reaksi mengandung 0.1 ml sampel, 1 ml akuades dan 1 ml pereaksi Bradford. Setelah campuran reaksi dihomogenkan, absorbansi dibaca pada
35
panjang gelombang 595 nm. Blanko berisi pereaksi Bradford dan akuades sebagai pengganti larutan sampel.
Elektroforesis dan Pewarnaan Perak . Elektroforesis dan pewarnaan
perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim yang paling tinggi dari fraksi hasil kolom kromatografi hidrofobik. Elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamida-sodium dodesil sulfat SDS-PAGE, dengan konsentrasi gel pemisah poliakrilamida 10 dan gel penahan poliakrilamida 4 Bollag dan
Edelstein 1991. Sampel fraksi-fraksi hasil pemurnian enzim sejumlah 20 ìl terlebih dahulu diinkubasi selama 5 menit pada temperatur 55
o
C dalam bufer sampel 5 ìl bufer sampel tanpa â-mercaptoetanol. Selanjutnya dilakukan
Loading sampel pada tiap sumur gel, kemudian proses elektroforesis dilakukan
dengan kondisi tegangan listrik 100 Volt dan arus sebesar 100 mili Amper. Setelah selesai, gel difiksasi dengan larutan fiksasi metanol 25 dan asam
asetat 12 selama semalam. Perendaman gel selanjutnya diganti dengan larutan etanol 50, 30, 30 masing-masing selama 20 menit. Selanjutnya
perendaman diganti dengan larutan enhancer 0.1 gram Na
2
S
2
O
3
dalam 500 ml akuabides selama satu menit. Setelah gel dicuci dengan akuabides sebanyak
tiga kali masing-masing selama 20 detik, gel diwarnai dengan larutan perak nitrat HgNO
3
dalam formaldehid yang dilakukan selama 30 menit. Terakhir larutan perendam gel diganti dengan larutan Na
2
CO
3
dalam formaldehid selama 10 menit. Kemudian dilakukan penghentian reaksi dengan larutan fiksasi Bollag dan
Edelstein 1991.
2. Produksi Senyawa-senyawa Kitooligomer
