dapat disimpan untuk selanjutnya dilakukan perlakuan mikroinjeksi. Pemijahan dengan sistem semi buatan ini dilakukan guna mendapatkan telur fase satu sel
pada saat yang sama dalam jumlah relatif banyak. Telur yang sudah dibuahi kemudian disusun diatas cekungan gel agarose
2 dengan menggunakan pipet. Sekitar 8 butir telur dapat diletakkan pada cekungan gel agarose tersebut Gambar 3. Telur tersebut disusun dengan posisi
blastodisk terletak pada bagian cekungan gel yang lebih lebar, sehingga nantinya blastodisk berhadapan langsung dengan arah datangnya jarum mikroinjeksi.
Gambar 3. Telur ikan nila O. niloticus yang diletakkan pada cekungan gel agarose
3.2.2 Persiapan Mikroinjeksi dan Loading DNA
Persiapan alat mikroinjeksi Lampiran 3 dilakukan dengan cara micromanipulator ditempelkan pada magnetic stand yang telah melekat pada
sebuah plat logam. Syringe diisi dengan 3-4 ml minyak mineral dan secara langsung dihubungkan dengan two way stopper. Two way stopper ini
dihubungkan dengan 3 feet 1-mm teflon tubing. Teflon tubing ini dihubungkan dengan needle holder. Untuk menghubungkan teflon tubing dengan needle holder
dibutuhkan usaha yang ekstra. Rangkaian yang kuat dan rapat dari sistem mikroinjektor ini diperlukan karena akan terjadi tekanan ketika syringe
mendorong dan menarik cairan. Needle holder menempel pada micromanipulator Narishige MMN-1 yang membantu untuk menggerakkan injector Narishige
IM-9A ketika dilakukan mikroinjeksi Ath-thar, 2007. Untuk mempermudah
pengamatan serta mengetahui bahwa jarum telah menembus blastodisk telur, digunakan mikroskop Zeiss Stemi DV4. Rangkaian satu set alat mikroinjeksi
ditampilkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Seperangkat peralatan mikroinjeksi
Konstruksi DNA Lampiran 4 yang digunakan berbentuk plasmid yang tersusun dari promoter, gen GFP dan poly A. Pada konstruksi promoter keratin-
GFP diligasikan dengan vektor pEGFP-NI, sedangkan pada konstruksi heatshock- GFP diligasikan dengan vektor pGEM-T easy. Persiapan kontruksi berupa
perbanyakan dan isolasi plasmid disajikan pada Lampiran 5. Proses loading DNA Lampiran 6 merupakan salah satu bagian yang
tersulit, sehingga diperlukan kehati-hatian dan ketrampilan secara khusus. Mikrotip dipasangkan pada mikropipet guna mengambil sebanyak 5 µ l larutan
DNA dengan konsentrasi 50 ngµ l DNA yang dilarutkan dalam KCl. Selanjutnya dengan menggunakan mikrotip, larutan DNA tersebut dimasukkan ke dalam
jarum mikroinjeksi. Capillary glass ditempelkan pada needle holder kemudian dimasukkan minyak mineral hingga penuh. Dengan bantuan capillary glass,
minyak mineral dimasukkan ke dalam jarum mikroinjeksi hingga penuh, dengan
memberi sedikit rongga antara larutan DNA dengan minyak mineral. Langkah terakhir adalah capillary glass dilepas dari needle holder dan diganti dengan
jarum mikroinjeksi yang telah berisi larutan DNA dengan minyak mineral.
3.2.3 Pelaksanaan Mikroinjeksi
