TINJAUAN PUSTAKA Probiotik The Effect of Application Probiotic Lactobacillus brevis and prebiotics Oligosaccharides for immune response and resistance Thai Catfish seeds (Pangasionodon hypophthalmus) Infected by Aeromonas hydrophila.

4 Hongpattarakere, 2012, yang juga memiliki kemampuan memproteksi ikan rainbow trout Oncorhynchus mykiss yang diinfeksi Lactococcus garvieae terutama di saluran pencernaan ikan tersebut Sánchezet al., 2011. Probiotik Pediococcus acidilactici dan L.casei sudah diberikan melalui pakan dengan kepadatan 10 6 – 10 7 CFU gram -1 pada larva kakap Lamari et al., 2012. Penelitian terakhir menunjukkan bahwa L. plantarum, L.acidophilus, dan Saccharomyces cerevisiae yang ditambahkan ke dalam pakan dan bertindak sebagai imunostimulan mampu meningkatkan pertumbuhan, efisiensi pakan, biokimia darah, kelangsungan hidup dan respon imun non-specifik dari olive flounder yang diinfeksi Uronema marinum Harikrishnan et al., 2011. Penggunaan probiotik melalui Artemia Mahdhi et al., 2012 dan melalui mikroenkapsulasi menggunakan alginate, polisakarida dan protein Cook et al., 2012 telah diujikan dengan hasil yang positif. Prebiotik Prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dicerna oleh inang, dapat difermentasi oleh mikrobiota saluran pencernaan serta mampu secara selektif menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan. Menurut Gropper et al., 2009, prebiotik berperan sebagai substrat untuk meningkatkan pertumbuhan bakteri menguntungkan atau yang bermanfaat bagi kesehatan inang sehingga menghambat perkembangan bakteri patogen. Prebiotik umumnya merupakan golongan polisakarida dan oligosakarida. Bahan ini dapat mendorong pertumbuhan bakteri asam laktat dalam usus. Inulin, fructooligosaccharide FOS, galactooligosaccharide GOS, lactulosa dan polydextosa adalah bahan-bahan prebiotik Patel dan Goyal, 2012. Mekanisme penghambatan patogen oleh prebiotik terbagi menjadi dua, yaitu secara langsung dan tidak langsung Rastall, 2005. Penghambatan patogen secara langsung adalah karena prebiotik dapat memblok sisi reseptor pelekatan patogen pada mukosa usus, sehingga patogen tidak dapat melekat pada mukosa usus. Penghambatan secara tidak langsung adalah karena prebiotik dapat meningkatkan pertumbuhan probiotik seperti Lactobacillus. Asam laktat dan asam organik lain yang diproduksi oleh bakteri tersebut diketahui memiliki sifat penghambatan terhadap bakteri patogen Analisis secara in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa prebiotik tidak dicerna oleh enzim pencernaan, tetapi difermentasi oleh bakteri anaerob dalam usus besar. Prebiotik yang telah difermentasi dalam usus besar menghasilkan asam lemak rantai pendek SCFA, menstimulasi pertumbuhan berbagai bakteri termasuk Lactobacillus dan dapat menghasilkan gas. Fortifikasi menggunakan Lactobacillus probiotik dan prebiotik dapat memperbaiki efek perlindungan usus besar terhadap berbagai mikroorganisme patogen dalam usus Wang, 2009. Oligosakarida Oligosakarida merupakan gula dengan 3 hingga 20 unit sakarida. Oligosakarida merupakan rantai pendek polisakarida. Karakteristik senyawa oligosakarida adalah : a terdiri dari susunan monosakarida antara lain glukosa, xylose dan fruktosa, b memiliki ikatan glikosida, c memiliki berat molekul yang rendah dibawah polisakarida, dan d tidak dapat dihidrolisa dan diserap usus halus Cobas et al., 2011. 5 FOS secara kimiawi adalah senyawa β-D-fruktans rantai pendek atau sedang, terikat dengan ikatan β-2-1 glikosidik, tidak dapat diuraikan oleh enzim pencernaan mamalia. Salah satu biota yang dapat mencerna FOS adalah Lactobacillus karena memiliki α–galaktosidase sehingga mampu memutus ikatan α –galaktosa. FOS diketahui dapat meningkatkan pertumbuhan probiotik Enterococcus faecium , L. plantarum, dan L. casei strain shirota. FOS memiliki nilai DP derajat polimerisasi lebih rendah daripada inulin, yaitu berkisar antara 2-8 Franck dan De Leenher, 2005. GOS diproduksi dengan memperpanjang rantai dimer laktosa menggunakan enzym β-galactosidase. Molekul GOS merupakan hasil sintesis yang memanfaatkan aktivitas enzim β-galaktosidase dari laktosa reaksi transgalaktosilasi. β–galaktosidase adalah kelompok enzim hidrolitik dan telah banyak digunakan oleh berbagai industri produk olahan untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa Delgado et al., 2011. Bahan ini mampu mempengaruhi pola pertumbuhan probiotik Lactobacillus, Streptococcus dan Bifidobacterium Cobas et al., 2011, serta merupakan prebiotik alternatif yang sangat baik bagi pertumbuhan strain Lactobacillus di usus Hernandez et al., 2012 . Sinbiotik Sinbiotik merupakan penggabungan antara prebiotik dan probiotik. Keuntungan dari sinbiotik ini adalah pertumbuhan dari probiotik menjadi lebih baik karena terlebih dahulu telah mendapat pakan dari prebiotik. Hasil penelitian Merrifield et al., 2010 menunjukkan bahwa suplemen sinbiotik kombinasi probiotik dari golongan bakteri asam laktat dan prebiotik oligosakarida, berpengaruh positif pada pertumbuhan dan aktivitas bakteri pencernaan ikan salmon Penggunaan FOS 0,25 dan 0,5 serta Bacillus subtilis 1,82x10 7 CFUml pada ikan sea cucumber Apostichopus japonicus yang diinfeksi oleh bakteri Vibrio splendidus, menunjukkan adanya peningkatan pertumbuhan harian, total coelomocytes counts TCC, phagocytosis, serta resistensi terhadap Vibrio splendidus Qin et al., 2010. Gabungan antara Bacillus subtilis kepadatan 10 7 selgram dan inulin 1 pada ikan gilthead sea bream Sparus aurata L memberikan tingkat oedema serta inflamasi usus yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol, sehingga proses kearah homeostatis akan lebih cepat Rebeca et al ., 2013. Proses pencampuran sinbiotik kedalam pakan memerlukan kondisi stabil terutama suhu dan pH Charalampopoulos dan Rastall, 2012. Salah satu yang dilakukan dalam pencampuran ini adalah dengan enkapsulasi probiotik dengan kombinasi prebiotik –calcium-alginate melalui freeze-drying Shamekhi et al., 2012. Proses mikroenkapsulasi bakteri probiotik menggunakan matriks polimer, akan meningkatkan kemampuan bertahan probiotik tersebut terhadap reaksi-reaksi dalam saluran gastrointestinal, sehingga kemungkinan probiotik mencapai usus dalam kondisi hidup akan lebih tinggi Michael et al., 2012. Bakteri Aeromonas hydrophila Bakteri dinyatakan sebagai A.hydrophila apabila memenuhi kriteria sebagai berikut: test pewarnaan gram menunjukkan hasil reaksi gram negatif, 6 bentuk batang pendek, uji motilitas menunjukkan reaksi motil, uji oksidasi menunjukkan reaksi positif oksidatif, uji oksidatif fermentatif hasilnya positif 0F dan pada uji RS hasilnya positif SNI 7303:2009 . Rey et al., 2009 menyatakan bahwa hasil uji karakteristik biokimia bakteri A. hydrophila adalah : oxidase +, catalase +, urea –, citrate –, diffusable pigment –, motility +, ornithine decarboxylase –, fermentasi mannitol +, hidrolisis esculin + dan produksi gas dari glukosa +. Angka 2004 menyatakan bahwa A.hydrophila menghasilkan eksotoksin dan endotoksin yang berbeda untuk setiap galurnya. Endotoksin dari bakteri ini dapat menyebabkan hemoragic, fever serta kematian. Serangan bakteri ini menimbulkan terjadinya peningkatan frekuensi pernafasan, kehilangan keseimbangan dan pendarahan di bagian abdominal. Beberapa gejala dari serangan A.hydrophila berupa ulcera , exophthalmia, serta abdominal distension Gopalakannan dan Arul, 2006 . Martha et al., 2011 menyatakan bahwa A.hydrophila merupakan bakteri penyebab penyakit motile aeromonad septicaemia MAS pada ikan gilthead seabream Sparus aurata. Penyuntikan ikan ini dengan menggunakan bakteri A.hydrophila dengan kepadatan 10 7 selml dan 10 8 selml menimbulkan penurunan aktivitas imun selular yang terdiri dari phagocytosis, respiratory burst activity and peroxidase leucocyte content. Beberapa gen dari organ ginjal, hati, usus, yang terdiri dari gen TLR, NCCRP-1, HEP, TCR, IgM, MHC- IIα, IL-1β, C3, CSF-1R, juga mengalami perubahan akibat infeksi A,hydrophila. Chao et al., 2013 menyatakan bahwa lendir berfungsi sebagai pertahanan tubuh paling awal terhadap serangan bakteri. Penyuntikan dengan menggunakan bakteri A.hydrophila pada ikan blue catfish ictalurus punctatus menyebabkan bereaksinya 1155 jenis gen yang terdapat pada lendir. Hasil pemeriksaan menunjukkan, bahwa gen-gen tersebut berkaitan dengan berbagai sistem tubuh ikan uji seperti regulasi, respon terhadap anioksidan, apoptosis, serta mekanisma imun. Ikan Patin Siam Pangasionodon hypophthalmus Ikan patin siam atau Pangasius hypophthalmus merupakan sinonim dari Pangasionodon hypophthalmus SNI 7551:2009 memiliki sistematika sebagai berikut: Filum : Chordata Kelas : Pisces Ordo : Ostariophysi Subordo : Siluroidea Famili : Pangasidae Genus : Pangasionodon Spesies : Pangasionodon hypophthalmus. Ikan patin siam memiliki kelebihan dibanding ikan lain, yakni pertumbuhan cepat, bersifat omnivora dan memerlukan tepung ikan serta minyak ikan dalam jumlah sedikit dalam pakannya Little et al., 2012. Kelebihan lain ikan ini adalah walaupun sudah lebih dari 20 generasi dari domestikasi pertamanya ternyata secara genetik antara ikan yang dibudidaya dengan yang 7 masih asli di alam tidak berbeda Na-Nakorn dan Moeikum, 2009 sehingga pertumbuhan dari ikan ini tetap stabil dari waktu ke waktu. Ikan patin siam merupakan ikan yang telah memasyarakat. Beberapa kriteria Standar Nasional Indonesia SNI untuk ikan ini diantaranya untuk kriteria pakan memiliki kandungan protein minimal 25, tidak mengandung antibiotika dan bahan lain yang berbahaya. Adapun kriteria kualitas air untuk ikan patin siam, tercantum dalam Tabel 1. Tabel 1 Kualitas air optimum ikan patin siam Pangasius hypophthalmus Parameter Satuan Kisaran Optimum Suhu o C 25 – 30 pH 6,5 – 8,5 Oksigen terlarut mgl 4 Ammoniak NH 3 mgl 0,01 Kecerahan Cm 25 – 80 Sumber. SNI 01-6483.5-2002 Respon Imun Tort dan Mackenzie 2003 menyatakan bahwa sistem imun terbagi menjadi dua, yaitu spesifik dan non-spesifik. Mekanisme sistem imun non- spesifik merupakan mekanisme awal dari sistem imun, tidak dibutuhkan adanya paparan patogen sebelumnya, serta mampu memberikan respon secara cepat. Bergljót 2006 menyatakan bahwa imun non spesifik terdiri dari mekanisma fisik yaitu lendir dan sisik, humoral serta selular. Komponen-komponen humoral diantaranya adalah bahan penghambat pertumbuhan patogen, berbagai enzim penghancur dinding sel, komplemen, opsonin, lektin, dan sitokin. Iwama 1996 menyatakan bahwa sistem imun spesifik terdiri dari humoral seperti sel B yang berhubungan dengan pembentukan antibodi, serta mekanisme selular yang diantaranya adalah sel T T helper, T cytotoksik. Kollner et al., 2001 menyatakan bahwa sistem imun pada ikan dibentuk oleh jaringan limfoid, dimana jaringan ini menyatu dengan mieloid sehingga disebut jaringan limfomieloid. Organ –organ limfomieloid terdiri dari ginjal depan, thymus serta limpa. Ginjal depan berfungsi sebagai organ endokrin yang mengatur keseimbangan dan juga merupakan organ utama untuk interaksi hormon-hormon; untuk sistem imun berperan dalam produksi kelompok sel darah putih atau leukosit. Leukosit terdiri dari granulosit neutrofil, eosinofil, basofil dan agranulosit limfosit, monosit, trombosit. Monosit dan neutrofil berfungsi sebagai bagian dari aktivitas fagositik, yaitu berperan sebagai makrofag, sedangkan limfosit lebih berperan ke arah pembentukan antibodi Iwama, 1996. Hasil penelitian Yuexin et al., 2013 menunjukkan bahwa terjadi peningkatan nilai aktivitas fagositik pada juvenil sea cucumber Apostichopus japonicas dengan perlakuan penambahan yeast Hanseniaspora opuntiae C21, dan diuji tantang dengan menggunakan Vibrio splendidus . Holen et al., 2011 menyatakan bahwa leukosit yang diisolasi dari ginjal bagian depan ikan atlantik salmon Salmo salar yang diberi pakan dengan 8 sumber lemak berbeda, menunjukkan adanya perubahan pada nilai IL- 1β, TNF- α, serta Cox2 . Lv-yun et al., 2013 menyatakan bahwa IL- 1β dan TNF-α turut berperan dalam mekanisma inflamasi. Organ limfomieloid lainnya adalah thymus yang berfungsi antara lain membentuk limfosit T, CD4+, sel T, serta CD8+. Selain itu thymus mengkoordinir tanggapan ketahanan dan penting untuk menahan bakteri intraseluler. CD8+ dapat membunuh sel terinfeksi virus dan pada saat bergabung dengan sel B akan mempertahankan kemampuannya dalam menghasilkan antibodi Kollner et al., 2001. Hasil penelitian Hideaki et al., 2011 menunjukkan bahwa CD4+ dan CD8+ pada ikan ginbuna crucian carp Carassius auratus langsdorfii hanya ditemukan di bagian organ thymus. Limpa merupakan o rgan limfomieloid selain ginjal dan thymus. Organ ini berperan dalam pembentukan eritrosit serta mampu menangkap berbagai material antigen Kollner et al., 2001. Hasil penelitian Antenor et al., 2012 menunjukkan bahwa eritrosit memiliki korelasi positif dengan hemoglobin serta hematokrit pada ikan fat snook Centropomus parallelus. Iwama 1996 menyatakan bahwa suplai sel darah yang diantaranya adalah eritrosit akan meningkat ke lokasi tempat terjadi mekanisma inflamasi. Lv-yun et al., 2013 menyatakan hal yang sama, bahwa sel-sel darah akan bergerak cepat ke arah lokasi tempat terjadinya inflamasi Gambar 1. . Gambar 1. Proses inflamasi Lv-yun et al., 2013 9

3. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Oktober sampai dengan Desember 2012 di Laboratorium Kesehatan Ikan, Institut Pertanian Bogor; Sekolah Tinggi Perikanan Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor; dan Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Tawar Sukabumi. Metode Penelitian Kegiatan Penelitian meliputi persiapan bakteri probiotik dan A.hydrophila, analisis prebiotik oligosakarida, uji in vitro, dan uji in vivo. Alur kegiatan penelitian yang dilaksanakan ditampilkan pada Gambar 2. Gambar 2. Bagan alur kegiatan penelitian Karakterisasi bakteri Karakterisasi bakteri Lactobacillus sp. dan A.hydrophila yang dilakukan menggunakan media API 50 CH dan API 20 E yang terdiri dari 49 dan 27 uji biokimia. Hasil uji karakterisasi bakteri menunjukkan spesies bakteri yang digunakan untuk probiotik adalah L.brevis Lampiran 1 dan untuk uji tantang adalah A.hydrophila Lampiran 2. Analisis Prebiotik Analisis kandungan oligosakarida dalam sampel prebiotik dilakukan dengan Metoda HPLC AOAC, 1999. Kolom yang digunakan adalah bondclone 10 µm NH 2 , dengan detektor refractive index berlaju alir 1-1.2 mlmenit. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril dan air dengan perbandingan asetonitril : air = 80 : 20. Volume sampel yang diinjeksikan adalah 20 µl. Standar gula yang digunakan adalah fruktooligosakarida FOS,dan galaktooligosakarida GOS. Setiap puncak yang terbentuk menunjukkan satu jenis komponen gula. Waktu retensi dari setiap komponen gula dibandingkan dengan waktu retensi dari 10 standar gula.Waktu retensi yang hampir sama menunjukkan jenis komponen yang diperkirakan sama. Konsentrasi komponen gula dihitung berdasarkan persamaan sebagai berikut: Keterangan: CP = Konsentrasi sampel Cs = Konsentrasi standar Ap = Luas areal sampel As = Luas areal standar Fp = Faktor pengenceran V = volume larutan akhir Ws = Berat sampel gram dalam berat kering Dari hasil perhitungan diketahui bahwa nilai prebiotik FOS dan GOS yang diperoleh sebesar 3.448 g100 g dan 1.08 g100 g Lampiran 3. Uji in vitro Penentuan LD50 bakteri A.hydrophila Benih ikan patin siam Pangasionodon hypophthalmus dengan panjang rata –rata 9,1±0,19 cm dipelihara dalam dua belas akuarium. Padat tebar ikan adalah 10 ekor per akuarium. Penginfeksian A.hydrophila dilakukan dengan cara disuntik secara intra muskular sebanyak 0,1 mlekor ikan, dengan kepadatan bakteri 10 6 , 10 7 , 10 8 dan 10 9 CFUml. Pengamatan mortalitas ikan uji dilakukan selama tujuh hari. Penghitungan LD50 menggunakan metode Reed dan Muench 1938. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai LD50 sebesar 10 7 CFUml Lampiran 4. Aktivitas antagonistik Aktivitas antagonistik L. brevis diuji terhadap A.hydrophila dengan metode Bauer-Kirby 1966. Isolat A.hydrophila dan L.brevis diencerkan hingga masing-masing memiliki tingkat kekeruhan sekitar 10 7 CFUml. Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. A. hydrophila disebar pada media TSA sebanyak 100 µl. Kertas cakram Whatman antibiotic asay paper berdiameter 5 mm diletakkan di bagian permukaan media TSA kemudian ditetesi suspensi L. brevis sebanyak 10 µl dan sebagai kontrol dalam perlakuan ini digunakan larutan fisiologis. Selanjutnya media berinokulan ini diinkubasi pada suhu 29 o C selama 24 jam. Pengukuran zona bening yang terbentuk dilakukan menggunakan jangka sorong pada 4 posisi diamater lingkaran dari setiap kertas cakram. Hasil yang diperoleh kemudian dirata-ratakan. Aktivitas antagonistik bakteri termasuk dalam kriteria sedang Bucio et al., 2004 dengan rata-rata diameter zona hambat yang terbentuk sebesar 5.87 ± 0.43 mm Lampiran 5 dan 6