METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
10
standar gula.Waktu retensi yang hampir sama menunjukkan jenis komponen yang diperkirakan sama. Konsentrasi komponen gula dihitung berdasarkan persamaan
sebagai berikut:
Keterangan: CP
= Konsentrasi sampel Cs
= Konsentrasi standar Ap
= Luas areal sampel As
= Luas areal standar Fp
= Faktor pengenceran V
= volume larutan akhir Ws
= Berat sampel gram dalam berat kering Dari hasil perhitungan diketahui bahwa nilai prebiotik FOS dan GOS yang
diperoleh sebesar 3.448 g100 g dan 1.08 g100 g Lampiran 3.
Uji in vitro
Penentuan LD50 bakteri A.hydrophila
Benih ikan patin siam Pangasionodon hypophthalmus dengan panjang rata
–rata 9,1±0,19 cm dipelihara dalam dua belas akuarium. Padat tebar ikan adalah 10 ekor per akuarium. Penginfeksian A.hydrophila dilakukan dengan cara
disuntik secara intra muskular sebanyak 0,1 mlekor ikan, dengan kepadatan bakteri 10
6
, 10
7
, 10
8
dan 10
9
CFUml. Pengamatan mortalitas ikan uji dilakukan selama tujuh hari. Penghitungan LD50 menggunakan metode Reed dan Muench
1938. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai LD50 sebesar 10
7
CFUml Lampiran 4.
Aktivitas antagonistik
Aktivitas antagonistik L. brevis diuji terhadap A.hydrophila dengan metode Bauer-Kirby 1966. Isolat A.hydrophila dan L.brevis diencerkan hingga
masing-masing memiliki tingkat kekeruhan sekitar 10
7
CFUml. Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600
nm. A. hydrophila disebar pada media TSA sebanyak 100 µl. Kertas cakram Whatman antibiotic asay paper berdiameter 5 mm diletakkan di bagian
permukaan media TSA kemudian ditetesi suspensi L. brevis sebanyak 10 µl dan sebagai kontrol dalam perlakuan ini digunakan larutan fisiologis. Selanjutnya
media berinokulan ini diinkubasi pada suhu 29
o
C selama 24 jam. Pengukuran zona bening yang terbentuk dilakukan menggunakan jangka sorong pada 4 posisi
diamater lingkaran dari setiap kertas cakram. Hasil yang diperoleh kemudian dirata-ratakan. Aktivitas antagonistik bakteri termasuk dalam kriteria sedang
Bucio et al., 2004 dengan rata-rata diameter zona hambat yang terbentuk sebesar 5.87 ± 0.43 mm Lampiran 5 dan 6
11
Uji in vivo
Penyiapan pakan
Pakan yang digunakan dalam penelitian adalah pakan komersil dengan kandungan protein 28. Bakteri probiotik dengan konsentrasi 10
7
CFUml sebanyak 1 Putra, 2010, dan prebiotik sebanyak 2 Mathious et al., 2006
dicampurkan pada pakan, serta menggunakan perekat berupa putih telur sebanyak 2. Pakan selanjutnya dikering-anginkan selama satu jam untuk mengurangi
kelembaban.
Kondisi ikan uji
Ikan uji yang digunakan adalah benih ikan patin siam berukuran panjang rata-rata 9,1±0,19 cm, berasal dari unit hatchery Sekolah Tinggi Perikanan
,Jurusan Penyuluhan Perikanan Bogor. Ikan uji dipelihara dalam akuarium berukuran 90 x 40 x 40 cm
3
dengan kepadatan 10 ekor per akuarium. Sebelum diberi perlakuan, ikan diadaptasikan terlebih dahulu selama 14 hari.
Perlakuan probiotik, prebiotik, sinbiotik serta uji tantang
Ikan uji diberi pakan secara at satiation dengan frekuensi tiga kali per hari yaitu pada pukul 7.00, 12.00 dan 17.00. Pemberian probiotik, prebiotik, sinbiotik
dilakukan 1 kali per hari pada siang hari selama 30 hari pemeliharaan. Penelitian terdiri dari lima perlakuan dengan masing-masing terdiri dari
tiga ulangan sebagai berikut Gambar 3: Perlakuan K-
: Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan prebiotik namun tidak diinfeksi A.hydrophila kontrol -
Perlakuan K+ : Pemberian pakan tanpa penambahan probiotik dan prebiotik serta diinfeksi A.hydrophila kontrol +
Perlakuan Pro : Pemberian pakan dengan penambahan probiotik sebesar 1
Putra, 2010 dan diinfeksi A.hydrophila Perlakuan Pre
: Pemberian pakan dengan penambahan prebiotik sebesar 2 Mahious et al., 2006 dan diinfeksi A.hydrophila
Perlakuan Sin : Pemberian pakan dengan penambahan sinbiotik probiotik
sebesar 1 dan prebiotik sebesar 2 dan diinfeksi A.hydrophila
Gambar 3. Skema pelaksanaan dan waktu penelitian
12
Parameter uji
Parameter uji yang diamati selama penelitian adalah jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri pada usus, total eritrosit, hemoglobin, hematokrit, total
leukosit, diferensial leukosit, kelangsungan hidup, pertumbuhan, FCR benih ikan patin siam serta kualitas air.
Jumlah Lactobacillus sp. dan total bakteri di usus
Pengukuran jumlah bakteri Lactobacillus sp. dan total bakteri dalam usus ikan uji dilakukan pada hari ke-30, ke-32, serta ke-40. Usus diambil dan dihomogenkan
dalam larutan NaCl 0.85. Selanjutnya dilakukan pengenceran berseri dengan menggunakan larutan NaCl 0,85. Perhitungan bakteri menggunakan metoda
total plate Li et al., 2009 dengan media spesifik Lactobacillus yaitu MRS agar
Man Rogosa Sharpe Agar serta media untuk total bakteri yaitu TSA Trypticase
soy agar
. Parameter darah
Pengukuran parameter darah dilakukan pada saat awal, hari ke-30, hari ke- 31, hari ke-34, hari ke-36, dan hari ke-38. Adapun parameter darah yang diamati
adalah sebagai berikut:
Total eritrosit Blaxhall dan Daisley, 1973
Darah dihisap dengan pipet pengukur sel darah merah yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 1 setelah itu ditambahkan l
arutan Hayem’s sampai skala 101. Pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan
mengayunkan tangan membentuk angka delapan selama 3 –5 menit sehingga darah
tercampur dengan merata. Selanjutnya dua tetes pertama dari larutan darah dalam pipet dibuang kemudian larutan darah yang ada tersisa dalam pipet diteteskan
pada haemocytometer tipe Neubauer untuk selanjutnya ditutup dengan gelas penutup. Penghitungan jumlah sel darah merah dilakukan menggunakan
mikroskop binokuler dengan pembesaran 400x. Jumlah eritrosit dihitung menurut persamaan berikut:
Hemoglobin Wedemeyer dan Yasutake, 1977
Darah dihisap dengan pipet sahli sampai mencapai 20 mm
3
atau 0.2 ml lalu ujung pipet dibersihkan dengan tissue. Darah dalam pipet dipindahkan ke dalam
tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10 merah, kemudian diaduk dan dibiarkan selama 3 sampai 5 menit. Selanjutnya akuades ditambahkan
sampai warna darah dan HCl dalam tabung seperti warna larutan standar yang ada pada Hb
–meter. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat permukaan cairan dan dicocokan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala jalur gr
kuning yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah.
Hematokrit Anderson dan Siwicki, 1993
Salah satu ujung tabung mikrohematokrit dicelupkan ke dalam tabung yang berisi darah sehingga darah merambat secara kapiler. Ketika rambatan
mencapai ¾ bagian tabung maka ujung tabung ditutup dengan cara menancapkan
13
ujung tabung ke dalam crytoceal kira –kira sedalam 1 mm. Tabung hematokrit
tersebut selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit, lalu dilakukan pengukuran panjang bagian darah yang mengendap a dan panjang
total volume darah yang terdapat di dalam tabung b. Adapun kadar hematokrit dihitung dengan persamaan berikut:
Total leukosit Blaxhall dan Daisley, 1973
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk berwana putih sampai skala 0.
5. Selanjutnya ditambahkan larutan Turk’s sampai skala 11 kemudian pipet diayunkan membentuk angka 8 selama 3
–5 menit sehingga darah tercampur secara merata. Dua tetes pertama larutan darah dibuang dari dalam
pipet, kemudian darah yang masih ada dalam pipet diteteskan ke dalam haemocytometer dan selanjutnya ditutup dengan gelas penutup. Penghitungan sel
leukosit dilakukan dengan menggunakan mikrokop pada pembesaran 400x. Jumlah leukosit dihitung dengan persamaan berikut:
Diferensial leukosit Blaxhall dan Daisley, 1973
Darah diteteskan pada gelas objek bagian kanan atas, selanjutnya gelas objek yang lain diletakkan diatas tetesan darah sampai membentuk sudut sekitar
30
o
kemudian ditarik sampai darah menyebar sepanjang tepi gelas objek pertama. Ulasan dikering-udarakan kemudian direndam dalam larutan Giemsa 1:20
selama 15-20 menit. Hasil perendaman selanjutnya dibilas dengan akuades, ditutup dengan gelas penutup dan diamati menggunakan mikroskop.
Penghitungan dilakukan terhadap jenis-jenis leukosit dan dihitung persentasenya.
Aktivitas fagositik Anderson dan Siwicki, 1993
Darah sebanyak 50µ dimasukkan ke dalam tabung eppendorf, ditambahkan 50µ suspensi bakteri Staphylococcus aureus dalam PBS 10
7
. Campuran tersebut dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20
menit. Selanjutnya dari campuran tersebut diambil sebanyak 5 µl untuk dibuat preparat ulas. Preparat ini difiksasi dengan methanol selama 5 menit lalu
dikeringkan, kemudian direndam dalam larutan Giemsa selama 15 menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Pengamatan dilakukan dengan
menggunakan mikroskop. Aktivitas fagositik didasarkan pada persentase dari 100 sel fagosit yang menunjukkan aktifitas fagositik.
Kelangsungan hidup SR
Penghitungan kelangsungan hidup ikan uji dilakukan pada akhir pemberian pakan perlakuan hari ke-30, serta pada akhir uji tantang hari ke-40. Perhitungan
ini dilakukan dengan menggunakan rumus berdasarkan Effendie 1979.
14
Keterangan : SR
= Derajat kelangsungan hidup Nt
= Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan ekor No
= Jumlah ikan pada awal pemeliharaan ekor
Laju pertumbuhan bobot harian
Sampling pertumbuhan ikan uji dilakukan setiap dua minggu. Perhitungan pertumbuhan harian dilakukan menggunakan rumus berdasarkan Huismann 1987.
Keterangan : α
= laju pertumbuhan bobot harian Wt
= bobot rata – rata akhir grekor
Wo = bobot rata
– rata awal grekor T
= waktu hari
Pertumbuhan panjang
Sampling pertumbuhan ikan uji dilakukan setiap dua minggu. Perhitungan pertumbuhan panjang dilakukan menggunakan rumus berdasarkan
Effendie 1979: P = Lt
– Lo Keterangan:
P = pertumbuhan panjang cm
Lt = panjang rata-rata ikan di akhir pemeliharaan cm
Lo = panjang rata-rata ikan di awal pemeliharaan cm
FCR
Pengukuran FCR dilakukan setelah selesai pemberian pakan perlakuan pada hari ke-30. Perhitungan yang digunakan berdasarkan NRC 1993.
FCR = ΣF∆B+BD ; BD=0 Keterangan :
ΣF = jumlah pakan gram
∆B = Perubahan biomassa ikan gram
BD = biomassa ikan mati gram
Kualitas air
Pengukuran kualitas air dilakukan sebanyak tiga kali yaitu pada awal pemeliharaan hari ke-0, setelah perlakuan probiotik, prebiotik, sinbiotik hari ke-
30 dan setelah uji tantang hari ke-40. Parameter yang diamati terdiri dari kandungan oksigen terlarut DO, suhu, NH
3,
serta pH.
15
Analisis data
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor. Data dianalisis dengan sidik ragam ANOVA pada selang kepercayaan
95. Apabila terdapat perbedaan maka analisis data dilanjutkan dengan uji Duncan menggunakan program Xl-stat.