mengidentifikasi berbagai komponen dalam campuran. Prinsip pemisahan komponen campuran dalam kolom yaitu berdasarkan perbedaan kesetimbangan
retensi dan gerakan masing-masing komponen pada pemukaan fase diam dan fase gerak. Zat-zat yang terabsorpsi kuat dalam fase diam akan lama bertahan dalam
kolom, sedangkan yang teradsorpsi lemah akan keluar dengan cepat dari kolom. Waktu dari mulai contoh diinjeksikan kedalam HPLC sampai dengan suatu
puncak analat analyte peak muncul di detektor pada akhir kolom disebut waktu retensi retention time. Masing-masing analat dalam suatu contoh akan
mempunyai perbedaan waktu retensi. Waktu retensi mencerminkan keberadaan suatu komponen kimia, dan merupakan penciri kualitatif suatu senyawa. Luas area
dibawah kurva mencerminkan konsentrasi secara kuantitatif. HPLC digunakan terutama untuk golongan senyawa tak atsiri, misalnya
terpenoid tinggi, segala jenis fenol, alkaloid, lipid, dan gula. HPLC berhasil baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV dan spektrum sinar
tampak Harborne 1996. HPLC digunakan untuk mengkuantisasi senyawa aktif yang diperoleh dari berbagai perlakuan. Secara kualitatif dan kuantitatif suatu
senyawa aktif dapat diketahui antara lain melalui metoda HPLC dengan mengetahui pola kromatogram dan memperbandingkan luas area terhadap suatu
standar senyawa yang diketahui pada waktu retensi tertentu. HPLC dapat digunakan untuk analisis kulitatif dan kuantitatif atau bahkan dapat dimanfaatkan
sebagai sarana untuk pemurnian melalui pemisahan secara preparatif. Analisis kuantitatif dengan HPLC dilakukan terhadap hasil ekstraksi suatu
contoh. Makin murni ekstrak maka hasil HPLC makin kuantitatif. Tetapi pemurnian suatu ekstrak membutuhkan biaya yang mahal. Pengukuran
konsentrasi dengan HPLC memerlukan analisis referensi terhadap ekstrak murni sebagai pembanding.
2.4. Kalibrasi Peubah Ganda
Chemometrics adalah dapat dipandang sebagai gabungan antara matematika
dan statistika dengan kimia. Kalibrasi peubah ganda merupakan bagian dari Chemometrics
yang bertujuan untuk menemukan hubungan antara sekumpulan ukuran yang relatif mudah atau murah memperolehnya, dengan sekelompok
ukuran lain yang relatif sulit labour in tensive atau mahal memperolehnya. Naes et al
. 2002 menyebutkan bahwa tujuan kalibrasi peubah ganda adalah menemukan model yang dapat digunakan untuk memprediksi ukuran-ukuran yang
mahal dengan tepat dan akurat dari ukuran-ukuran yang murah. Secara umum kalibrasi peubah ganda menggunakan formula matematika untuk menduga
informasi pada Y, yaitu ukuran yang mahal, yang tidak diketahui berdasarkan informasi pada X , yaitu ukuran yang murah, yang tersedia Martens dan Naes
1989. Formula matematika yang disebut model pada prinsipnya dibagi menjadi dua komponen, yaitu komponen yang terstruktur yang merepresentasikan variasi
sistematis dan komponen sisaan yang merepresentasikan perbedaan antara data dengan komponen terstruktur. Pemodelan kalibrasi peubah ganda yang baik akan
memperhatikan terhadap kedua komponen tersebut. Secara umum dengan membuat asumsi-asumsi terhadap komponen terstruktur seperti linear dan
komponen sisaan seperti mempunyai sebaran normal akan membuat model lebih baik dan lebih berguna Ma rten dan Naes 1989. Karena mengandung komponen
sisaan, maka parameter-parameter yang ada dalam model diduga secara statistika berdasarkan contoh-contoh data yang representatif dan asumsi sebaran tertentu
dari sisaan. Menurut Naes et al. 2002 pembuatan model untuk memprediksi Y dengan
kalibrasi peubah ganda, yaitu dengan mempertimbangkan beberapa atau semua pengamatan pada spektrum, akan memberikan hasil lebih baik dibanding dengan
pemodelan kalibrasi peubah tunggal yang hanya mempertimbangkan satu puncak pada masing-masing spektrum. Dengan mengkombinasi informasi dari beberapa
atau bahkan semua peubah spektrum, permasalahan yang muncul pada pendugaan model kalibrasi ganda adalah kasus multikolinearitas di antara peubah absorban
dan banyaknya contoh n yang lebih kecil dari banyaknya peubah bebas p Marten dan Naes 1985; Naes et al. 2000, sehingga metode baku seperti model
regresi sering memberikan solusi yang tidak stabil. Oleh karena itu diperlukan suatu metode yang dapat mengatasi masalah tersebut, sehingga diperoleh solusi
yang lebih stabil. Banyak cara untuk mengatasi masalah multikolinearitas dan banyaknya
contoh lebih kecil dari banyaknya peubah bebas, tetapi dalam literatur
chemometric ada dua pendekatan yang sangat populer yaitu menggunakan regresi
ganda terbakukan, dengan kehati-hatian dalam memilih peubah bebas, dan pendekatan dengan reduksi dimensi data Naes et al. 2002. Beberapa metode
untuk pendugaan model kalibrasi peubah ganda yang ada dalam beberapa literatur antara lain regresi komponen utama, regresi kuadrat terkecil parsial PLS, regresi
fourier, Jaringan Syaraf Tiruan JST, transformasi wavelet Naes et al. 2002; Marten dan Naes 1989; Osborne et al. 1993, dan metode bayes. Menurut Naes et
al . 2002 dengan mengambil beberapa koefisien wavelet sebagai reduksi dimensi
akan menghasilkan rekontruksi ulang spektrum IR yang cukup mendekati spektrum IR asli. Keterkaitan metode-metode ini dalam kalibrasi peubah ganda
dapat dilihat seperti pada Gambar 3. Selain kasus multikolinearitas dan n p, masalah lain yang muncul dalam
pemodelan kalibrasi peubah ganda adalah kesalahan dari pencaran spektrum Scatter problem, yaitu spektrum yang diamati bisa berbeda dari yang
sesungguhnya. Hal ini akan berpengaruh terhadap benar tidaknya pengukuran X dalam pemodelan, dan disebut kesalahan pengukuran peubah-peubah Error of
variables . Menurut Naes et al. 2002 salah satu metode untuk mengatasi
masalah ini adalah Multiplicative Scatter Correction MSC. Dengan MSC keragaman antara spektrum dapat diperkecil.
Y T
Y T
Y Y
T T
Y
T
Gambar 3 Metode -metode kalibrasi peubah ganda dan keterkaitannya.
2.5. Regresi Kuadrat Terkecil
