HPLC High Performance Liquid Chromatography

Tabel 2 Daerah identifikasi spektra IR kurkuminoid No Jenis vibrasi Bilangan Gelombang cm -1 intensitas 1 Ikatan hidrogen OH 3600-3300 m-s 2 C-H Alkana 3000-2850 s 3 Aromatik -C=C- rentangan 1660-1450 s 4 R-O-Ar 1300-1000 m 5 C=O keton 1820-1660 v 6 Sidik jari 900-700 s Keterangan: s kuat; m medium; vs sangat kuat Jika untuk analisis lanjutan perlu dilakukan pengambilan beberapa data transmitan hasil pengukuran dengan FTIR, maka daerah identifikasi IR suatu senyawa sangat perlu diperhatikan, pemotongan yang tidak memperhatikan daerah identifikasi bisa mengarah ke pemodelan yang hasilnya kurang baik. Sebagai misal McNulty dan Ganapati 1998 menduga konsentrasi glukosa dalam larutan encer, dimana spektrum masing-masing contoh dihasilkan dari FTIR dengan kisaran bilangan gelombang 10000 cm -1 sd 4000 cm -1 pada relolusi 4 cm -1 sehingga diperoleh 1500 titik absorban. Karena dalam analisis lanjut hanya dibutuhkan 256 titik, maka penentuan 256 titik dilakukan dengan me mperhatikan daerah identifikasi dari glukosa, yaitu pada kisaran bilangan gelombang 4550 cm -1 sd 4150 cm -1 dengan resolusi 4 cm -1 . Cara yang sama dilakukan oleh Brown et al. 2001 yang memprediksi kandungan lemak, gula, flour dan air dalam suatu contoh adonan kue. Pada awalnya spektrum absorban diukur pada kisaran panjang gelombang 1100 nm sd 2498 nm dengan resolusi 2 nm, sehingga diperoleh 700 titik absorban. Dari 700 titik hanya dibutuhkan 256 titik, maka langkah yang diambil oleh Brown et al. 2001 adalah membuang titik-titik absorban pada pengamatan 140 titik panjang gelombang pertama, dan 49 titik panjang gelombang terakhir dengan alasan pada kisaran tersebut sedikit mengandung informasi. Kemudian dari pengamatan absorban pada panjang gelombang 1380 nm sd 2400 nm, resolusi ditingkatkan menjadi 4 nm. Sehingga diperoleh 256 titik absorban.

2.3. HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPLC merupakan teknik kromatografi cair yang menggunakan tekanan tinggi. HPLC merupakan suatu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi berbagai komponen dalam campuran. Prinsip pemisahan komponen campuran dalam kolom yaitu berdasarkan perbedaan kesetimbangan retensi dan gerakan masing-masing komponen pada pemukaan fase diam dan fase gerak. Zat-zat yang terabsorpsi kuat dalam fase diam akan lama bertahan dalam kolom, sedangkan yang teradsorpsi lemah akan keluar dengan cepat dari kolom. Waktu dari mulai contoh diinjeksikan kedalam HPLC sampai dengan suatu puncak analat analyte peak muncul di detektor pada akhir kolom disebut waktu retensi retention time. Masing-masing analat dalam suatu contoh akan mempunyai perbedaan waktu retensi. Waktu retensi mencerminkan keberadaan suatu komponen kimia, dan merupakan penciri kualitatif suatu senyawa. Luas area dibawah kurva mencerminkan konsentrasi secara kuantitatif. HPLC digunakan terutama untuk golongan senyawa tak atsiri, misalnya terpenoid tinggi, segala jenis fenol, alkaloid, lipid, dan gula. HPLC berhasil baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV dan spektrum sinar tampak Harborne 1996. HPLC digunakan untuk mengkuantisasi senyawa aktif yang diperoleh dari berbagai perlakuan. Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain melalui metoda HPLC dengan mengetahui pola kromatogram dan memperbandingkan luas area terhadap suatu standar senyawa yang diketahui pada waktu retensi tertentu. HPLC dapat digunakan untuk analisis kulitatif dan kuantitatif atau bahkan dapat dimanfaatkan sebagai sarana untuk pemurnian melalui pemisahan secara preparatif. Analisis kuantitatif dengan HPLC dilakukan terhadap hasil ekstraksi suatu contoh. Makin murni ekstrak maka hasil HPLC makin kuantitatif. Tetapi pemurnian suatu ekstrak membutuhkan biaya yang mahal. Pengukuran konsentrasi dengan HPLC memerlukan analisis referensi terhadap ekstrak murni sebagai pembanding.

2.4. Kalibrasi Peubah Ganda