Aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF

KEONG IPONG-IPONG (Fasciolaria salmo)

AZWIN APRIANDI

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

RINGKASAN

AZWIN APRIANDI. C34070081. Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif Keong Ipong-Ipong (Fasciolaria salmo). Dibimbing oleh NURJANAH dan ASADATUN ABDULLAH.

Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) merupakan salah satu jenis Gastropoda air laut. Sebagai Gastropoda air laut, sampai saat ini keong ipong-ipong hanya dimanfaatkan sebagai bahan pangan. Masyarakat meyakini bahwa keong ipong-ipong ini bermanfaat untuk meningkatkan stamina tubuh dan vitalitas. Akan tetapi fakta ilmiah yang mendukung manfaat dari keong tersebut belum ada. Sehingga perlu dilakukan pengkajian atau penelitian mengenai komponen bioaktif yang terkandung pada keong ipong-ipong, yang mungkin memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Pengkajian ini dilakukan sebagai salah satu langkah untuk mengetahui pamanfaatan keong ipong-ipong dimasa mendatang.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan rendemen, kandungan zat gizi (air, lemak, protein, abu dan abu tidak larut asam), aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif yang terkandung dalam keong ipong-ipong. Pengujian yang digunakan meliputi analisis proksimat, uji kuantitatif aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, dan uji fitokimia.

Keong ipong-ipong pada penelitian ini berasal dari Desa Gebang, Kota Cirebon, Jawa Barat. Rendemen cangkang, isi dan jeroan keong ipong-ipong berturut-turut sebesar 69,69%, 22,08% dan 8,22%, sangat potensial dan ekonomis untuk dimanfaatkan lebih lanjut. Keong ipong-ipong mengandung air sebesar 73,07%, protein sebesar 18,28%, lemak sebesar 0,57%, abu sebesar 2,77%, abu tidak larut asam sebesar 0,15% dan karbohidrat sebesar 5,2%.

Ekstrak kasar daging dan jeroan keong ipong-ipong memiliki aktivitas antioksidan yang terlihat dari nilai IC50 yang diperoleh. Nilai IC50 dari ekstrak kloroform daging dan jeroan sebesar 9210 ppm dan 2825 ppm, ekstrak etil asetat nya sebesar 6825 ppm dan 4600 ppm dan ekstrak metanolnya sebesar 1513,8 ppm dan 994,47 ppm. Ekstrak kasar daging dan jeroan keong ipong-ipong ini mengandung 6 dari 9 komponen bioaktif yang diuji dengan metode fitokimia, antara lain alkaloid, steroid, karbohidrat, gula pereduksi, peptida dan asam amino bebas. Komponen-komponen bioaktif ini diduga memiliki banyak aktivitas fisiologis yang positif bagi kesehatan tubuh manusia. Salah satunya adalah kandungan steroid pada keong ipong-ipong. Hal ini membuktikan manfaat dari keong tersebut secara empiris yang dipercayai dapat meningkatkan stamina tubuh serta vitalitas.

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF

KEONG IPONG-IPONG (Fasciolaria salmo)

AZWIN APRIANDI C34070081

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Perikanan di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Judul : AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN KOMPONEN BIOAKTIF KEONG IPONG-IPONG (Fasciolaria salmo)

Nama : Azwin Apriandi NRP : C34070081

Departemen : Teknologi Hasil Perairan

Menyetujui,

Dosen Pembimbing I Dosen Pemimbing II

Dr. Ir. Nurjanah, MS Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M. NIP.1959 1013 1986 01 2 002 NIP. 1983 0405 2005 01 2 001

Mengetahui,

Dekan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan

Prof. Dr. Ir. Indra Jaya, M.Sc NIP.19610410 198601 1 002

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini dengan judul “Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif Keong Ipong-Ipong (Fasciolaria salmo) “adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang telah diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, September 2010

Azwin Apriandi C34070081

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, rahmat dan bimbingan-Nya, sehingga penulis dapat meyelesaikan penyusunan skripsi ini dengan baik.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan Gelar Sarjana di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Skripsi

hasil penelitian ini berjudul “Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif pada

Keong Ipong-ipong (Fasciolaria salmo)”.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama penyusunan skripsi ini , terutama kepada:

1. Dr. Ir. Nurjanah, MS dan Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M. selaku dosen pembimbing, atas segala bimbingan, pengarahan serta masukan yang telah diberikan kepada penulis.

2. Dr. Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil. selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan.

3. Dr. Ir. Agoes Mardiono Jacoeb, Dipl. Biol selaku Ketua Program Studi Departemen Teknologi Hasil Perairan, yang telah banyak membantu penulis selama proses penyusunan skripsi.

4. Pak Haris Fadillah selaku Kepala Dinas Pendidikan Kabupaten Karimun, yang telah memberikan motivasi serta dukungannya kepada penulis. 5. Keluarga terutama Bapak, ibu dan Adik yang telah memberikan semangat,

materil dan doanya, serta membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

6. Novi Winarti yang telah memberi semangat dan motivasi kepada penulis selama menyelesaikan skripsi ini.

7. Teman-teman THP 44, 43, 42 yang telah banyak memberikan masukan dan informasi-informasi penting pada penulis sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

8. Semua pihak yang telah membantu dalam penulisan skripsi ini, yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa masih banyak banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari berbagai pihak dalam proses penyempurnaan skripsi ini. Semoga tulisan ini bermanfaat bagi pihak-pihak yang memerlukannya.

Bogor, September 2010

Azwin Apriandi

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kepulauan Riau pada tanggal 2 April 1990 sebagai anak pertama dari dua bersaudara pasangan Darwin dan Azizah, S.Pd.I.

Penulis memulai jenjang pendidikan formal di MI Baitul Mubin Alai Kecamatan Kundur (tahun 1995-2001), selanjutnya penulis melanjutkan pendidikannya di MTsN Tanjungbatu Kundur (tahun 2001-2004), pendidikan menengah atas ditempuh penulis di SMAN 1 Kundur dan lulus pada tahun 2007. Pada tahun yang sama, penulis memperoleh Beasiswa Utusan Daerah (BUD) untuk melanjutkan pendidikan kuliah ke Institut Pertanian Bogor.

Selama masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai organisasi kemahasiswaan, seperti Himpunan Mahasiswa Teknologi Hasil Perikanan sebagai anggota divisi peduli pangan. Penulis juga aktif sebagai asisten praktikum mata kuliah Biokimia Hasil Perairan 2009-2010 dan 2010-2011, asisten praktikum mata kuliah Biotoksikologi Hasil perairan 2010-2011, asisten mata kuliah Teknologi Pengolahan Hasil Perairan 2010-2011 dan koordinator asisten mata kuliah Pengetahuan Bahan Baku Industri Hasil Perairan 2010-2011

Sebagai salah satu syarat meraih gelar sarjana, penulis melakukan penelitian yang berjudul “Aktivitas Antioksidan dan Komponen Bioaktif

Keong Ipong-Ipong (Fasciolaria salmo) “di bawah bimbingan Dr. Ir. Nurjanah, MS. dan Asadatun Abdullah, S.Pi, M.Si, M.S.M.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ……….. vii

DAFTAR TABEL ………... ix

DAFTAR GAMBAR ……… x

DAFTAR LAMPIRAN ……… xi

1 PENDAHULUAN………... 1

1.1 LatarBelakang ………... 1

1.2 Tujuan ……….. 2

2 TINJAUAN PUSTAKA ………... 3

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Keong Ipong-ipong (Fasciolaria salmo)……….… 3

2.2 Antioksidan ……….………... 4

2.2.1 Fungsi antioksidan………..……… 5

2.2.2 Jenis-jenis antioksidan ………...……….... 6

2.2.1.1 Antioksidan sintetik…………..………. 6

2.2.1.2 Antioksidan alami...…………..………. 7

2.3 Uji Aktivitas Antioksidan ………..………... 8

2.4 Ekstraksi Senyawa Bioaktif……….………... 9

2.5 Metabolit Sekunder………….……….………... 11

2.6 Analisis Fitokimia………..………... 11

β.6.1 Alkaloid ……….……….... 12

β.6.β Steroid/triterpenoid ………... 13

β.6.γ Flavonoid ……….. 14

β.6.4 Saponin ………. 14

β.6.5 Fenolhidrokuinon ………... 15

β.6.6 Karbohidrat ………... 16

β.6.7 Gulapereduksi ……….. 16

β.6.8 Peptida ……….. 17

β.6.9 Asam amino ………... 17

3 METODOLOGI………...…..………... 19

3.1 Waktu dan Tempat ………...….………….… 19

3.2 Bahan dan Alat ………...……..….………... 19

3.3 Metode Penelitian ……….………... 20

3.3.1 Pengambilan dan preparasi bahan baku..………... 20

1) Analisis kadar air (AOAC β005) ………. 21

2) Analisis kadar abu (AOAC β005) ……… 21

3) Analisis kadar protein (AOAC 1980) ……….. 22

4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005) ……… 22

5) Analisis kadar abu tidak larut asam menurut SNI 01-3836-2000 (BSN β000) ……… 23

3.3.3 Analisis antioksidan dengan metode DPPH…………... 23

1) Ekstraksi bahan aktif (Quinn 1988dalam Darusman et al.1995)……….. 23

2) Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 dalam Hanani et al. 2005) ………. 26

3.3.4 Uji fitokimia (Harborne 1984) ……….. 27

4 HASIL DAN PEMBAHASAN……….... 30

4.1 Karakteristik Keong Ipong-Ipong (Fasciolaria salmo) ……… 30

4.1.1 Rendemen ………. 31

4.1.2 Komposisi kimia ………. 32

1) Kadar air ……….. 33

2) Kadar lemak ……… 34

3) Kadar protein ……….. 35

4) Kadar abu ……… 35

5) Kadar abu tidak larut asam ………. 36

6) Kadar karbohidrat ………... 37

4.2 Ekstraksi Komponen Bioaktif pada Keong Ipong-Ipong ..……….. 37

4.2.1 Ekstrak kasar ………. 38

4.2.2 Komponen bioaktif pada ekstrak kasar ………. 40

1) Alkaloid ………... 41

2) Steroid ………. 43

3) Karbohidrat ………. 44

4) Gula pereduksi ………. 46

5) Peptida …….………. 46

6) Asam amino ………. 47

4.3 Aktivitas Antioksidan ……….. 48

5 KESIMPULAN DAN SARAN……… 56

5.1 Kesimpulan ……….. 56

5.2 Saran ………. 56

DAFTAR PUSTAKA ……… 57

DAFTAR TABEL

Nomor Teks Halaman

1. Hasil pengamatan karakteristik fisik cangkang, isi cangkang

dan operkulum keong ipong-ipong.……… 30

2. Hasil uji fitokimia ekstrak kasar keong ipong-ipong.………. 40

3. Hasil uji aktivitas antioksidan larutan BHT………... 50

4. Hasil uji aktivitas antioksidan larutan ekstrak kasar daging

keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo)………... 50 5. Hasil uji aktivitas antioksidan larutan ekstrak kasar jeroan

DAFTAR GAMBAR

Nomor Teks Halaman

1. Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo).………. 3

2. Reaksi Penghambatan antioksidan primer terhadap radikal lipida 6 3. Struktur Diphenylpycrilhydrazil dan Diphenylpycrilhydrazine .. 9

4. Struktur alkaloid ………... 12

5. Struktur steroid ………..………... 13

6. Struktur umum saponin…...……….………. 15

7. Diagram Alir Proses Ekstraksi Daging keong ipong-ipong

(Fasciolaria salmo)……….. 26

8. Keong ipong-ipong yang diambil di perairan Desa Gebang

Cirebon……….. 30

9. Rendemen cangkang dan isi cangkang (daging dan jeroan)

keong ipong-ipong………... 31

10.Hasil uji proksimat keong ipong-ipong (n=2)…..………... 33 11.Rendemen ekstrak kasar keong ipong-ipong …..………... 38 12.Garfik hubungan konsentrasi BHT dengan persen inhibisinya... 51 13.Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar daging

keong ipong-ipong dengan persen inhibisinya………... 52 14.Grafik hubungan konsentrasi ekstrak kasar jeroan

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Bentuk cangkang keong ipong-ipong….……....……….…... 63

2. Perhitungan rendemen keong ipong-ipong ………. 63

3. Perhitungan analisis proksimat ………..………... 63

4. Dataekstrak kasar daging dan jeroan keong ipong-ipong….. 65

5. Perhitungan pembuatan larutan stok dan pengencerannya ... 66

6. Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi perdaman DPPH 68

7. Perhitungan persen inhibisi dan IC50..……….… 68

8. Gambar hasil uji fitokimia ekstrak daging dan jeroan keong

ipong-ipong………....……….. 70

1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Semakin majunya zaman menyebabkan semakin tingginya tuntutan terhadap aktivitas dunia kerja. Kondisi ini akan memaksa masyarakat untuk berpindah kepada hal-hal yang bersifat instant termasuk pola makannya. Makanan

instant dapat mengandung xenobiotik (pengawet, zat warna, penyedap rasa, pestisida, logam berat atau zat kimia lain) yang beresiko akumulasi jangka panjang. Xenobiotik dapat menjadi radikal bebas di dalam tubuh manusia.

Radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa reaktif, yang secara umum diketahui sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak berpasangan di kulit terluarnya (winarsi 2007). Adanya radikal bebas di dalam tubuh manusia dapat menimbulkan berbagai penyakit yaitu serangan jantung, kanker, stroke, gagal ginjal, penuaan dini, dan penyakit kronik lainnya (Prasad et al. 2009; Saha et al. 2008). radikal bebas dapat ditangkal atau diredam dengan pemberian antioksidan atau dengan mengkonsumsi antioksidan (Salimi 2005; Halliwell 2007; Kubola & Siriamornpun 2008; Mohsen & Ammar 2009). Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam (Sunardi 2007). Konsumsi antioksidan dalam jumlah memadai dapat menurunkan resiko terkena penyakit degeneratif yaitu kardiovaskuler, kanker, aterosklerosis, dan lain-lain. Antioksidan terdapat secara alami dalam hampir semua bahan pangan, baik yang berasal dari daratan maupun perairan. Bahan pangan yang berasal dari perairan contohnya kelas Gastropoda, banyak mengandung komponen-komponen antioksidan. Adapun jenis-jenis Gastropoda yang telah diteliti dan mengandung antioksidan antara lain, Lobiger serradifalci dan Oxynoe olivacea (Cavas 2004)

Viviparus ater (Campanella et al. 2005), lintah laut (Discodoris sp.) (Andriani 2009; Nurjanah 2009), keong mata merah (Cerithedia obtusa) (Prabowo 2009), keong mas (Pomacea canaliculata Lamarck) (Susanto 2010), Keong papaya (Melo sp.) (Tias 2010), Lymnaea stagnalis (Vorontsova et al. 2010), adalagi jenis

mengandung antioksidan, Gastropoda juga mengandung berbagai macam komponen bioaktif yang bermanfaat bagi kesehatan manusia. Komponen-komponen biaoktif tersebut seperti jenis alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan lain sebagainya (Harborne 1987).

Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) merupakan salah satu jenis Gastropoda air laut yang pemanfaatannya belum begitu banyak. Secara empiris keong ipong-ipong dipercayai dapat meningkatkan stamina tubuh serta vitalitas. Akan tetapi data-data ilmiah yang mendukung khasiat dari keong tersebut belum ada. Sehingga perlu dilakukan pengkajian mengenai komponen bioaktif yang terkandung di dalam tubuh keong ipong-ipong. Komponen-komponen bioaktif tersebut diharapkan memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Pengkajian ini bermanfaat untuk mengetahui pemanfaatan dari keong ipong-ipong dimasa yang akan datang.

1.2 Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan rendemen, kandungan zat gizi (air, lemak, protein, abu, abu tidak larut asam, dan karbohidrat), aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif yang terkandung dalam keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) dari Cirebon, Jawa Barat.

2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deskripsi dan Klasifikasi Keong Ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

Keong ipong-ipong merupakan salah satu spesies dari kelas Gastropoda, dan merupakan kelompok Moluska. Moluska merupakan filum yang paling berhasil menduduki berbagai habitat. Terdapat lebih dari 60.000 spesies hidup dan 15.000 spesies fosil. Hidup sejak periode Cambrian, dan diduga sampai sekarang sedang puncak perkembangan evolusinya (Suwignyo et al. 2005). Berikut dapat kita lihat kalisifikasi toksonomis dari keong ipong-ipong menurut Dance (1977). Filum : Moluska

Kelas : Gastropoda Ordo : Neogastropoda Famili : Fasciolariidae Genus : Fasciolaria

Spesies : Fasciolaria salmo.

Bentuk morfologi cangkang keong ipong-ipong dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

Moluska memiliki keragaman yang sangat besar, hal ini dapat dilihat dari struktur dan habitatnya. Komoditas ini menempati semua lingkungan laut, mulai dari tepi laut berbatu yang merupakan daerah deburan ombak sampai ke hydrothermal vent di laut dalam (Castro dan Huber 2007). Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) merupakan salah satu spesies dari kelas gastropoda yang memiliki bentuk cangkang seperti kerucut dari tabung yang melingkar seperti konde (gelung,

worl). Puncak kerucut merupakan bagian yang tertua yang disebut apex, terdapat bulu-bulu kecil sekeliling cangkang dan memiliki warna kuning kehijauan.

Cangkang dari keong terdiri dari 4 lapisan. Lapisan paling luar adalah periostrakum, yang merupakan lapisan tipis terdiri dari bahan protein seperti zat tanduk, disebut conchiolin atau conchin. Lapisan ini terdapat endapan pigmen beraneka warna, yang menjadikan banyak cangkang siput terutama spesies laut termasuk keong ipong-ipong ini yang memiliki warna sangat indah, kuning, hijau cemerlang dengan bercak-bercak merah atau garis-garis cerah. Periostrakum berfungsi untuk melindungi lapisan di bawahnya yang terdiri dari kalsium karbonat terhadap erosi. Lapisan kalsium karbonat terdiri dari 3 lapisan atau lebih, yang terluar adalah prismatik atau palisade, lapisan tengah atau lamella dan paling dalam adalah lapisan nacre atau hypostracum (Suwignyo et al. 2005).

Keong ipong-ipong merupakan kelas Gastropoda yang hidup di laut. Gastropoda yang hidup di laut dapat dijumpai di berbagai jenis lingkungan dan bentuknya telah beradaptasi dengan lingkungannya tersebut (Nontji 1987). Di laut

dalam gastropoda dapat hidup sampai pada kedalaman 5000 meter (Plaziat 1984). Barnes (1987) menyebutkan beberapa jenis dari gastropoda hidup

menempel pada subtrat yang keras, akan tetapi ada juga yang hidup di subtrat seperti pasir dan lumpur. Gastropoda juga dapat hidup di zona litoral, daerah pasang surut dengan menempel pada terumbu karang, laut dalam maupun dangkal bahkan ada yang hidup di air tawar (Berry 1972). Dilingkungan laut gastropoda dapat ditemukan di daerah benthik, antara bebatuan dan pada subtrat lunak (lumpur).

2.2 Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan, menahan pembentukan ataupun memadukan efek spesies oksigen dan nitrogen reaktif (Kuncahyo dan Sunardi 2007). Antioksidan mempunyai peran berupa penghambatan proses aterosklerosis, yaitu merupakan komplikasi dari penyakit diabetes mellitus yang sangat berperan untuk terjadinya penyakit jantung koroner (Musthafa et al. 2000). Rohman dan Riyanto (2005) menyatakan bahwa antioksidan adalah sebagai senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas dalam tubuh yang dapat menyebabkan penyakit karsinogenis, kardiovaskuler dan

penuaan. Antioksidan diperlukan karena tubuh manusia tidak memiliki sistem pertahanan antioksidan yang berlebihan, sehingga apabila terjadi paparan radikal berlebihan, maka tubuh akan membutuhkan antioksidan eksogen (berasal dari luar) (Wiji dan Sugrani 2009).

2.2.1 Fungsi antioksidan

Fungsi utama antioksidan yaitu dapat digunakan sebagi upaya untuk memperkecil tejadinya proses oksidasi dari lemak dan minyak, memperkecil terjadinya proses kerusakan dalam makanan, memperpanjang masa pemakaian dalam industri makanan, meningkatkan stabilitas lemak yang terkandung dalam makanan serta mencegah hilangnya kualitas sensori dan nutrisi (Kuncahyo dan Sunardi 2007). Antioksidan juga dapat menetralkan radikal bebas, seperti enzim SOD (Superosida Dismutase), gluthatione, dan katalase. Antioksidan dapat diperoleh dari asupan makanan yang banyak mengandung vitamin C, vitamin E dan berkaroten serta senyawa fenolik (Prakasih 2001; Frei 1994; Trevor 1995 diacu dalam Andayani et al. 2008). Musthafa dan Lawrence (2000) menambahkan bahwa antioksidan juga pada akhirnya berfungsi untuk menetralisir atau meredam dampak negatif dari radikal bebas.

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi utama antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan disingkat (AH) yang mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal bebas. Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder, yaitu memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal bebas kebentuk lebih stabil (Gordon 1990).

Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah dapat menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi. Penambahan tersebut dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi (Gambar 2). Radikal-radikal antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul

tertentu membentuk radikal bebas baru (Gordon 1990). Menurut Hamilton (1983), radikal-radikal antioksidan dapat saling bereaksi membentuk

produk non radikal dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Reaksi Penghambatan antioksidan primer terhadap radikal bebas (Sumber: Gordon 1990).

Antioksidan juga dapat berperan dalam menekan prolifersi (perbanyakan) sel kanker, karena antioksidan berfungsi menutup jalur pembentukan sel ganas (blocking agent) (Trilaksani 2003). Selain itu antioksidan juga berperan sebagai agen antiaging yang melindungi kulit dari proses pengrusakan oleh paparan sinar matahari dan radikal bebas, yang dapat menimbulkan keriput dan penuaan pada kulit (Suryowinoto 2005).

2.2.2 Jenis-jenis antioksidan

Antioksidan sangat beragam jenisnya. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia) dan antioksidan alami ( antioksidan hasil ekstraksi bahan alami).

2.2.2.1 Antioksidan sintetik

Diantara beberapa contoh antioksidan sintetik yang diizinkan penggunaan untuk makanan yaitu Butil Hidroksi Anisol (BHA), Butil Hidroksi Toluen (BHT), propil galat (PG), Tert-Butil Hidoksi Quinon (TBHQ) dan tokoferol. Antioksidan tersebut merupakan antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan komersial (Buck 1991). Antioksidan BHA memiliki kemampuan antioksidan yang baik. Hal ini dapat dilihat dari ketahanannya terhadap tahap-tahap pengelolaan maupun stabilitasnya pada produk akhir seperti lemak hewan yang digunakan dalam pemanggangan, akan tetapi BHA relatif tidak efektif jika ditambahkan pada minyak tanaman. Antioksidan BHA bersifat larut lemak dan tidak larut air, berbentuk padat putih dan dijual dalam bentuk tablet atau serpih, bersifat volatil sehingga berguna untuk penambahan ke materi pengemas (Buck 1991; Coppen 1983).

Inisiasi ; R* + AH ---RH + A*

Antioksidan sintetik BHT memiliki sifat serupa BHA, antioksidan ini akan memberi efek sinergis yang baik jika digunakan bersama antioksidan BHA. Antioksidan BHT berbentuk kristal padat putih dan digunakan secara luas karena relatif murah. Antioksidan sintetik lainnya yaitu propil galat. Propil galat mempunyai karakteristik sensitif terhadap panas, terdekomposisi pada titik cairnya 148⁰C, dapat membentuk komplek warna dengan ion metal, sehingga kemampuan antioksidannya rendah. Selain itu, propil galat memiliki sifat berbentuk kristal padat putih, sedikit tidak larut lemak tetapi larut air, serta memberi efek sinergis dengan BHA dan BHT (Buck 1991).

Antioksidan TBHQ dikenal sebagai antioksidan paling efektif untuk lemak dan minyak, khususnya minyak tanaman karena memiliki kemampuan antioksidan yang baik pada proses penggorengan tetapi rendah pada proses pembakaran. Jika antioksidan TBHQ digabungkan dengan antioksidan BHA, maka akan memiliki kemampuan antioksidan yang baik pada proses pemanggangan dan akan memberikan manfaat yang lebih luas . antioksidan TBHQ dikenal berbentuk bubuk putih sampai coklat terang, mempunyai kelarutan cukup pada lemak dan minyak, tidak membentuk kompleks warna dengan Fe dan Cu tetapi dapat berubah pink dengan adanya basa (Buck 1991).

Tokoferol merupakan antioksidan alami yang dapat ditemukan hampir disetiap minyak tanaman. Akan tetapi saat ini tokoferol telah dapat diproduksi secara kimia. Tokoferol memiliki karakteristik berwarna kuning terang, larut dalam lipid karena rantai C panjang. Pengaruh nutrisi secara lengkap dari

tokoferol belum diketahui, tetapi α-tokoferol dikenal sebagai sumber vitamin E.

Di dalam jaringan hidup, aktivitas antioksidan tokoferol cenderung

α-> -> ->δ-tokoferol, tetapi dalam makanan aktivitas tokoferol terbalik

δ-> -> ->α-tokoferol (Belitz dan Grosch 1987). Urutan tersebut kadang bervariasi tergantung pada substrat dan kondisi-kondisi lain seperti suhu.

2.2.2.2 Antioksidan Alami

Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke makanan

sebagai bahan tambahan pangan (Pratt 1992). Menurut Pratt dan Hudson (1990), kebanyakan senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami adalah berasal dari tumbuhan.

Menurut Pratt dan Hudson (1990) senyawa antioksidan alami umumnya adalah senyawa fenolik atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid,turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol, dan asam-asam organik polifungsional. Ditambahkan oleh Pratt (1992), golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol, isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain. Senyawa antioksidan alami polifenolik ini adalah multifungsional dan dapat beraksi sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkelat logam, dan peredam terbentuknya singlet oksigen.

2.3 Uji Aktivitas Antioksidan

Keberadaan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat diketahui melalui uji aktivitas antioksidan. Terdapat berbagai metode pengukuran aktivitas antioksidan. Pada prisipnya metode-metode tersebut digunakan untuk mengevaluasi adanya aktivitas penghambatan proses oksidasi oleh senyawa antioksidan yang terdapat dalam bahan pangan atau contoh ekstrak bahan alam (Setyaningsih 2003).

Salah satu metode yang umum digunakan yaitu dengan menggunakan radikal bebas stabil diphenilpycrylhydrazil (DPPH). Metode ini, larutan DPPH yang berperan sebagai radikal bebas akan bereaksi dengan senyawa antioksidan, sehingga DPPH akan berubah menjadi diphenilpycrilhydrazine yang bersifat non-radikal yang tidak barbahaya sebagaimana dapat dilihat pada gambar 3. berikut. Meningkatnya jumlah diphenilpycrilhydrazine akan ditandai dengan berubahnya warna ungu pada larutan menjadi warna kuning pucat (Molyneux 2004).

Hasil dari metode DPPH umumnya dibuat dalam bentuk IC50 (Inhibitor

Concentration 50), yang didefinisikan sebagai konsentrasi larutan substrat atau sampel yang akan menyebabkan tereduksi aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin

besar aktivitas antioksidan maka nilai IC50 akan semakin kecil. Molyneux (2004) menyatakan bahwa .Suatu senyawa antioksidan dinyatakan baik

jika nilai IC50-nya semakin kecil. 2.4 Ekstraksi Senyawa Bioaktif

Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan yang paling banyak digunakan untuk menarik atau memisahkan komponen bioaktif dari suatu bahan baku. Ekstraksi dapat diartikan sebagai suatu proses penarikan komponen yang diinginkan dari suatu bahan dengan menggunakan pelarut yang dipilih sehingga komponen yang diinginkan dapat larut (Ansel 1989). Winarno et al. (1973), menambahkan ekstraksi adalah suatu cara untuk memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen-komponen yang terpisah. Proses ekstraksi bertujuan untuk mendapatkan bagian-bagian tertentu dari suatu bahan yang mengandung komponen-komponen aktif.

Selama proses ekstraksi terdapat gaya yang bekerja akibat adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan ekstraksi di luar sel. Bahan pelarut yang mengalir ke dalam ruang sel akan menyebabkan protoplasma membengkak dan bahan yang terkandung di dalam sel akan terlarut sesuai dengan kelarutannya (Voight 1994).

Menurut Ansel (1989) dan Winarno et al. 1973, ekstraksi dapat dilakukan dengan dua cara yaitu aqueus phase dan organic phase. Cara aqueus phase

dilakukan dengan menggunakan air, sedangkan cara organic phase dilakukan dengan menggunakan pelarut organik. Berdasarkan prinsipnya, proses ekstraksi dapat berlangsung bila terdapat kesamaan dalam sifat kepolaran antara senyawa yang diekstrak dengan senyawa pelarut. Suatu zat memiliki kemampuan terlarut yang berbeda dalam pelarut yang berbeda. Hal ini menunjukkan adanya interaksi antara zat telarut dengan pelarut. Senyawa polar akan larut pada pelarut polar juga, begitu juga sebaliknya.

Sifat penting yang harus diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah kepolaran senyawa yang dilihat dari gugus polarnya (seperti gugus OH, COOH,

dan lain sebagainya). Hal ini yang perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah selektivitas, kemampuan untuk mengekstrak, toksisitas, kemudahan untuk diuapkan, dan harga (Harborne 1987). Harborne (1987) mengelompokkan metode ekstraksi menjadi dua, yaitu ekstraksi sederhana dan ekstraksi khusus. Ekstraksi sederhana terdiri atas:

a) Maserasi, yaitu metode ekstraksi dengan cara meredam sampel dalam pelarut dengan atau tanpa pengadukan;

b) Perkolasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan;

c) Reperkolasi, yaitu perkolasi dimana hasil perklorasi digunakan untuk melarutkan sampel di dalam perkulator sampai senyawa kimianya terlarut; d) Diakolasi, yaitu perkolasi dengan penambahan tekanan udara.

Ekstraksi khusus terdiri atas:

a) Sokletasi, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan untuk melarutkan sampel kering dengan menggunakan pelarut bervariasi;

b) Arus balik, yaitu metode ekstraksi secara berkesinambungan dimana sampel dan pelarut saling bertemu melalui gerakan aliran yang berlawanan;

c) Ultrasonik, yaitu metode ekstraksi dengan menggunakan alat yang menghasilkan frekuensi bunyi atau getaran antara 25-100 KHz

2.5 Metabolit Sekunder

Metabolit sekunder adalah suatu zat yang dibiosintesis terutama dari banyak metabolit-metabolit primer seperti asam amino, asetol koenzim-A, asam mevalonat, dan zat antara (Intermediate) dari alur shikimat (Shikimic acid)

(Herbert 1995). Metabolit sekunder sangat bervariasi jumlah dan jenisnya dari setiap organisme. Beberapa dari senyawa tersebut telah diisolasi sebagian diantaranya memberikan efek fisiologis dan farmakologis yang lebih dikenal sebagai senyawa kimia aktif (Copriady et al. 2005).

Makhluk hidup dapat menghasilkan bahan organik sekunder (metabolit sekunder) atau bahan alami melalui reaksi sekunder dari bahan organik primer (karbohidrat, lemak, protein). Bahan organik sekunder (metabolit sekunder) ini umumnya merupakan hasil akhir dari suatu proses metabolisme. Bahan ini

berperan juga pada proses fisiologi. Bahan organik sekunder itu dapat dibagi menjadi tiga kelompok besar yaitu : fenolik, alkaloid dan terpenoid, tetapi pigmen dan porfirin juga termasuk di dalamnya (Purwanti 2009).

Zat metabolit sekunder memiliki banyak jenis, adapun jenis dari metabolit sekunder yang dapat kita ketahui antara lain kumarin (Copriandy et al. 2005), azadirachtin, salanin, meliatriol, nimbin (Samsudin 2008). Pemanfaatan dari zat metabolit sekunder sangat banyak.Metabolit sekunder dapat dimanfaatkan sebagai antioksidan, antibiotik, antikanker, antikoagulan darah, menghambat efek karsinogenik (Copriandy et al. 2005), selain itu metabolit sekunder juga dapat dimanfaatkan sebagai antiagen pengendali hama yang ramah lingkungan (Samsudin 2008).

2.6 Analisis Fitokimia

Analisis fitokimia adalah analisis yang mencangkup pada aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh makhluk hidup, yaitu mengenai struktur kimianya, biosintesisnya, perubahan serta metabolismenya, penyebarannya secara alamiah dan fungsi biologisnya (Harborne 1987). Senyawa fitokimia bukanlah zat gizi , namun kehadirannya dalam tubuh dapat membuat tubuh lebih sehat, lebih kuat dan lebih bugar (Astawan dan Kasih 2008). Alasan melakukan analisis fitokimia adalah untuk menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek bermanfaat, yang ditunjukkan oleh ekstrak kasar bila diuji dengan sistem biologi (Harborne 1987).

2.6.1 Alkaloid

Alkaloid pada umumnya mencangkup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne 1987). Sirait (2007) menyatakan alkaloid adalah senyawa kimia tanaman hasil metabolit sekunder yang terbentuk berdasarkan prinsip pembentukan campuran. Alkaloid biasanya tanpa warna, seringkali bersifat optis aktif, kebanyakan berbentuk kristal tetapi hanya sedikit yang berupa cairan (misalnya nikotina) pada suhu kamar. Alkaloid merupakan turunan yang paling umum dari asam amino. Secara kimia, alkaloid merupakan suatu golongan heterogen. Secara fisik, alkaloid dipisahkan dari kandungan

tumbuhan lainnya sebagai garamnya dan sering diisolasi sebagai Kristal hidroklorida atau pikrat (Harborne 1987).

Senyawa alkaloid dikelompokkan menjadi tiga antara lain, alkaloid sesungguhnya, protoalkaloid, dan pseudoalkaloid. Alkaloid sesungguhnya adalah racun, senyawa tersebut menunjukkan aktivitas fisiologis yang luas, hampir tanpa terkecuali bersifat basa, umumnya mengandung nitrogen dalam cincin heterosiklik, diturunkan dari asam amino, dan biasanya terdapat ditanaman sebagai garam asam organik. Protoalkaloid merupakan amin yang relatif sederhana dimana di dalam nitrogen asam amino tidak terdapat cincin heterosiklik, dan diperoleh berdasarkan biosintesis dari asam amino yang bersifat basa. Pseudoalkaloid tidak diturunkan dari prekursor asam amino, dan biasanya senyawa ini bersifat basa (Sastrohamidjojo 1996). Berikut struktur kimia dari alkaloid pada Gambar 4.

Gambar 4. Struktur alkaloid (Sumber: Pulatova dan Khazanovich 1962)

2.6.2 Steroid/Triterpenoid

Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprene dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehida atau asam karboksilat. Mereka berupa senyawa tanpa warna, berbentuk Kristal, seringkali bertitik leleh tinggi dan optik aktif (Harborne 1987). Triterpenoid dapat dibagi menjadi empat kelompok senyawa, yaitu triterpen sebenarnya, steroid, saponin, dan glokisida jantung (cardiac glycoside). Beberapa triterpen dikenal dengan rasanya, terutama rasa pahit (Sirait 2007).

Steroid merupakan golongan dari senyawa triterpenoid. Senyawa ini dapat diklasifikasikan menjadi steroid dengan atom karbon tidak lebih dari 21, sehingga golongan senyawa ini cenderung tidak larut air (Wilson dan Gisvold 1982).

Adapun contohnya seperti sterol, sapogenin, glikosida jantung dan vitamin D. Steroid alami berasal dari berbagai transformasi kimia dari triterpena yaitu lanosterol dan saikloartenol. Senyawa steroid dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan obat (Harborne 1987). Hasil penelitian Silva et al. (2002) menunjukkan bahwa komponen steroid yang diekstrak dari daun Agave attenuata memiliki aktivitas anti-inflamasi, walaupun aktivitas ini diikuti dengan efek hemolitik yang tidak diinginkan. Komponen steroid dapat meningkatkan aktivitas hemolitik karena steroid memiliki afinitas lebih tinggi dari kolesterol pada membran eritrosit. Struktur dari steroid dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Struktur steroid (Sumber: Shaddack 2005)

2.6.3 Flavonoid

Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Cincin A memiliki karakteristik bentuk hidroksilasi phloroglusinol atau resorsinol, dan cincin B biasanya 4-,3,4-, atau 3,4,5-terhidroksilasi (Sastrohamidjojo 1996). Senyawa ini dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, oleh karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amoniak (Harborne 1987).

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi, oleh karena itu menunjukkan pita swrapan kuat pada daerah spectrum UV dan spectrum tampak. Flavonoid terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid. Penggolongan jenis flavonoid dalam jaringan tumbuhan

mula-mula didasarkan pada telaah sifat kelarutan dan reaksi warna. Terdapat sekitar sepuluh kelas flavonoid yaitu antosianin, proantosianidin, flavonol, flavon, glikoflavon, biflavonil, khalkon, auron, flavanon dan isoflavon (Harborne 1987)

Flavonoid pada tumbuhan berfungsi dalam pengaturan fotosintesis, kerja antimikroba dan antivirus, dan kerja terhadap serangga (Robinson 1995). Adapun fungsi flavonoid dalam kehidupan manusia yaitu sebagai stimulant pada jantung, hesperidin mempengaruhi pembuluh darah kapiler. Flavon terhidrolisasi berkerja sebagai diuretik dan antioksidan pada lemak (Sirait 2007).

2.6.4 Saponin

Saponin adalah glikosida triterpena dan sterol yang telah terdeteksi dalam lebih dari 90 suku tumbuhan. Glikosida adalah suatu kompleks antara gula pereduksi (glikon) dan bukan gula (aglikon). Glikon bersifat mudah larut dalam air dan glikosida-glikosida mempunyai tegangan permukaan yang kuat (Winarno 1997). Selain itu saponin adalah senyawa aktif permukaan kuat yang menimbulkan busa jika dikocok dalam air dan pada konsentrasi rendah sering menyebabkan heomolisis sel darah merah (Robinson 1995). Sifatnya sebagai senyawa aktif permukaan disebabkan adanya kombinasi antara aglikon lipofilik dengan gula yang bersifat hidrofilik (Houghton dan Raman 1998). Banyak saponin yang mempunyai satuan gula sampai lima dan komponen yang umum ialah asam glukuronat (Harborne 1987). Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti terpercaya akan adanaya saponin. Saponin jauh lebih polar daripada sapogenin karena ikatan glikosidanya (Harborne 1987). Struktur saponin secara umum disajikan pada Gambat 6.

Gambar 6. Struktur umum saponin (Sumber: Yamasaki 1999)

2.6.5 Fenol Hidrokuinon

Fenol meliputi berbagai senyawa yang berasal dari tumbuhan dan mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua gugus hidroksil. Flavonoid merupakan golongan fenol yang terbesar, selain itu juga terdapat fenol monosiklik sedarhana, fenilpropanoi, dan kuinon fenolik (Harborne 1987).

Kuinon adalah senyawa bewarna dan mempunyai kromofor dasar, seperti kromofor pada benzokuinon, yang terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon. Kuinon untuk tujuan identifikasi dapat dipilah menjadi empat kelompok, yaitu benzokuinon, naftokuinon, antrakuinon dan kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidroksilasi dan bersifat senyawa fenol serta mungkin terdapat in vivo

dalam bentuk gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol tanpa warna, kadang-kadang juga bentuk dimer. Dengan demikian diperlukan hidrolisis asam untuk melepaskan kuinon bebasnya (Harborne 1987).

Senyawa kuinon yang terdapat sebagai glikosida mungkin larut sedikit dalam air, tetapi umunya kuinon lebih mudah larut dalam lemak dan akan terdeteksi dari tumbuhan bersama-sama dengan karotenoid dan klorofil. Reaksi yang khas adalah reduksi bolak-balik yang mengubah kuinon menjadi senyawa tanpa warna, kemudian warna kembali lagi bila terjadi oksidasi oleh udara. Reduksi dapat dilakukan menggunakan natrium borohidrida dan oksidasi ulang dapat terjadi hanya dengan mengocok larutan tersebut diudara (Harborne 1987).

Antioksidan yang termasuk dalam golonhan ini biasanya mempunyai intensitas warna yang rendah atau kadang-kadang tidak bewarna dan banyak digunakan karena tidak beracun. Antioksidan golongan fenol meliputi sebagian besar antioksidan yang dihasilkan oleh alam dan sejumlah kecil antioksidan sintesis, serta banyak digunakan dalam lemak atau bahan pangan berlemak. Beberapa contoh yang termasuk golongan ini antara lain hidrokuinon gossypol, pyrogallol, catechol resorsinol dan eugenoli (Ketaren 1986).

2.6.6 Karbohidrat

Karbohidrat merupakan sumber energi utama bagi manusia dan hewan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan. Melalui proses fotosintesis, klorofil tanaman

dengan sinar matahari mampu membentuk karbohidrat dari karbon dioksida (CO2) yang berasal dari udara dan air dari tanah. Proses fotosintesis menghasilkan

karbohidrat sederhana glukosa dan oksigen yang dilepas di udara (Almatsier 2006).

Karbohidrat dapat dikelompokkan menjadi monosakarida, oligosakarida, serta polisakarida. Monosakarida merupakan suatu molekul yang dapat terdiri dari lima atau enam atom C, sedangkan oligosakarida merupakan polimer dari 2-10 monosakarida, dan pada umumnya polisakarida merupakan polimer yang terdiri lebih dari 10 monomer monosakarida (Winarno 2008). Karbohidrat mempunyai peran penting untuk mencegah pemecahan protein tubuh yang berlebihan, timbulnya ketosis, kehilangan mineral dan berguna untuk metabolisme lemak dan protein dalam tubuh (Budiyanto 2002).

2.6.7 Gula pereduksi

Sifat pereduksi dari suatu molekul gula ditentukan oleh ada tidaknya gugus hidroksil (OH) bebas yang reaktif. Gugus hidroksil yang reaktif pada glukosa (aldosa) biasanya terletak pada karbon nomor dua. Sukrosa tidak mempunyai gugus OH bebas yang reaktif karena keduanya sudah saling terikat, sedangkan laktosa mempunyai OH bebas pada atom C nomor 1 pada gugus glukosanya (Winarno 2008).

Gula pereduksi teroksidasi oleh zat pengoksidasi lemah, seperti larutan Benedict dan Fehling (reduksi Cu2+ menjadi Cu+) dan peraksi Tollens (reduksi Ag+ menjadi Ag). Beberapa dari reaksi ini digunakan sebagai uji klinis unutk

mendeteksi gula dalam air seni yang menunjukkan penyakit diabetes (Pine et al. 1988) .

Sifat sebagai reduktor pada monosakarida dan beberapa disakarida disebabkan oleh adanya gugus aldehida atau keton bebas dalam molekul karbohidrat. Sifat ini dapat digunakan untuk keperluan identifikasi karbohidrat maupun analisis kuantitatif. Pereaksi Benedict berupa larutan yang mengandung kuprisulfat, natrium karbonat dan natrium sitrat. Glukosa dapat mereduksi ion Cu2+ menjadi Cu+ yang kemudian mengendap sebagai Cu2O. adanya natrium karbohidrat dan natrium sitrat membuat pereaksi Benedict bersifat basa lemah. Endapan yang terbentuk dapat bewarna hijau, kuning atau merah bata. Warna

endapan ini tergantung pada konsentrasi karbohidrat yang diperiksa (Poedjiadi 1994).

2.6.8 Peptida

Dua asam amino berikatan melalui suatu ikatan peptide (-CONH-) dengan melepas sebuah molekul air. Reaksi keseimbangan ini cenderung untuk berjalan ke arah hidrolisis daripada sintesis. Pembentukan ikatan tersebut memerlukan banyak energi, sedangkan untuk hidrolisis tidak memerlukan energi. Gugus karboksil suatu asam amino berkaitan dengan gugus amino dari molekul asam amino lain menghasilkan suatu dipeptida dengan melepaskan molekul air (Winarno 2008).

2.6.9 Asam amino

Bila suatu protein dihidrolisis dengan asam, alkali, atau enzim akan dihasilkan campuran asam-asam amino. Sebuah asam amino terdiri dari sebuah gugus amino, sebuah gugus karboksil, sebuah atom hydrogen dan gugus R yang terikat pada sebuah atom C yang dikenal sebagai karbon α, serta gugus R

merupakan rantai cabang. Semua asam amino berkonfigurasi α dan mempunyai

konfigurasi L kecuali glisin yang tidak mempunyai atom C asimetrik. Hanya asam amino L yang merupakan komponen protein (Winarno 2008).

Asam amino dalam kondisi netral (pH isolistrik, pI) berada dalam bentuk ion dipolar atau disebut juga ion zwitter. Pada asam amino yang dipolar, gugus amino mendapat tambahan sebuah proton dan gugus karboksil terdisosiasi. Derajat ionisasi dari asam amino sangat dipengaruhi oleh pH. Pada pH yang rendah misalnya pada pH 1.0 gugus karboksilatnya tidak terdisosiasi, sedang gugus aminonya menjadi ion. Pada pH tinggi misalnya pada pH 11.0 karboksilnya terdisosiasi sedang gugusan aminonya tidak (Winarno 1997).

Ninhidrin adalah pereaksi yang digunakan secara luas untuk mengukur asam amino secara kuantitatif. Pereaksi itu bereaksi dengan hampir semua asam amino, menghasilkan senyawa bewarna lembayung (prolina memberikan warna kuning) (Pine et al. 1988).

3 METODOLOGI 3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan dari bulan November 2009 sampai April 2010. Sampel diambil di Desa Gebang, kota Cirebon, Propinsi Jawa Barat. Proses preparasi sampel dan penghitungan rendemen dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, analisis aktivitas antioksidan, pengukuran kadar abu dan abu tidak larut asam dan fitokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Analisis kadar air, protein dan lemak dilaksanakan di Laboratorium Konservasi Satwa Langka dan Harapan, Pusat Antar Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor. Proses evaporasi ekstrak dilakukan di Laboratorium Penelitian 1, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Identifikasi keong dilakukan di laboratorium Biologi Mikro 1, Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan untuk penelitian ini adalah keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo). Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk analisis proksimat meliputi akuades, kjeltab jenis selenium, larutan H2SO4 p.a. pekat, asam borat (H3BO3) 2% yang mengandung indikator bromcherosol green-methyl red (1:2)berwarna merah muda, larutan HCl 0.1 N, pelarut lemak (n-heksana p.a), larutan HCl 10%, larutan AgNO3 0.10 N, dan akuades. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji aktivitas antioksidan, yaitu ekstrak keong ipong-ipong, kristal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, antioksidan sintetik BHT (Butylated Hydroxytoluena) sebagai pembanding dan es. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendroff (uji alkaloid), kloroform, anhidra asetat, asam sulfat pekat (uji steroid), serbuk magnesium, amil alkohol (uji flavonoid), air panas, larutan HCl 2 N (uji saponin), etanol 70%, larutan FeCl3 5% (uji fenol hidrokuinon), peraksi Molisch, asam sulfat pekat (uji Molisch), pereaksi Benedict (uji Benedict), pereaksi Biuret (uji Biuret), dan larutan Ninhidrin 0.1% (uji Ninhidrin). Alat-alat

yang diperlukan dalam penelitian ini meliputi pisau, sudip, cawan porselen, timbangan digital, aluminium foil, gegep, desikator, oven, kompor listrik, tanur pengabuan, kertas saring Whatman bebas abu dan bebas lemak, kapas bebas lemak, labu lemak, tabung Soxhlet, penangas air, labu Kjeldahl, destilator, labu Erlenmeyer, buret, pipet volumetrik, pipet mikro, gelas ukur, grinder,

homogenizer, sentrifuse, vacuum evaporator, corong terpisah, botol vial, gelas piala, tabung reaksi, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800, pipet tetes, tabung reaksi, vortex, sendok plastik dan gelas piala.

3.3. Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan, yaitu tahapan pengambilan sampel, tahapan perhitungan rendeman, tahap analisis kimia keong ipong-ipong berupa analisis proksimat (kadar air, lemak, protein, abu, dan abu tidak larut asam), tahap pembuatan ekstrak kasar keong ipong-ipong, uji kuantitatif aktivitas antioksidan dan uji fitokimia

3.3.1. Pengambilan dan preparasi bahan baku

Pengambilan sampel keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) dilakukan di pantai kota Cirebon, provinsi Jawa Barat . Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) pada subtrat lumpur yang ditempati keong tersebut. Keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) tersebut kemudian dimasukan dalam wadah berisi air laut perairan tempat hidupnya. Hal ini bertujuan untuk menjaga kelangsungan hidup keong ipong-ipong selama proses transportasi ke laboratorium karakteristik bahan baku di Institut Pertanian Bogor. Setelah sampel diperoleh, dilakukan penentuan ukuran dan berat rata-rata dari 30 ekor keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo) secara acak. Kemudian sampel dihitung rendemennya (cangkang dan daging) dengan rumus:

Daging-daging keong ipong-ipong yang telah dipisahkan dari cangkangnya, dibagi menjadi dua bagian. Bagian pertama merupakan daging dalam bentuk segar yang akan diuji kadar air, abu, lemak, protein, dan abu larut asam. Bagian kedua merupakan daging keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

dan jeroan yang akan dikeringkan dan nantinya akan diekstrak untuk diuji aktivitas antioksidannya dan fitokimia.

3.3.2. Analisis proksimat (AOAC 2005)

Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk memprediksi komposisi kimia suatu bahan, termasuk di dalamnya analisis kadar air, abu, lemak, protein dan abu larut asam.

1) Analisis kadar air (AOAC 2005)

Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Cawan tersebut ditimbang kembali hingga beratnya konstan, sebanyak 5 gram contoh dimasukkan ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105 oC selama 5 jam atau hingga beratnya konstan. Setelah selesai proses kemudian cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin dan selanjutnya ditimbang kembali.

Perhitungan kadar air :

% Kadar air = B - C x 100%

B - A

Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram)

B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (gram)

C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) 2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Cawan pengabuan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 105 oC, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar abu ditentukan dengan rumus:

% Kadar abu = C - A x 100% B - A

Keterangan : A = Berat cawan porselen kosong (gram) B = Berat cawan dengan sampel (gram)

C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (gram) 3) Analisis kadar protein (AOAC 1980)

Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 0,25 gram selenium dan 3 ml H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh.

Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut :

% N = (ml HCl – ml blanko) x N HCl x 14,007 x 100% Mg contoh x faktor koreksi alat *

*) Faktor koreksi alat = 2,5

% Kadar protein = % N x faktor konversi * *) Faktor Konversi = 6,25

4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)

Contoh seberat 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring pada kedua ujung bungkus ditutup dengan kapas bebas lemak dan selanjutnya dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian sampel yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak (benzena). Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu

lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).

Perhitungan kadar lemak daging keong ipong-ipong: % Kadar lemak = (W3- W2) x 100%

W3

Keterangan : W1 = Berat sampel (gram)

W2 = Berat labu lemak kosong (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)

5) Analisis Abu kadar abu tidak larut asam menurut SNI-01-3836-2000 (BSN 2000)

Larutkan abu bekas pengukuran kadar abu total dengan penembahan 25 ml HCl 10%. Didihkan selama 5 menit, saring larutan dengan kertas saring bebas abu dan cuci dengan air suling sampai bebas klorida. Kemudian keringkan kertas saring dalam pengering listrik (oven), setelah dikeringkan kertas saring dimasukkan di dalam cawan porselin yang sudah diketahui berat tetapnya kemudian abukan dalam tanur listrik pada suhu 600⁰C. Setelah dilakukan pengabuan sampel didinginkan di dalam desikator dan kemudian ditimbang beratnya dan diukur kadar abu tidak larut asam dengan rumus:

Kadar abu tidak larut asam = Berat abu (g) x 100% Berat sampel awal (g) 3.3.3. Analisis antioksidan dengan Metode DPPH 1) Ekstraksi bahan aktif (Quinn 1988)

Pada tahap ini ada beberapa langkah, yaitu persiapan sampel dan ekstraksi bahan aktif. Pada tahap persiapan sampel, daging keong ipong-ipong dan jeroan yang telah diambil dari perairan pantai kota Cirebon,segera dikeringkan dengan panas matahari selama 3 hari. Tujuan dari proses pengeringan ini adalah untuk mengurangi kadar air dalam bahan. Kadar air yang rendah menunjukkan bahwa air bebas dalam bahan berada dalam jumlah yang rendah, sehingga proses pembusukan, hidrolisis komponen bioaktif dan oksidasi dalam sampel selama dilakukan maserasi dapat dihindari. Apabila kadar air bebas dihilangkan, maka aw

akan turun hingga 0,80 (batas maksimal) sehingga pertumbuhan mikroba dapat dikurangi dan reaksi-reaksi kimia yang bersifat merusak, seperti hidrolisis atau oksidasi lemak dapat dihindari. Air tipe ini mudah diuapkan dan dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan mikroba dan media bagi reaksi-reaksi kimia (Winarno 2008).

Kadar air yang berkurang dalam sampel juga sangat berguna saat dilakukan proses evavorasi. Ketika proses ekstraksi dilakukan pada sampel basah, air akan bermigrasi dari bahan ke dalam lingkungan (pelarut) dalam jumlah yang cukup banyak. Air yang memiliki titik didih lebih tinggi dari pelarut, akan sangat sukar dan lama dipisahkan dari ekstrak dengan menggunakan pemanasan suhu rendah (sesuai dengan titik didih pelarut). Apabila pemanansan dilakukan dengan menggunakan suhu tinggi, yaitu suhu 100 ºC pada tekanan udara 1 atm, maka komponen bioaktif yang memiliki sifat antioksidan dikhawatirkan dapat rusak oleh panas. Sampel yang kering diduga akan menyumbangkan air dalam jumlah yang kecil pada larutan ekstrak.

Isi cangkang keong ipong-ipong (daging dan jeroan) yang telah kering tersebut kemudian dihaluskan dengan blender, sehingga didapat tekstur yang halus. Ukuran sampel yang lebih kecil (bubuk/tepung) diharapkan dapat memperluas permukaan bahan yang dapat berkontak langsung dengan pelarut, sehingga proses ekstraksi komponen bioaktif dapat berjalan dengan maksimal.

Tahap selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode ekstraksi bertingkat (Quinn 1988). Metode ini digunakan tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu kloroform p.a. (non polar), etil asetat p.a. (semi polar) dan metanol p.a (polar). Ketiga pelarut ini dipilih karena memiliki titik didih yang lebih rendah dari titik didih air, sehingga dapat mudah diuapkan saat proses vacuum evavorasi (500 mmHg, 50 ºC). pada tekanan udara 1 atm (760 mmHg), kloroform memiliki titik didih sebesar 61 ºC , metanol sebesar 65 ºC dan etil asetat 77 ºC. palarut etanol tidak dipilih untuk menggantikan pelarut metanol (polar) karena titik didihnya jauh lebih tinggi dibandingkan metanol, yaitu 78 ºC (Lehninger 1988).

Prabowo (2009) menyatakan, kekurangan dari proses ekstraksi bertingkat adalah rendemen ekstrak yang diperoleh lebih kecil dibandingkan dengan proses

ekstraksi tunggal. Proses ekstraksi bertingkat ini justru dipilih karena penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif yang terdapat dalam keong ipong-ipong berdasarkan tingkat kepolarannya. Ekstraksi bertingkat ini diharapkan dapat memisahkan komponen bioaktif dalam sampel yang sama berdasarkan tingkat kepolarannya, tanpa harus komponen bioaktif tersebut terlarut pada pelarut lain yang bukan merupakan pelarutnya. Hal ini diduga dapat terjadi pada proses ekstraksi tunggal menggunakan metanol. Metanol merupakan pelarut polar yang juga dapat melarutkan komponen non polar dan semi polar di dalamnya. Hal yang tidak diinginkan tersebut dapat dihindari dengan melakukan proses ekstraksi bertingkat yang diawali dengan ekstraksi menggunakan pelarut non polar (kloroform p.a) terlebih dahulu, dilanjutkan dengan pelarut semipolar (etil asetat p.a.) dan terakhir menggunakan pelarut polar (metanol p.a.).

Sampel sebanyak 25 g yang telah dihancurkan, dimaserasi dengan pelarut kloroform p.a. sebanyak 100 ml selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan orbital shaker 8 rpm. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga didapat filtrat dan residu. Residu yang dihasilkan selanjutnya dimaserasi dengan etil asetat p.a. 100 ml selama 48 jam dengan diberikan goyangan dengan orbital shaker 8 rpm, sedangkan filtrat ekstrak kloroform yang diperoleh dievavorasi hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evavorator pada suhu 50 ºC.

Hasil proses maserasi ke-2 selanjutnya disaring dengan kertas Whatman 42. Residu yang dihasilkan dilarutkan dengan metanol p.a. sebanyak 100 ml dan dimaserasi selama 48 jam dengan diberi goyangan menggunakan

orbital shaker 8 rpm. Filtrat ekstrak etil asetat yang diperoleh dievaporasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evavorator pada suhu 50 ºC.

Hasil maserasi ke-3 dengan pelarut metanol, disaring dengan kertas saring Whatman 42. Filtrat ekstrak metanol yang diperoleh dievavorasi sehingga semua pelarut terpisah dari ekstrak menggunakan rotary vacuum evavorator pada suhu 50 ºC, sedangkan residu yang tersisa dibuang. Proses ini akan menghasilkan

ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol yang kental. Proses ekstraksi bertingkat ini ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 7. Diagram Alir Proses Ekstraksi Daging keong ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

(Sumber: Quinn 1988)

2) Uji aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958)

Ekstrak kasar keong ipong-ipong dari hasil ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut kloroform p.a. (non polar), pelarut etil asetat p.a. (semi polar), dan pelarut metanol p.a. (polar), dilarutkan dalam metanol p.a. dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam

25 gr Sampel Maserasi dengan kloroform

selama 48 jam Penyaringan

Residu Maserasi dengan etil asetat selama 48 jam

Penyaringan

Evaporasi

Ekstrak kloroform

Maserasi dengan metanol selama 48 jam

Residu

Penyaringan

Residu

Filtrat

Filtrat _Evaporasi

Ekstrak etil asetat

Filtrat Evaporasi

pelarut metanol p.a. dengan konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari.

Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding BHT yang telah dibuat, masing-masing diambil 4.5 ml dan direaksikan dengan 500 µ l larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800

pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,5 ml pelarut metanol dengan 500 µ l larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Larutan blanko ini dibuat hanya satu kali ulangan saja. Setelah itu, aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding BHT dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan formulasi sebagai berikut:

% inhibisi = (A blanko – A sampel) x 100% A blanko

Nilai konsentrasi sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%) dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC50. Nilai IC50 menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel (ekstrak ataupun antioksidan pembanding BHT) yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50%.

3.3.4. Uji fitokimia (Harborne 1984)

Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen-komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar keong ipong-ipong yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, uji

steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret dan Ninhidrin. Metode uji ini berdasarkan Harborne (1984).

a. Alkaloid

Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff.

Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl2 dengan 0,5 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml

dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 gram iodin dan 2 gram kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi ini berwarna jingga.

b. Steroid/ triterpenoid

Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Lalu, ke dalamnya ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.

c. Flavonoid

Sejumlah sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.

d. Saponin (uji busa)

Saponin dapat dideteksi denan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.

e. Fenol Hidrokuinon (pereaksi FeCl3)

Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.

f. Uji Molisch

Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.

g. Uji Benedict

Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Terbentuknya warna hijau, kuning, atau endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.

h. Uji Biuret

Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Terbentuknya larutan berwarna ungu menunjukkan hasil uji positif adanya peptida.

i. Uji Ninhidrin

Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan Ninhidrin 0,1 %. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Terjadinya larutan berwarna biru menunjukkan reaksi positif terhadap adanya asam amino.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Keong Ipong-ipong (Fasciolaria salmo)

Bentuk morfologi keong ipong-ipong yang diambil di perairan Desa Gebang, Cirebon, Jawa Barat dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Keong ipong-ipong yang diambil di perairan Desa Gebang Cirebon Sampel keong ipong-ipong yang didapat, dilakukan preparasi untuk mengeluarkan isi cangkang (daging dan jeroan), serta memisahkan dari operkulum yang masih menempel. Bentuk cangkang, isi cangkang (daging dan jeroan) kemudian diamati karakteristik fisiknya. Hasil pengamatan karakteristik fisik cangkang, operkulum dan isi cangkang keong ipong-ipong dapat dilihat pada Tabel 1. Bentuk cangkang dapat dilihat pada Lampiran 1.

Tabel 1. Hasil pengamatan karakteristik fisik cangkang, isi cangkang dan operkulum keong ipong-ipong

Karakteristik Fisik Cangkang Isi Cangkang Operkulum

Warna

Coklat kekuningan, berbulu halus

Daging: krem Jeroan : hijau, hitam, putih (Saluran

dan kelenjar pencernaan). Putih krem

(gonad)

Coklat cerah

Tekstur Keras

Daging: kenyal Jeroan: lunak

dan mudah hancur bila ditekan.

Tipis, lembut dan mudah dipatahkan.

Keong ipong-ipong yang digunakan dalam penelitian ini memiliki warna cangkang coklat kekuningan dan terdapat bulu-bulu halus. Komponen penyusun cangkang keong ipong adalah kalsium karbonat. Isi cangkang keong ipong-ipong dibagi menjadi 2 bagian, yaitu bagian daging dan jeroan. Bagian dari daging bewarna krem dan teksturnya kenyal, sedangkan bagian jeroannya yaitu ada yang bewarna hijau, hitam, putih yang merupakan bagian saluran dan kelenjar pencernaan, sedangkan yang bewarna putih krem merupakan bagian gonad. Bagian jeroan ini bersifat lunak dan mudah hancur bila ditekan. Operkulum keong-ipong bewarna coklat cerah, tipis, lembut dan mudah dipatahkan.

Proses karakteristik ini dilakukan guna mengetahui sifat dari bahan baku yang digunakan. Sifat bahan baku ini tidak terbatas pada sifat fisik saja, tetapi juga sifat kimia. Hal ini dikarenakan sifat fisik maupun kimia dari bahan baku yang digunakan berbeda antara yang satu dengan yang lain. Karakteristik fisik keong ipong-ipong yang digunakan dalam penelitian ini telah diamati dan dijelaskan di atas, sehingga perlu dilakukan pengukuran rendemen dan analisis kandungan gizi keong ipong-ipong dengan uji proksimat.

4.1.1 Rendemen

Rendemen adalah persentase perbandingan antara berat bagian bahan yang dapat dimanfaatkan dengan berat total bahan. Nilai rendeman digunakan untuk mengetahui nilai ekonomis suatu produk atau bahan. Semakin tinggi nilai rendemennya, maka semakin tinggi pula nilai ekonomisnya sehingga pemanfaatannya dapat menjadi lebih efektif.

Perhitungan rendemen cangkang, isi cangkang (daging dan jeroan) dapat dilihat di lampiran 2. Nilai rendemen cangkang dan isi cangkang (daging dan jeroan) keong ipong-ipong dapat dilihat pada Gambar 9.

Gambar 9. Rendemen cangkang dan isi cangkang (daging dan jeroan) keong ipong-ipong

Rendemen cangkang lebih dari setengah berat keong ipong-ipong utuh, yaitu sebesar 69,69%. Hal ini menunjukkan bahwa cangkang keong ipong-ipong berpotensial untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai sumber kalsium. Suwignyo et al. (2005) menyatakan cangkang gastropoda tersusun atas kalsium karbonat. Lapisan kalsium karbonat yang terdapat pada cangkang terdiri dari 3 lapisan antara lain perismatik, lamella dan nacre.

Rendemen isi cangkang (daging dan jeroan) sebesar 30% yang terdiri dari 22,08% dari daging dan 8,22% dari jeroan. Selain cangkang, isi cangkang keong ipong-ipong juga berpotensi untuk dimanfaatkan dengan jumlahnya yang berkisar 30% tersebut. Pemanfaatannya bisa berupa dijadikan lauk pauk sebagai sumber protein hewani dan asam amino. Protein dan asam-asam amino berfungsi sebagai zat pembangun pada tubuh manusia serta membantu dalam proses metabolisme tubuh manusia (Winarno 2008).

Hasil perhitungan pada Lampiran 2 menunjukkan bahwa cangkang, isi cangkang (daging dan jeroan) memiliki rendemen masing-masing sebesar 69,69%, 22,08% dan 8,22%. Apabila ketiga nilai rendemen tersebut dijumlahkan, maka jumlahnya tidak mencapai 100%. Hal ini diduga sisa berat yang hilang selama proses preparasi merupakan berat air yang terkurung dalam cangkang dan tidak terikat di dalam jaringan. Air ini terbuang ketika isi cangkang dikeluarkan dan ditiriskan terlebih dahulu sebelum ditimbang. Persentasi air yang hilang ini sekitar 0,01%. Air ini terperangkap dalam cangkang saat operkulum menutup rapat lubang aperture.

4.1.2 Komposisi kimia

Kandungan gizi pada isi cangkang keong ipong-ipong dapat diketahui dengan melakukan analisis proksimat. Analisis proksimat dilakukan untuk memperoleh data tentang komposisi kimia dalam suatu bahan. Komposisi kimia tersebut diantaranya kandungan air, protein, lemak, abu, abu tidak larut asam dan karbohidrat. Kadar karbohidrat dalam keong ipong-ipong diperoleh melalui perhitungan by difference. Selain analisis proksimat (kadar air, lemak, protein, abu dan karbohidrat), pengujian abu tidak larut asam juga dilakukan. Pengujian abu tidak larut asam pada keong ipong-ipong dilandasi karena keong ipong-ipong merupakan golongan Gastropoda yang hidup di perairan laut berlumpur dan

menempel pada substrat. Keong ipong-ipong di duga mengandung abu tidak larut asam yang berasal dari mineral-mineral dalam lumpur yang ikut masuk ke dalam saluran pencernaannya, ketika keong ipong-ipong sedang melakukan aktivitas makan. Hasil analisis proksimat isi cangkang keong ipong-ipong dapat dilihat pada Gambar 10 dan cara perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 3.

Gambar 10. Hasil uji proksimat keong ipong-ipong (n=2) 1) Kadar air

Kadar air merupakan jumlah air yang terkandung dalam bahan pangan. Kadar air merupakan karakteristik yang sangat penting pada bahan pangan, karena air dapat mempengaruhi penampakan, tekstur, dan cita rasa pada bahan pangan. Kadar air dalam bahan pangan ikut menentukan kesegaran dan daya awet bahan pangan tersebut, kadar air yang tinggi mengakibatkan mudahnya bakteri, kapang dan khamir untuk berkembang biak sehingga akan terjadi perubahan pada bahan pangan yang dapat mempercepat pembusukan (Winarno 2008). Hasil pengukuran kadar air menunjukkan bahwa keong ipong-ipong memiliki kadar air yang cukup tinggi, yaitu sebesar 73,07%.

Prinsip análisis kadar air yang dilakukan dalam penelitian ini adalah megukur berat air yang teruapkan dan tidak terikat kuat dalam jaringan bahan dengan bantuan panas. Air yang teruapkan ini merupakan air tipe III (Winarno 2008). Air tipe III ini biasa disebut air bebas dan merupakan air yang hanya terikat secara fisik dalam jaringan matriks bahan seperti membran, kapiler, serat dan lain sebagainya. Air ini dapat dimanfaatkan unutk pertumbuhan mikorba dan media bagi reaksi-reaksi kimiawi (Winarno 2008). Tingginya air tipe III ini pada keong ipong-ipong, dapat menyebabkan keong ipong-ipong mudah sekali mengalami kerusakan (highly perishable) apabila tidak ditangani dengan benar. Hal ini karena air tipe ini dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan mikroba dan juga reaksi kimiawi dalam jaringan yang diduga melibatkan enzim, salah satunya enzim protease seperti katepsin.

2) Kadar lemak

Analisis kadar lemak bertujuan untuk mengetahui kandungan lemak yang terkandung pada isi cangkang keong ipong-ipong. Lemak merupakan komponen yang larut dalam pelarut organik seperti heksan, eter dan kloroform. Menurut Poedjiadi (1994), lemak hewan umumnya berupa padatan pada suhu ruang, sedangkan lemak yang berasal dari tumbuhan berupa zat cair. Lemak dapat dikatakan sebagai sumber energi yang lebih efektif dibandingkan dengan karbohidrat dan protein. Hal ini dikarenakan 1 gram lemak dapat menghasilkan 9 kkal, dimana nilai tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan energi yang dihasilkan oleh 1 gram protein dan karbohidrat, yaitu 4 kkal. Lemak juga dapat digunakan sebagai sumber asam lemak esensial dan vitamin (A, D, E dan K) (Winarno 2008; Belitz et al. 2009).

Hasil pengujian menunjukkan bahwa keong ipong-ipong mengandung lemak dalam kadar yang cukup rendah, yaitu hanya sebesar 0,57%. kadar lemak yang rendah dapat disebabkan karena kandungan air keong ipong-ipong sangat tinggi, sehingga secara proporsional persentase kadar lemak akan turun secara drastis. Hal ini sesuai dengan pendapat yang menyatakan bahwa kadar air umumnya berhubungan terbalik dengan kadar lemak (Yunizal et al. 1998). Hubungan tersebut mengakibatkan semakin rendahnya kadar lemak, apabila kadar air yang terkandung di dalam bahan cukup tinggi.

Kandungan lemak keong ipong-ipong ini lebih rendah daripada kandungan lemak pada daging keong air laut lainnya dari Genus Cerithidea, yaitu sebesar 2,55% (Prabowo 2009). Perbedaan ini dapat terjadi karena pengaruh beberapa faktor, yaitu umur, hábitat, ukuran dan tingkat kematangan gonad.

3) Protein

Pengukuran protein pada bahan pangan digunakan untuk mengetahui kemampuan bahan pangan sebagai sumber protein atau tidak. Protein merupakan makromolekul yang terbentuk dari asam-asam amino yang berikatan peptida. Protein berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh, serta berperan sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein merupakan sumber asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan N yang tidak dimiliki oleh lemak ataupun karbohidrat. Molekul protein juga mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno 2008).

Protein merupakan komponen terbesar setelah air pada sebagian besar jaringan tubuh (Winarno 2008). Hal ini terbukti dari hasi análisis proksimat keong ipong yang disajikan pada Gambar 10. Nilai kadar protein keong ipong-ipong merupakan nilai terbesar kedua setelah air. Komponen lemak, abu, abu tidak larut asam dan karbohidrat memiliki jumlah yang lebih kecil dibandingkan dengan protein.

Hasil pengujian kadar protein menunjukkan bahwa keong ipong-pong memiliki protein dalam jumlah yang tinggi, yaitu sebesar 18,28%. jumlah ini jauh lebih tinggi jika dibandingkan dengan keong air laut lainnya seperti dari Genus

Cerithidea yang mengandung protein sebesar 9,85% (Prabowo 2009). Variasi ini dapat disebabkan oleh bebrapa faktor, yaitu hábitat, umur, makanan yang dicerna, laju metabolisme, laju pergerakan dan tingkat kematangan gonad.

4) Kadar abu

Kadar abu merupakan campuran dari komponen anorganik atau mineral yang terdapat dalam suatu bahan pangan. Bahan pangan terdiri dari 96% bahan organik dan air, sedangkan sisanya merupakan unsur-unsur mineral. Unsur juga dikenal sebagi zat organik atau kadar abu. Dalam proses pembakaran, bahan-bahan organik akan terbakar tetapi komponen anorganiknya tidak, karena itulah disebut sebagai kadar abu (Winarno 2008).

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan stock dan pengencerannya a. DPPH 0,001 M sebanyak 50 ml (Mr = 394 g/mol)

Konsentrasi = 0,001 M = berat DPPH =

DPPH sebanyak 0,0197 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml. b. Standar BHT 250 ppm sebanyak 50 ml

Stok BHT 250 ppm =

= 12,5 mg = 0,0125 g

BHT sebanyak 0,0125 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml.

 BHT 2 ppm = = =

0,08 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 BHT 4 ppm = = =

0,16 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 BHT 6 ppm = = =

0,24 ml BHT 250 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 BHT 8 ppm = = =

c. Larutan ekstrak 1000 ppm sebanyak 50 ml Stok ekstrak 1000 ppm =

= 50 mg = 0,05 g

Ekstrak sebanyak 0,05 g dilarutkan dalam metanol p.a. hingga 50 ml.

 Ekstrak 200 ppm = = =

2 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 Ekstrak 400 ppm = = =

4 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 Ekstrak 600 ppm = = =

6 ml ekstrak 1000 ppm ditambah metanol p.a. hingga 10 ml.

 Ekstrak 800 ppm = = =

Lampiran 6. Perubahan warna yang mengindikasikan reaksi peredaman DPPH

.

BHT + DPPH 1 mM Ekstrak Kloroform + DPPH 1 mM

Ekstrak Etil Asetat + DPPH 1 mM Ekstrak Metanol + DPPH 1 mM

Lampiran 7. Perhitungan persen inhibisi dan IC50 a. Persen inhibisi dan IC50 pada BHT

Sampel Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi

Persamaan regresi

linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

4,91 BHT

2 0,920 12,55

y = 14,32x – 20,35

4 0,803 23,67

6 0,217 79,37

8 0,111 89,45

1) Persen inhibisi BHT 2 ppm = BHT 4 ppm = BHT 6 ppm = BHT 8 ppm =

2) IC50

y = 14,32x – 20,34 50 = 14,32x – 20,34 70,34 = 14,32x

x = 4,91 ppm

IC50 untuk BHT adalah 4,91 ppm.

b. Persen inhibisi dan IC50 pada ekstrak daging dengan pelarut kloroform - Daging

Sampel Daging

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi Persamaan regresi linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

9210 Kloroform

200 0.811 22.90

y = 0.003x + 22.37

400 0.798 24.14

600 0.793 24.61

800 0.787 25.19

Sampel Daging

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi

Persamaan regresi

linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

6825 Etil

Asetat

200 0.801 23.85

y = 0.004x + 22.70

400 0.797 24.23

600 0.795 24.42

800 0.773 26.52

- Jeroan Sampel

Daging

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi Persamaan regresi linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

1513.8 metanol

200 0.695 33.93

y = 0.013x + 30.32

400 0.688 34.60

600 0.652 38.02

800 0.612 41.82

Sampel Jeroan

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi Persamaan regresi linear IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

2825 Kloroform

200 0.910 13.49

y = 0.014x + 10.45

400 0.891 15.30

600 0.829 21.19

Lampiran 8. Gambar hasil uji fitokimia ekstrak daging dan jeroan keong ipong-ipong

a. Ekstrak kloroform

Ekstrak Daging Ekstrak Jeroan

b. Ekstrak etil asetat

Ekstrak Daging Ekstrak Jeroan Sampel

Jeroan

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi

Persamaan regresi linear

IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

4600 Etil asetat

200 0.890 15.39

y = 0.008x + 13.20

400 0.885 15.87

600 0.863 17.96

800 0.839 20.24

Sampel Jeroan

Konsentrasi

(ppm) Absorbansi

% Inhibisi

Persamaan regresi linear

IC50 (ppm)

Blanko 0 1,052

994.47 Metanol

200 0.842 19.96

y = 0.038x + 12.21

400 0.756 28.13

600 0.696 33.84

c. Ekstrak methanol

Ekstrak Daging Ekstrak Jeroan

Lampiran 9. Gambar-gambar selama proses ekstraksi

Proses pengadukan dengan orbital shaker Proses filtrasi hasil maserasi