2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan
Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat
tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
C.
4 .
Preparasi fraksi protein dari daun mimba
Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir kemudian
dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar
natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin dengan penambahan es di sekitarnya. Bahan diperas dan disaring dengan kain
monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh
merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker gelas dan diukur volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya dengan
menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 10. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan teratur dengan
magnetic stirrer pada suhu dingin semalaman, dilanjutkan dengan sentrifugasi ultra PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan kecepatan 10000 rpm 4ºC selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin
larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran
dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit
khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis
dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan
kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan
konsentrasi amonium sulfat 10 jenuh. Supernatan 1, 2 dan 3 ditampung secara bertahap kemudian ditambah
dengan ammonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 20, 30 dan 40 dengan menggunakan langkah yang sama dengan konsentrasi 10 jenuh.
5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV
Kategori