Jenis dan Rancangan Penelitian Analisis Hasil

12

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP 10 , FP 20 , FP 30 , dan FP 40 terhadap kultur sel Myeloma termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel penelitian dan Definisi operasional 1.

Variabel bebas Kadar fraksi protein daun mimba.

2. Variabel tergantung

Persentase kematian sel Myeloma dan sel Vero.

3. Variabel pengacau terkendali

1 pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu 4 o C. 2 medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640- serum untuk sel Myeloma dan M199 untuk sel Vero. 3 tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kematian alami sel Myeloma dan sel Vero dan kandungan kimia tanaman mimba.

5. Definisi operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi protein daun mimba terhadap sel Myeloma dan sel vero. b. Fraksi protein ialah fraksi protein daun mimba yang diperoleh dari hasil pengendapan dengan garam amonium sulfat pada konsentrasi 10, 20, 30 dan 40, dinyatakan dalam µgml. c. LC 50 ialah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50 sel Myeloma atau 50 sel Vero dan dinyatakan dalam µgml.

C. Alat dan Bahan 1.

Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, stamper, mortir, timbangan analitik AND ER-400 H, alumunium foil, magnetic stirrer, tabung conical, autoklaf, tissue culture flask, swing rotor sentrifuge PLC, inkubator Nuaire, mikropipet, membran dialisis Sigma, lemari pendingin, cell counter Nunc, 96-well plate Nunc, spektrofotometer UV Cecil CE-292, ELISA reader SLT 340 ATC, laminar air flow Nuaire, mikroskop Olympus IMT-2, haemocytometer Nebauer, kain monel, tissue, glove, masker.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah a. daun mimba segar b. kultur sel Myeloma yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. c. kultur sel Vero yang diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. d. pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi fraksi protein daun mimba 1 larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 Merck 2 larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl Merck 3 amonium sulfat p.a. Merck e. Pereaksi-pereaksi untuk uji sitotoksisitas 1 media pencuci: RPMI 1640 Sigma, natrium bikarbonat, Hepes 2 media penumbuh: RPMI 1640, M199, FBS Foetal Bovine Serum 10, Penisilin-Streptomisin 2 Gibco, dan Fungison 0,5 Gibco. 3 reagen Stopper : SDS sodium dodeksil sulfat dalam HCl 0,01 N Merck 4 MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide Sigma 5 bahan untuk isolasi sel Vero : tripsin 0,5

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi

tanaman Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku Backer dan Backuizen van den Brink, 1965. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006.

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 C. 4 . Preparasi fraksi protein dari daun mimba Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin dengan penambahan es di sekitarnya. Bahan diperas dan disaring dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker gelas dan diukur volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 10. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan teratur dengan magnetic stirrer pada suhu dingin semalaman, dilanjutkan dengan sentrifugasi ultra PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dengan kecepatan 10000 rpm 4ºC selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan konsentrasi amonium sulfat 10 jenuh. Supernatan 1, 2 dan 3 ditampung secara bertahap kemudian ditambah dengan ammonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 20, 30 dan 40 dengan menggunakan langkah yang sama dengan konsentrasi 10 jenuh.

5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV

Sampel fraksi protein daun mimba 10, 20, 30 dan 40, masing- masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5 mM. Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang 260 nm. Perbandingan antar serapan pada 280 nm dan 260 nm merupakan rasio serapan R 280260 , dan digunakan untuk menghitung faktor koreksi dengan cara ekstrapolasi terhadap tabel kadar protein Layne cit Candra, 2006. Selanjutnya, kadar protein dihitung dari perkalian antara serapan pada 280 nm, faktor koreksi dan faktor pengenceran.

6. Propagasi dan panen sel Myeloma

a. Propagasi sel Myeloma Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37 o C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel Myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 o C dengan aliran 5 CO 2 . Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006. b. Panen sel Myeloma Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10 4 100 l dan siap dipakai untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006.

7. Propagasi dan panen sel Vero

a. Propagasi sel Vero Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37 o C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel normal dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 o C dengan aliran 5 CO 2 . Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006. b. Panen sel Vero Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, sel dicuci dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask, diberi tripsin 2,5 sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10 4 100 l dan siap dipakai untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006.

8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 l suspensi sel Myeloma dengan kepadatan 2,5x10 4 100 l dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi 100 l fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µgml pada sumuran A 1 , B 1 dan C 1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A 2 , B 2 dan C 2 di kolom 2 ditambahkan 100 l suspensi sel Myeloma pada sumuran yang telah berisi 100 l fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO 2 Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989. Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 l MTT 2,5 gml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37 o C, dalam inkubator dengan aliran CO 2 5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 l reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero

Untuk uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas fraksi protein pada sel Myeloma, tetapi pada sel Vero menggunakan medium M199.

E. Analisis Hasil

Pada metode MTT ini, serapan terbaca menunjukkan jumlah sel yang hidup dan hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang dihitung menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan persamaan berikut: Kematian sel = 100 x A C B A − − Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin, 1982 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Untuk menghitung harga LC 50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan analisis probit sedangkan untuk membandingkan LC 50 anatara sel Myeloma dan sel Vero menggunakan uji T-indepndent. 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sterilisasi alat merupakan langkah pertama sebelum dilaksanakannya penelitian. Sterilisasi alat dan bahan ini dilakukan untuk menghilangkan kontaminan atau mikroorganisme yang mungkin ada dialat atau bahan yang akan digunakan, sehingga tidak menggangu jalannya penelitian. Sterilisasi dilakukan selama kurang lebih 20 menit dengan suhu 121 C menggunakan autoklaf. Prinsip kerja autoklaf adalah dengan menaikkan tekanan untuk mendapatkan suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas Ansel, 1989. Uap air panas yang dihasilkan akan masuk kedalam mikroorganisme dan mematikannya dengan mekanisme denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari mikroorganisme tersebut. Sterilisasi medium digunakan membran filter. Dilakukan penyaringan untuk sterilisasi medium ini karena bahan-bahan tersebut dapat rusak dengan adanya panas. Penyaringan bertujuan agar pengotor akan tertahan pada memban filter sehingga cairan yang telah melewati membran akan bebas dari mikroorganisme.

B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba

Sampel yang digunakan untuk penelitian ini adalah fraksi protein daun mimba. Daun mimba yang digunakan diperoleh dari tanaman Azadirachta indica A. Juss yang terdapat didaerah jalan Kaliurang pada bulan Agustus 2006. Daun mimba segar dipetik dan dicuci bersih dengan air mengalir. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan berbagai macam pengotor yang kemungkinan besar menempel pada daun. Daun kemudian dimasukkan kedalam freezer untuk membekukan daun