22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi alat merupakan langkah pertama sebelum dilaksanakannya penelitian. Sterilisasi alat dan bahan ini dilakukan untuk menghilangkan kontaminan
atau mikroorganisme yang mungkin ada dialat atau bahan yang akan digunakan, sehingga tidak menggangu jalannya penelitian. Sterilisasi dilakukan selama kurang
lebih 20 menit dengan suhu 121 C menggunakan autoklaf. Prinsip kerja autoklaf
adalah dengan menaikkan tekanan untuk mendapatkan suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas Ansel, 1989. Uap air panas yang dihasilkan akan masuk
kedalam mikroorganisme dan mematikannya dengan mekanisme denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari mikroorganisme tersebut.
Sterilisasi medium digunakan membran filter. Dilakukan penyaringan untuk sterilisasi medium ini karena bahan-bahan tersebut dapat rusak dengan adanya panas.
Penyaringan bertujuan agar pengotor akan tertahan pada memban filter sehingga cairan yang telah melewati membran akan bebas dari mikroorganisme.
B. Preparasi Sampel Fraksi Protein Daun Mimba
Sampel yang digunakan untuk penelitian ini adalah fraksi protein daun mimba. Daun mimba yang digunakan diperoleh dari tanaman Azadirachta indica A.
Juss yang terdapat didaerah jalan Kaliurang pada bulan Agustus 2006. Daun mimba segar dipetik dan dicuci bersih dengan air mengalir. Hal ini bertujuan untuk
menghilangkan berbagai macam pengotor yang kemungkinan besar menempel pada daun. Daun kemudian dimasukkan kedalam freezer untuk membekukan daun
sehingga daun lebih mudah ditumbuk. Semua perlakuan protein dilakukan secara steril pada suhu dingin 4ºC untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolitik
yang dapat merusak protein. Fraksi protein ekstrak gubal diperoleh dengan penambahan sejumlah larutan dapar Natrium Phospat 5mM pH 7,2 yang
mengandung 0,14M NaCl pada daun yang ditumbuk halus. Larutan dapar berfungsi untuk memudahkan protein terekstraksi dari selnya yang terdapat pada daun, dengan
pH 7,2 ditujukan untuk menciptakan kondisi isotonis dengan cairan didalam sel tumbuhan. Dengan adanya NaCl, protein akan berada dalam keadaan terlarut dan
stabil didalam dapar. Bahan diperas dan cairan yang diperoleh disentrifuse selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh sebanyak 500ml merupakan ekstrak gubal dari
daun mimba. Pembuatan fraksi protein dalam penelitian ini menggunakan metode salting
out. Adanya amonium sulfat pada konsentrasi tertentu dalam larutan akan mengurangi kelarutan protein. Ion anorganik dari molekul amonium sulfat akan
bersaing dengan molekul protein yang mengikat air karena amonium sulfat bersifat lebih polar dibandingkan dengan protein maka air akan lebih banyak terikat pada
amonium sulfat sehingga terjadi penurunan kelarutan protein dan menyebabkan protein terendapkan. Maka pada proses fraksinasi, protein nonpolar akan mengendap
terlebih dahulu diikuti pengendapan protein yang bersifat polar dengan derajat kejenuhan tertentu. Oleh karena itu, protein yang terkandung pada masing-masing FP
tidak sama. Pengendapan protein ini dilakukan secara bertingkat yaitu dengan derajat
kejenuhan 10, 20, 30 dan 40. Hal ini bertujuan agar diperoleh pemisahan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
protein dalam fraksi-fraksi tertentu. Penambahan amoium sulfat untuk masing- masing fraksi 10, 20, 30 dan 40 adalah 27.45gram, 27.48gram, 28.35gram
dan 29.29gram. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk agar pengendapan berlangsung dengan sempurna.
Sampel fraksi-fraksi protein yang diperoleh ini berwarna hijau kecoklatan dan disimpan dalam suhu dingin. Proses preparasi sampel fraksi protein ini dilakukan
dalam suhu dingin untuk menjaga agar tidak terjadi denaturasi protein dan penguraian protein karena protein dapat rusak atau terurai pada suhu tinggi atau pH
yang ekstrim. Pemurnian fraksi protein dalam penelitian ini menggunakan cara dialisis.
Dialisis ini berguna untuk menghilangkan amonium sulfat yang mungkin terikat pada protein yang terendapkan. Dialisis didasarkan pada perbedaan gradien konsentrasi
yang besar didalam dan diluar permukaan tubing dialisis sehingga memungkinkan terjadinya mekanisme difusi pasif. Konsentrasi amonium sulfat pada tubing dialisis
lebih tinggi dibandingkan diluar tubing dialisis, sehingga mengakibatkan amonium sulfat akan keluar dari dalam tubing dialisis dengan mekanisme difusi pasif. Selain
adanya gradien konsentrasi yang besar, tubing dialisis bersifat semipermeabel, memiliki pori yang hanya mengeluarkan partikel-partikel berukuran sekitar 15000-
20000 Dalton, sehingga amonium sulfat yang berukuran lebih kecil dari protein akan keluar dari dalam tubing dialisis sedangkan protein yang merupakan makromolekul
akan tetap tinggal didalam tubing dialisis. Keempat fraksi protein dimasukkan tubing dialisis dan direndam dalam
larutan dapar Natrium fosfat 5mM pH7,2 dibeker gelas sambil diaduk. Pengadukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dengan stirer ini untuk mencegah terjadinya kejenuhan yang tidak merata pada larutan dapar Natrium fosfat 5mM pH7,2 yang berada diluar tubing dialisis sehingga
dapat mengakibatkan proses dialisis berjalan kurang sempurna. Dilakukan penggantian dapar setelah 5jam. Hal ini bertujuan agar amonium sulfat yang keluar
dari tubing dialisis tidak terlalu jenuh sehingga perbedaan gradien konsentrasi amonium sulfat yang berada diluar maupun didalam tubing dialisis tetap besar dan
mekanisme difusi pasif dapat terus berjalan.
C. Pengukuran Konsentrasi Fraksi Protein Secara Spektrofotometer UV
Kategori