dengan kecepatan 10000 rpm 4ºC selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin
larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran
dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit
khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis
dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan
kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan
konsentrasi amonium sulfat 10 jenuh. Supernatan 1, 2 dan 3 ditampung secara bertahap kemudian ditambah
dengan ammonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 20, 30 dan 40 dengan menggunakan langkah yang sama dengan konsentrasi 10 jenuh.
5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV
Sampel fraksi protein daun mimba 10, 20, 30 dan 40, masing- masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl
larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5 mM.
Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang 260 nm.
Perbandingan antar serapan pada 280 nm dan 260 nm merupakan rasio serapan R
280260
, dan digunakan untuk menghitung faktor koreksi dengan cara ekstrapolasi terhadap tabel kadar protein Layne cit Candra, 2006. Selanjutnya, kadar protein
dihitung dari perkalian antara serapan pada 280 nm, faktor koreksi dan faktor pengenceran.
6. Propagasi dan panen sel Myeloma
a. Propagasi sel
Myeloma Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
penangas air 37
o
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel Myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi
medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan
perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium
penumbuh yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan
jumlahnya cukup untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006. b. Panen
sel Myeloma
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari
dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang
dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah
medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 l dan siap dipakai untuk penelitian Freshney cit Candra, 2006.
7. Propagasi dan panen sel Vero
