Reverse Transcription Reverse transcription adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA

Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses spanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 7°C setelah semalaman. Hasil PCR dapat diidentifikasikan dengan menggunakan agarose gel electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agar agarose dan kemudian menghubungkan arus listrik pada agar terrsebut. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui agar menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu “ tangga DNA” yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam agar.

II.5.4. Reverse Transcription Reverse transcription adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA

komlementnya. Proses ini membutuhkan suatu enzim yang disebut : reverse transcriptase, yang diambil dari suatu retrovirus seperti : AMV Avian Myeloblastosis Virus. Enzim yang biasanya secara bersama berhubungan dengan enzim reverse transciptase adalah enzim RNA-dependent DNA polymerase dan enzim DNA-dependent DNA polrmerase, yang bekerja sama membentuk transcriptase dengan arah yang berlawanan dengan arah stndar. Reverse transciptase adalh enzim yang dihasilkan oleh semua retrovirus untk mentranskrip informasi genetik virus dari RNA menjadi DNA, sehingga dapat berintegrasi ked alam genom host. Sopian, 2006 Universitas Sumatera Utara Dalam penelitian, reverse transcriptase menyebabkan data yang dikode pada rantai RNA dapat diubah menjadi bentuk DNA dan digunakan dalam PCR, sebab PCR tidak dapat mereplikasi molekul RNA secara langsung. Kombinasi proses reverse transcriptase dan PCR disebut RT-PCR Sudjadi,2008. Universitas Sumatera Utara BAB ІІІ METODE PENELITIAN III.1. Rancangan Penelitian Rancangan penelitian adalah observasional dengan pendekatan potong lintang cross sectional. III.2. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di instalasi Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai dengan bulan Januari 2009. III.3. Bahan dan Cara Kerja Bahan penelitian adalah serum penderita Demam DengueDemam Berdarah. Dengue yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik RS. HAM, Rumah Sakit DR. pringadi, dan Rumah Sakit Herna di kota Medan. Darah penderita diambil dengan menggunakan semprit syringe 3 ml. pengambilan sampel serum penderita DDDBD dengan gejala klinis lima hari pertama demam Singh K et al,2006 dan konfirmasi diagnosi DDDBD sesuai dengan criteria WHO. Pada penelitian ini, digunakan specimen darah akut. Setelah specimen diambil secara asepsis dengan menggunakan semprit, kemudian specimen disimpan dan dikirim dalam keadaan beku dry ice. Untuk mendapatkan serum, darah diputar 1500-2000 rpm selama 10-15 menit Wuryadi, 2004 Setelah itu data masing-masin Universitas Sumatera Utara sampel dimasukkan dalam lembar check list yang berisi mengenai informasi demografi pasien seperti nama, umur, jenis kelamin, alamat, dan pekerjaan, serta hasil pemeriksaan laboratorium. Untuk penelitian ini digunakan seratus sample serum penderita. n ≥ Z 2 0,5- α2 .ρq e 2 n = jumlah sampel Z = nilai nol dari table Z yang besarnya tergantung dari nilai α yang ditentukan untuk α = 0,05; Zc = 1,96 p = proporsi penderita DDDBD di Sumatera Utara = 0,32 q = 1-p e = tingkat ketepatan n = 85 Jadi, sampel minimal yang dibutuhkan adalah sebanyak 85 buah. Universitas Sumatera Utara III.3.1. Kerangka Operasional Pasien Kriteria + Kriteria - Data Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab Serum Penderita 0,5 cc Ekstraksi RT-PCR menggunakan primers universal dan TS1 ANALISIS Elekroforesis Gel Imanging visualisasi Tiep Virus Dengue III.3.2. Ekstraksi RNA Virus RNA diestrak 200µl aliquost yang berasal dari supernatan sel yang terinfeksi dengan menggunakan QIA αmp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen dengan mengikuti protokolnya. Untuk memeriksa sampel, diperlukan 140µl homogenate dari setiap sample. Untuk kontrol positif digunakan kultur sel yang mengandunng DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4 dalam jumlah volume yang sama. Untuk kontrol sel tanpa virus Dengue. Ш.3.2.A. Peralatan a. QIAamp MinElute Virus Spint Kit, terdiri dari: a QIAamp MinElute Columns b Collection Tubes Universitas Sumatera Utara c Buffer AL d Buffer AW1 concentrate e Buffer AW2 concentrate f Buffer AVE g Protease Resuspension Buffer h Carrier RNA i QIAGEN®Protease b. Pipet tips 25µl kuning c. Pipet tips 200µl biru d. Mikropipet e. Tabung eppendorf f. Vortexer g. Block heater h. Microcentrifuge i. Etanol 96-100 j. Kulkas 4ºC k. Freezer-20ºC dan -70ºC l. Alat elektroforesis m. Gel imaging n. Mesin PCR o. Homogeniger p. Disposable gloves Universitas Sumatera Utara Ш.3.2.B. Ekstraksi Virus RNA Langkah pertama adalah mempersiapkan Qiagen Protease dengan menyampurkannya dengan 1,4µL buffer AVE, dicampur dan dipisahkan ke dalam lima sampai enam tabung eppendorf, masing-masing 250µL untuk sepuluh reaksi, lalu disimpan pada suhu -20ºC. Kemudian 310µL buffer AV ditmbahkan ke dalam tabung berisi RNA carrier, dicampurkan dan dipisahkan ke dalam lima tabung eppendorf masing-masing 62µL untuk 10 reaksi, lalu disimpan pada suhu -20ºC. Langkah ketiga adalh mempersiapkan buffer AW-1, dengan menambahkan 25Ml etanol 96-100, dan kemudian disimpan di dalam suhu ruangan. Terakhir adalah mempersiapkan buffer AW-2, dengan menambahkan 30Ml etanol 96-100, dan kemudian disimpan pada suhu ruangan. Ш.3.2.C. Ekstraksi Serumpenderita di masukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 300µl medium FBS. Kemudian, tabung eppendorf dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C. Lalu 200µl supernatant hasil sentrifugasi diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 25µl Qiagen protease. Setelah itu ditambahkan 200µl buffer AL + Carrier RNA dan diinkubasi selama 15 menit dalm suhu 56°C. Lalu tabung eppendorf dimasukkan ke dalam Universitas Sumatera Utara sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250µl etanol ke dalam tabung eppendorf tersebut, ditutup dan dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah divortex, diikunbasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari sentrifuse, masukkan campuran dengan mikropipet ke dalam column, lalu tutup cap. Campuran kembali disentrifuse dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah selesai, keluarkan column, lalu buang collection tube dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Tambahkan 500µl buffer AW-1, lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah column kembali dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru dan tambahkan 500µl buffer AW-2. Columndisentrifuse kagi dan diputa dengan kecepatan 8000rpm selama 1 meit. Buang collection tube yang mengandung filtrate, masukkan column ke dalam collection tube baru. Kmudian ditambahkan 500µl etanol. Setelah itu, campuran dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru, buka tutupnya dan diinkubasi dalam 56°C selama 3 menit. Kemudian column dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5ml, dimasukkan 100µl buffer AVE atau RNAse-free water ke tengah-tengahmembran, ditutup, dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Universitas Sumatera Utara Kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000rpm selama 1 menit. Setelah itu column dibuang dan tabung microcentrifuge yang m mengandung RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam suhu -70°C. Ш.3.3. RT-PCR Master mix dibuat dengan mencampurkan 25µl dari 2x reaksi mix buffer yang terdiri dari 0,4 Mm dari dNTP, 3.2 Mm MgSO4,1 µl dari 10µM primer universal, 1µl dari 10µM primer D1, 1µl dari 10µM primer D2, 1µl dari 10µM primer D3, 1µl dari 10µM primer D4, 2µl superscript Ш RT, 4µl MGSO4 ditambahkan aquades sampai 20µl Harris et al,1998. Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan di spin down. RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65°C selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama mempersiapkan master mix. Kemudian 5µl RNA hasil ekstraksi ditambahkan ke dalam maxter mix, kemudian disentrifuse danagn kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Langkah Reverse Transcriptase RT dilakukan selama 30 menit untuk menghasilkan Cdna, kemudian diamplikasi dengan langkah Polimerase Chain Reaction PCR berikut : 94°C selama 2 menit untuk initial denaturation, 94°C selama 45 menit untuk denaturation, 51° selama 1 menit untuk anneling dan 68°C selama 1 menit untuk extension. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final Universitas Sumatera Utara extension 68°C selama 7 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4°C sebelum digunakan. III.3.4 Elektroforesis Mula-mula dibuat agarose 1 dengan cara : 10 ml 1XTAE buffer dicampur dengan 100 ml aquades pengenceran 10x, lalu 50 ml larutan 1XTAE buffer tersebut dicampur dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskna dalam microwave sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safe TM dan tuang dalam cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran well sesuai kebutuhan. Setelah gel agarose mengeras, dimaksukan ke dalam tangki chamber elektroforesis yang bersi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10µ1 hasil PCR, yang telah dicampur dengan 1µ1 blue juice 2x, dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarose, lalu masukkan pula 10µ1 Marker pada sumur terakhir. Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 80-100 V, DNA akan bergerak dari kutub negative ke kutub positif. Elektroforesisi dihentikan jika tanda biru mencapai ¼ bagian bawah jangan sampai tanda biru hilang, karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas gari gel. III.3.5. Gel Imaging Setelah dielektroforesisi, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat gel imaging untuk melihat hasil amplikasi RNA virus Dengue yang dilakukan dengan teknik RT- PCR. Pita molekul yang terlihat pada gel agarosa menandakan adanya segmen DNA, kemudian pita molekul tersebut dibandingkan dengan control positif dan market. Universitas Sumatera Utara Buka file : gel doc, masukkan gel ke dalam alat foto. Kemudian tekan tombol : epi- white, sampai muncul di layer computer, kemudian matikan epi-white. Lalu tekan : autofocus, lalu tekan tombol UV, setelah muncul gambaran band pada gel di layer computer, tekan : freeze, lalu tekan : analyze, tekan : transform, buka file image, crop, save dan print. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL PENELITIAN

Sampel penenilitian berupa 100 serum penderita DD dan DBD yang dikumpulkan dari tiga Rumah Sakit, yaitu Rumah Sakit Haji Adam Malik RS.HAM, Rumah Sakit Dr. Pirngadi dan Rumah Sakit Herna di Kota Medan, Sumatera Utara, asl serum-serum yang diperoleh dapat dilihat dari table berikut: Tabel 1. Serum Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan Asal serum Jumlah RS HAM 40 RS Pirngadi 37 RS Herna 23 Jumlah 100 Sampel – sampel tersebut kemudian diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue yang ada dalam serum penderita, setelah itu, hasil ekstraksi tersebut di RT-PCR menggunakan DEN 1. Hail dari RT-PCR ini kemudian dielektroforesa dan divisualisasi. Dapat disebut positif DEN 1 bila ditemukan pita ukuran 482 bp base pairs. Pita tersebut dapat dibandingkan dengan pita penanda marker yang berukuran 500 bp. Gambar berikut menunjukkan hasil RT-PCR control positif dari masing –masing DEN dibandingkan dengan pita penanda yang digunakan. Universitas Sumatera Utara