Deteksi Dan Penentuan Virus Dengue Serotipe 3 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS DENGUE SEROTIPE 3

DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM

BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN

MENGGUNAKAN REVERSE TRANSCRIPTASE

POLYMERASE CHAIN REACTION

TESIS

Oleh

M. RAJAMIN NASUTION

067027005/IKT

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009

S

E K O L

A

H

P A

S C

A S A R JA

N

DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS DENGUE SEROTIPE 3

DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM

BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN

MENGGUNAKAN REVERSE TRANSCRIPTASE

POLYMERASE CHAIN REACTION

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Kedokteran Tropis dalam Program Studi Ilmu Kedokteran Tropis

pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

M. RAJAMIN NASUTION

067027005/IKT

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009

Judul Tesis : DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS DENGUE SEROTIPE 3 DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN MENGGUNAKAN REVERSE

TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION

Nama Mahasiswa : M. Rajamin Nasution Nomor Pokok : 067027005

Program Studi : Ilmu Kedokteran Tropis

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Prof. dr. Herman Hariman, PhD, SpPk, (K) KH) Ketua

(dr. R. Lia Kusumawati, MS, Sp.MK) (Drs. Abdul Jalil Amri Arma, M.Kes)

Anggota Anggota

Ketua Program Studi Direktur

(Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTM&H, MSc (CTM),SpA(K)) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa, B, MSc)

Telah diuji pada

Tanggal: 18 Februari 2009

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. dr. Herman Hariman, PhD, Sp.PK(K)KH Anggota : 1. dr. R. Lia Kusumawati, MS, SpMK

2. Drs. Abdul Jalil Amri Amra, M.Kes

3. Dr. dr. Rosihan Anwar, DMM, MS, Sp.MK, M.Pd,DK 4. dr. Yosia Ginting, SpPD, (k), KPTI

ABSTRAK

Penelitian surveilens serotipe virus DEN 3 dengan serum penderita DD/DBD di Kota Medan belum pernah dilakukan dengan cara molekuler menggunakan teknik

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Penelitian dilakukan

di Laboratorium Klinik Mikrobiologi Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai bulan Januari 2009. Bahan penelitian adalah serum penderita DD dan DBD yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit Pirngadi, Rumah Sakit Herna Medan. Kerangka operasional penelitian meliputi: Pasien kriteria positif didata (Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab), ambil serum penderita 0,5 cc lalu ekstraksi RT-PCR (menggunakan primers universal dan TS3) lalu dielektroforesis, langkah selanjutnya Gel Imaging (visualisasi), lihat serotipe virus Dengue. Kriteria klinik dan cara pengambilan serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue dilakukan dengan menggunakan kriteria WHO Test dipakai sebagai konfirmasi diagnosis klinik. Seratus sampel serum penderita DD/DBD tersebut diperiksa untuk mendapatkan deteksi dan penentuan virus Dengue serotipe 3 dengan menggunakan Metode RT-PCR, hasilnya tidak menunjukkan adanya virus Dengue serotipe 3, pada penelitian ini dapat dipertahankan hasil yang negatif merupakan hasil yang sangat menggembirakan bagi masyarakat Sumatera Utara khususnya masyarakat Kota Medan sebab banyak kepustakaan yang mengatakan virus Dengue serotipe 3 merupakan yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB. Maka disimpulkan bahwa penelitian 100 serum penderita DD/DBD dari ketiga Rumah Sakit tidak dijumpai serum yang mengandung virus tipe 3. Untuk itu perlu disarankan dilakukan penentuan virus Dengue dalam manajemen pasien DD/DBD untuk mempermudah pengobatan.

Kata Kunci: Demam Dengue, Demam Berdarah Dengue, Virus Dengue DEN-3, RT-PCR.

ABSTRACT

Surveilance of DEN 3 from human Plasma using molecular technique Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction has never be done before in Medan, North Sumatera, Indonesia. The research for this surveilance was performed at Microbiology Clinical Laboratory Haji Adam Malik Hospital from September 2008 to January 2009. The specimens are Plasma of Dengue Fever (DF) and Dengue Haemorragic Fever (DHF) patients from Haji Adam Malik Hospital, Dr. Pirngadi Hospital, and Herna Hospital. The research operational procedures are: patients Recruitment, data (name, age, sex, job, laboratory test), Blood sampling for 0,5 cc Plasma, DNA extraction, RT-PCR (using universal primers and TS3), electrophoresis, and gel imaging. WHO clinical criterion is used as diagnostic confirmation. One hundred samples was observed to determine DEN 3 serotype. The result is zero finding of DEN 3 virus. This is very reliefing to North Sumatera residence, mainly in Medan, considering its virulence during an outbreak. It can be concluded that, from 100 human Plasma Samples, no type 3 Dengue virus can be Found.

KATA PENGANTAR

Syukur alhamdulillah senantiasa penulis ucapkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmad dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.

Dalam proses penyelesaian tesis ini sepenuhnya penulis menyadari telah banyak mendapat dukungan dan bimbingan dari banyak pihak, untuk itu dalam kesempatan ini penulis tak lupa mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Pemerintah Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam c.q. pelaksana Bupati Kabupaten Gayo Lues Bapak Drs. Ramli, MM yang telah memberikan izin sekolah di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

2. Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada kami untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan Program Magister Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

3. Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang dijabat oleh Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, MSc atas kesempatan yang diberikan menjadi Mahasiswa Program Magister Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

4. Ketua Program Studi Magister Ilmu Kedokteran Tropis Universitas Sumatera Utara yang dijabat oleh Prof. Dr. dr. H. Syahril Pasaribu, DTM&H, MSc (CTM), Sp.A(K) beserta jajarannya, atas kesempatan, bimbingan serta petunjuk selama saya menjadi Mahasiswa.

5. Prof. dr. Herman Hariman, PhD, SpPk (K) KH selaku pembimbing utama yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran ditengah-tengah kesibukan beliau yang padat. Sikap teliti, cermat dan seriusnya dalam membimbing, membuat penulis sangat mengagumi beliau.

6. dr. R. Lia Kusumawati, MS, SpMK selaku Pembimbing dan Sekretaris Program Ilmu Kedokteran Tropis, yang dengan sabar dan tulus telah mensupport penulis untuk dapat melewati masa-masa sulit dalam penelitian. Penulis menganggapnya sudah seperti saudara sendiri, karena beliau selalu menyediakan diri untuk mendengarkan keluh kesah penulis dan membantu mencari solusi.

7. Drs. Abdul Jalil Amri Arma, MKes selaku pembimbing dan konsultan statistik, di mana dalam kesibukan yang luar biasa padatnya masih sempat memberikan bantuan secara serius tapi santai. Sifat humoris yang mengesankan membuat penulis menjadi lebih antusias menyelesaikan tesis ini.

8. Dr. dr. Rosihan Anwar, DMM, MS, Sp.MK, MPd, DK selaku Dosen Pembanding dan Penguji Tesis, sangat benyak memberi masukan dan selalu menjadi teladan bagi penulis, baik pada saat penulis masih S1 di FK-UISU (penulis selalu ingat pada pesan beliau bahwa seorang dokter harus terus belajar seumur hidupnya/

Long Life Study) maupun pada saat penulis menyelesaikan S2 di Sekolah Pascasarjana USU. Semoga tuhan memberikan kesehatan agar beliau tetap bisa mengabdikan ilmunya pada orang banyak.

9. dr. Yosia Ginting, SpPD (K) KPTI selaku Dosen Pembanding saat seminar proposal, profil guru yang sebenarnya. Memberi ilmu dengan tulus dan tak kenal lelah. Pengabdiannya pada dunia pendidikan kedokteran membuat penulis kagum. Semoga ilmu yang telah diberikannya dapat bermanfaat bagi penulis dan beliau mendapatkan pahala atas ilmunya.

10. Rekan seperjuangan di Program Magister Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara, angkatan III yang telah bersama-sama selama 2 tahun lebih, membagi informasi, berbagi suka duka dalam kebersamaan dan persahabatan.

11. Terima kasih dan sayang kepada Ayahanda H. Johan Nasution dan Ibunda Hj. Siti Rafiah Lubis yang selalu mendoakan dan mendukung penulis dengan penuh kasih sayang. Juga rasa hormat dan cinta buat istriku Solinah, AMKeb yang telah mutiara kecilku Syakira

Hanna yang amat kukasihi, semoga Allah senantiasa memberkahi dan menjadikan

“mutiara” kecilku layaknya manusia yang berguna bagi nusa, bangsa dan agamanya, Amin. Buat saudara/i ku Hj. Yusridawati, SST, M.Kes, Hafni Khairani, S.Pd, Miska Hayati, S.Ag semoga kita selalu menghargai ilmu pengetahuan dan menjadikan ilmu sebagai landasan dalam bersikap dan berbuat. Menjadi manusia yang cinta ilmu dan mulia karena memiliki ilmu.

12. Terima kasih buat semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Semoga kebaikan yang anda perbuat mendapat ganjaran pahala dari Allah SWT, Amin.

Semoga tesis ini bermanfaat bagi yang memerlukan.

Medan, Februari 2009

RIWAYAT HIDUP

Nama Lengkap : M. Rajamin Nasution

Tempat/Tanggal Lahir : Simpanggambir, 29 Agustus 1971

sebagai anak ketiga dari H. Johan Nasution dan Hj. Rafiah Lubis

Alamat : Jl. Karya Dame

Gg. Bahagia No. 8 Sei Agul, Medan

Riwayat Pendidikan

1. Tahun 1978-1984 : SD Negeri No. 142683 Simpanggambir 2. Tahun 1984-1987 : SMP Negeri Muara Soma

3. Tahun 1987-1990 : SMA Negeri Kota Nopan

4. Tahun 1990-2001 : Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sumatera Utara

Riwayat Pekerjaan

1. Tahun 2002-2004 Dokter (PTT) di Puskesmas Simpanggambir, Kec. Linggabayu, Kab. Mandailing Natal.

2. Tahun 2005 sampai sekarang Dokter (PNS dpk) di RSUL Balangkejeren Kabupaten Gayo Lues, Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam.

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ... i

ABSTRACT ... ii

KATA PENGANTAR... iii

RIWAYAT HIDUP ... vi

DAFTAR ISI... vii

DAFTAR TABEL ... x

DAFTAR GAMBAR... xi

DAFTAR LAMPIRAN ... xii

DAFTAR SINGKATAN... xiii

BAB I PENDAHULUAN... 1

I.1. Latar Belakang ... 1

I.2. Perumusan Masalah ... 4

I.3. Tujuan Penelitian ... 4

I.3.1. Tujuan Umum ... 4

I.3.2. Tujuan Khusus ... 4

I.4. Manfaat ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

II.1. Virus Dengue ... 6

II.2. Peran Vektor Nyamuk terhadap Penyakit Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue ... 7

II.3. Epidemiologinya ... 7

II.4. Manifestasi Klinik ... 8

II.4.1. Demam Dengue ... 9

II.4.2. Demam Berdarah Dengue ... 9

II.4.3. Dengue Syok Sindrom... 10

II.5. Menegakkan Diagnosis ... 11

II.6. Pengertian RT-PCR Secara Umum ... 12

II.6.1. Sejarah RT-PCR ... 12

II.6.2. Penggunaan PCR ... 13

II.6.3. Primers ... 14

II.6.4. Prosedur ... 14

II.6.5. Reverse Transcriptase ... 16

BAB III METODE PENELITIAN ... 18

III.1. Rancangan Penelitian ... 18

III.2. Tempat dan Waktu ... 18

III.3. Bahan dan Cara Kerja ... 18

III.3.1. Kerangka Operasional ... 20

III.3.2. Ekstraksi RNA ... 20

III.3.2.1. Peralatan dan bahan... 21

III.3.2.2. Persiapan ... 22

III.3.2.3. Ekstraksi ... 23

III.3.3. RT-PCR ... 26

III.3.4. Elektroforesis ... 26

III.3.5. Gel Imaging... 27

BAB IV HASIL PENELITIAN ... 28

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ... 38

VI.1. Kesimpulan ... 38

VI.2. Saran ... 38

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman 1. Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue

yang Dikumpulkan ... 28 2. Gambaran Serum Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue

yang Mengandung DEN 3 Berdasarkan Asal Rumah Sakit ... 32 3. Gambaran Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman 1. Proses Ekstraksi ... 25 2. Hasil RT-PCR Kontrol Positif ... 29 3. Hasil RT-PCR Sampel 1 Sampai 100 ... 30 4. Peta Penyebaran Serotipe Virus Dengue di 19 Kota di Indonesia 35

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman 1. Contoh Formulir Data Pasien... 41 2. Deteksi dan penentuan virus Dengue serotipe 3 dari spesimen

klinik di Rumah Sakit Kota Medan dengan menggunakan Metode RT–PCR ... 42

DAFTAR SINGKATAN

AMV : Avian Myeloblastosis Virus Arbovirus : Arthropod borne Virus

CFR : Case Fatality Rate

DBD : Demam Berdarah Dengue

DD : Demam Dengue

DEN : Dengue

Depkes : Departemen Kesehatan

DKI : Daerah Khusus Ibukota

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid ELISA : Enzyme Linked Imunosorbent Assay

Ig : Immunoglobulin

Kb : Kilo basepairs

KLB : Kejadian Luar Biasa

Lab : Laboratorium

ml : Mililiter

µl : Mikroliter

Pre-M : Pre Membran

RNA : Ribo Nuclead Acid

RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SGOT : Serum Glutamat Oxalat Transaminase

SGPT : Serum Glutamat Piruvat Transaminase WHO : World Health Organization

ABSTRAK

Penelitian surveilens serotipe virus DEN 3 dengan serum penderita DD/DBD di Kota Medan belum pernah dilakukan dengan cara molekuler menggunakan teknik

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Penelitian dilakukan

di Laboratorium Klinik Mikrobiologi Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai bulan Januari 2009. Bahan penelitian adalah serum penderita DD dan DBD yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit Pirngadi, Rumah Sakit Herna Medan. Kerangka operasional penelitian meliputi: Pasien kriteria positif didata (Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab), ambil serum penderita 0,5 cc lalu ekstraksi RT-PCR (menggunakan primers universal dan TS3) lalu dielektroforesis, langkah selanjutnya Gel Imaging (visualisasi), lihat serotipe virus Dengue. Kriteria klinik dan cara pengambilan serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue dilakukan dengan menggunakan kriteria WHO Test dipakai sebagai konfirmasi diagnosis klinik. Seratus sampel serum penderita DD/DBD tersebut diperiksa untuk mendapatkan deteksi dan penentuan virus Dengue serotipe 3 dengan menggunakan Metode RT-PCR, hasilnya tidak menunjukkan adanya virus Dengue serotipe 3, pada penelitian ini dapat dipertahankan hasil yang negatif merupakan hasil yang sangat menggembirakan bagi masyarakat Sumatera Utara khususnya masyarakat Kota Medan sebab banyak kepustakaan yang mengatakan virus Dengue serotipe 3 merupakan yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB. Maka disimpulkan bahwa penelitian 100 serum penderita DD/DBD dari ketiga Rumah Sakit tidak dijumpai serum yang mengandung virus tipe 3. Untuk itu perlu disarankan dilakukan penentuan virus Dengue dalam manajemen pasien DD/DBD untuk mempermudah pengobatan.

Kata Kunci: Demam Dengue, Demam Berdarah Dengue, Virus Dengue DEN-3, RT-PCR.

ABSTRACT

Surveilance of DEN 3 from human Plasma using molecular technique Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction has never be done before in Medan, North Sumatera, Indonesia. The research for this surveilance was performed at Microbiology Clinical Laboratory Haji Adam Malik Hospital from September 2008 to January 2009. The specimens are Plasma of Dengue Fever (DF) and Dengue Haemorragic Fever (DHF) patients from Haji Adam Malik Hospital, Dr. Pirngadi Hospital, and Herna Hospital. The research operational procedures are: patients Recruitment, data (name, age, sex, job, laboratory test), Blood sampling for 0,5 cc Plasma, DNA extraction, RT-PCR (using universal primers and TS3), electrophoresis, and gel imaging. WHO clinical criterion is used as diagnostic confirmation. One hundred samples was observed to determine DEN 3 serotype. The result is zero finding of DEN 3 virus. This is very reliefing to North Sumatera residence, mainly in Medan, considering its virulence during an outbreak. It can be concluded that, from 100 human Plasma Samples, no type 3 Dengue virus can be Found.

BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue disebabkan virus Dengue yang

ditularkan melalui gigitan nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus betina yang sebelumnya telah membawa virus tersebut di dalam tubuh manusia. Penyakit ini masih merupakan masalah kesehatan yang serius dibanyak daerah tropis dan subtropis di dunia. Penyakit yang ditimbulkannya hiperendemis di Asia Tenggara, dengan bentuk yang paling berbahaya DBD dan Sindrom Syok Dengue (SSD) yang biasanya bersifat fatal, terutama pada anak-anak (Yulfi, 2006, Miagostovich M.P, 2002). Virus Dengue adalah virus yang termasuk dalam group B Arthropod borne

Virus (Arbovirus), genus Flavivirus, famili Flaviviridae. Virus Dengue terdiri dari 4

serotipe yaitu tipe Den-1, Den-2, Den-3, Den-4. Keempat virus tersebut ditemukan diberbagai daerah di Indonesia, pengamatan virus dilakukan sejak tahun 1975 di beberapa Rumah Sakit menunjukkan bahwa empat serotipe ditemukan dan bersirkulasi sepanjang tahun (Hadinegoro, et al, 2006) Virus yang terbanyak berkembang di masyarakat adalah virus tipe 1 dan tipe 3 (Kristina, 2004). Diperkirakan lebih kurang 100 juta kasus Demam Dengue dan 500 ribu kasus Demam Berdarah Dengue terjadi setiap tahunnya di seluruh dunia, di mana 90% dari kasus-kasus tersebut menyerang anak-anak di bawah umur 15 tahun (Hadinegoro, et

Pada tahun 1779, David Bylon melaporkan terjadinya letusan Demam Dengue di Batavia. Jadi, ternyata jenis penyakit ini sudah lama ada di Indonesia sebagai suatu penyakit yang disebabkan oleh sejenis virus dan ditularkan oleh sejenis nyamuk tertentu yang hidup dan berkembang di lingkungan sekitar manusia, dan perilaku

maupun lingkaran hidup nyamuk itu telah diketahui oleh manusia (Hendrawan N, 2007). Sedangkan di Asia Tenggara hanya merupakan penyakit

ringan yang tidak pernah menimbulkan kematian. Tetapi sejak tahun 1952 infeksi virus Dengue menimbulkan penyakit dengan manifestasi klinis berat, yaitu Demam Berdarah Dengue yang ditemukan di Manila, Filipina dan menyebar ke negara lainnya. Di Indonesia pada tahun 1968 penyakit Demam Berdarah Dengue dilaporkan di Surabaya dan Jakarta sebanyak 58 kasus, dengan jumlah kematian yang sangat tinggi 24 orang (Case fatality rate 41,3%) (Hadinegoro, et al, 2006).

Patogenesis Demam Berdarah dan Sindrom Syok Dengue hingga kini masih belum diketahui dengan pasti, tetapi dua teori yang dianut adalah secondary

heterologous infection hipotesis, (Halstead, 1969). Di mana dinyatakan bahwa

pasien yang mengalami infeksi kedua kalinya dengan serotipe virus yang berbeda mempunyai resiko yang lebih besar menderita Demam Berdarah Dengue. Hal ini disebabkan karena adanya antibodi heterolog yang telah ada sebelumnya akan membentuk kompleks antigen antibodi, selanjutnya akan mengaktivasi sistem komplemen yang menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding pembuluh darah dan merembesnya plasma dari intravaskuler ke ekstravaskuler. Kompleks antigen

antibodi juga menyebabkan agregasi trombosit dan aktivasi sistem koagulasi (Hadinegoro, et al, 2006).

Sejauh ini belum ditemukan vaksinasi yang aman dan efektif bagi virus ini, sehingga kontrol bagi penyakit ini sepenuhnya mengandalkan pada kontrol terhadap vektornya. Strategi kontrol terhadap nyamuk Aedes terutama dititik beratkan pada surveilens dan eliminasi tempat perindukan larva maupun nyamuk dewasa (Chow, et

al, 1998).

Surveilens terhadap virus (virologic surveilance) telah digunakan sebagai peringatan dini (early warning system) untuk memperkirakan timbulnya epidemik. Surveilens ini biasanya menggunakan isolasi virus dari serum manusia yang diperiksa dan diidentifikasi serotipenya dengan menggunakan imunofluoresens. Namun pendekatan cara ini dinilai kurang efektif mengingat virus ini telah dalam tahap menginfeksi penderita. Pendekatan yang lebih efektif adalah dengan mendeteksi virus

ini dalam nyamuk sebelum ia menginfeksi manusia (Rohani, et al, 2005). Saat ini sedang berkembang cara diagnosa dengan teknik molekuler

menggunakan tehnik Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Pemeriksaan dengan menggunakan RT-PCR ini dapat menentukan serotipe virus Dengue dengan cepat, tepat dan spesifik (Harris, 1998).

Penelitian surveilens serotipe virus Dengue, khususnya virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) dengan serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue di Kota Medan belum pernah dilakukan dengan cara molekuler menggunakan teknik

mengetahui keberadaan virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) di Kota Medan, maka penulis tertarik melakukan penelitian menentukan virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) menggunakan tehnik RT-PCR dengan serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan dari beberapa Rumah Sakit di Kota Medan.

I.2. Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian dengan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan masalah sebagai berikut: Belum diketahuinya frekwensi virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) pada serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue di Kota Medan.

I.3. Tujuan Penelitian

I.3.1. Tujuan Umum Untuk mengetahui frekwensi virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) pada serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue di Kota Medan. I.3.2. Tujuan Khusus

1. Untuk mengetahui gambaran karakteristik penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue anak dan dewasa virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) berdasarkan jenis kelamin dan umur.

2. Untuk melakukan deteksi virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) dari serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue, secara molekuler

dengan menggunakan teknik Reverse Trancriptase Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR).

3. Mengetahui keberadaan virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) di Kota Medan.

I.4. Manfaat 1. Dengan ini diharapkan peneliti mendapatkan data base frekwensi virus

Dengue serotipe 3 (DEN 3) dari serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue di Kota Medan.

2. Menambah informasi tentang karakteristik penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue serotipe 3 (DEN 3) berdasarkan jenis kelamin dan umur.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Virus Dengue Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue disebabkan virus yang termasuk kelompok B Arthropod borne virus (Arbovirus), kelompok Flavivirus dan keluarga

Flaviridae. Virus Dengue dewasa terdiri dari genom asam ribo nukleat berserat

tunggal yang dikelilingi oleh nukleo kapsid dengan diameter sekitar 30 nm. Nukleo kapsid dikelilingi oleh selubung lemak dengan ketebalan sekitar 10 nm. Diameter keseluruhan dari virion tersebut kira-kira 50 nm. Genom virus Dengue mempunyai berat molekul 11 Kb yang tersusun dari protein struktural dan protein non struktural. Protein strukturalnya yaitu protein core atau nukleo kapsid (C), protein envelove (E), dan protein pre membran (pre-M). Sedangkan protein non struktural terdiri dari protein NS-1, NS-2A, NS-2B, NS-3, NS-4A, NS-4B, dan NS-5. Dalam merangsang pembentukan anti bodi diantara protein struktural, urutan imunogenitas tertinggi adalah protein E, kemudian diikuti protein pre-M dan C. Sedangkan pada protein non struktural yang paling berperan adalah protein NS-1 (Massi, et al, 2006).

Hospes seluler untuk virus Dengue terutama sel-sel yang termasuk sistem retikulo endotelial, yaitu: sel monosit, sel endotel, sel kuppfer, sel limfosit B dan magropag. Infeksi dimulai dengan menempelnya virion pada reseptor virus yang ada di permukaan sel, ada 2 cara virus Dengue menempel pada sel yaitu virus terikat pada reseptor yang ada di permukaan sel atau melalui antibodi anti Dengue yang terikat

pada sel. Setelah menempel, Virus masuk kedalam sel dengan cara endositosis dan Fusi selubung virus dengan membran plasma yang diikuti pelepasan nukleokapsid ke dalam sitoplasma sel dan terjadi proses replikasi virus (Kusumawati, 2005).

II.2. Peran Vektor Nyamuk terhadap Penyakit Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue

Infeksi Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue ditularkan pada manusia melalui gigitan nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus. Nyamuk-nyamuk ini termasuk dalam famili Culicidae, sub genus Stegomyia yang tersebar secara kosmopolit. Epidemi nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus, tersebar di Asia, Afrika, Amerika Tengah dan Selatan dan Pasifik. Di Indonesia, nyamuk tersebar di seluruh Indonesia (terutama pada musim penghujan), kecuali di daerah pada ketinggian di atas 1000 meter dari permukaan laut. Nyamuk betina menghisap darah vertebra sedangkan yang jantan menghisap air madu atau air gula. Bila sudah dewasa nyamuk mempunyai sayap berwarna hitam, badan dan kaki berbercak putih, lalu bertelur di mana saja di wadah-wadah penampungan air. Nyamuk ini mempunyai jarak terbang kira-kira 50 meter dan menggigit terutama siang hari, di dalam rumah atau tempat-tempat yang tidak diterangi matahari (Siregar, 2004).

II.3. Epidemiologinya

Penyakit DD/DBD pertama kali di Indonesia ditemukan di Surabaya pada tahun 1968 akan tetapi konfirmasi virologis baru didapat tahun 1972. Sejak saat itu

penyakit ini menyebar ke berbagai daerah, sehingga tahun 1980 seluruh provinsi di Indonesia telah terjangkiti dan jumlah kasus cenderung meningkat dari tahun ke tahun. Meningkatnya jumlah kasus serta bertambahnya wilayah yang terjangkit disebabkan banyaknya sarana transportasi, adanya pemukiman baru, kurangnya perilaku terhadap pembersihan sarang nyamuk dan terdapatnya vektor nyamuk hampir di seluruh pelosok tanah air serta adanya ke empat serotipe virus yang bersirkulasi sepanjang tahun (Hariadhi, 2004).

Dalam kurun waktu lebih dari 35 tahun terjadi peningkatan yang sangat pesat, baik dalam jumlah penderita maupun daerah penyebaran penyakit. Sampai akhir tahun 2005, DBD telah ditemukan di seluruh provinsi Indonesia dan 35 kabupaten telah melaporkan adanya KLB. Incidence rate meningkat dari 0,005 per 100.000 penduduk pada tahun 1968 menjadi 43,42 per 100.000 penduduk pada akhir tahun 2005 (Hadinegoro, et al, 2006).

Penyakit DBD disebabkan oleh virus Dengue dengan serotipe DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4. Keempat serotipe tersebut telah ditemukan diberbagai daerah di Indonesia antara lain Jakarta dan Yogyakarta. Virus yang banyak berkembang di masyarakat adalah serotipe DEN 1 dan DEN 3 (Depkes, 2004).

II.4. Manifestasi Klinik Infeksi virus Dengue sering kita salah didiagnosis dengan penyakit lain seperti flu atau tifus. Hal ini disebabkan karena infeksi virus Dengue yang bersifat asimtomatik atau tidak jelas gejalanya. Manifestasi klinis infeksi virus yang sering

terjadi pada pasien bisa berupa demam yang tidak khas, nyeri otot dan persendian, nyeri kepala, mual dan muntah. Masalah bisa bertambah karena virus tersebut dapat masuk bersamaan dengan infeksi penyakit lain seperti flu dan tifus. Oleh karena itu diperlukan kejelian pemahaman tentang perjalanan penyakit infeksi virus Dengue,

patofisiologi, dan ketajaman pengamatan klinis (Hadinegoro, et al, 2006). II.4.1. Demam Dengue

Demam Dengue biasanya timbul setelah melewati masa inkubasi infeksi virus sekitar 4-6 hari. Demam muncul dengan onset mendadak hingga suhu tubuh dapat mencapai 39 - 400 C. Serta demam berlangsung selama 5-6 hari. Kelainan kulit berupa bercak kemerahan menyeluruh dan erupsi berbentuk fleeting point/mottling dapat muncul secara sepintas dengan uji torniquet yang positif (Hadinegoro, et al, 2006).

II.4.2. Demam Berdarah Dengue

Demam Berdarah Dengue adalah infeksi virus Dengue dengan tanda-tanda seperti di atas, yang disertai:

1. Manifestasi perdarahan yang lebih nyata, seperti: uji torniquet positif,

petechiae, echimosis atau purpura, Perdarahan mukosa, epistaksis atau

perdarahan gusi.

2. Trombositopenia (≤ 100.000/mm3).

3. Kebocoran plasma yang disebabkan meningkatnya permeabilitas kapiler dengan di tandai oleh: - Meningkatnya hematokrit ≥ 20%.

II.4.3. Dengue Syok Sindrom

Dengue Syok Sindrom merupakan manifestasi klinis Demam Berdarah

Dengue yang disertai tanda-tanda kegagalan sirkulasi berupa: 1. Penyempitan tekanan nadi (≤ 20 mmHg). 2. Frekwensi nadi cepat dan kecil. 3. Hipotensi.

4. Akral dingin.

Beberapa karakteristik manifestasi klinis infeksi Dengue secara umum berupa: nyeri kepala 98%, lemah badan 88%, mual-muntah 84%, nyeri epigastrium 78%, nyeri sendi/otot 69%, petechia 64%, epistaksis/perdarahan gusi 36%, bercak darah (rash) 22%, nyeri retro orbital 17%, hematemesis, melena 14%, faringitis 12%, dan limfadenopati 12%.

Dengan pemeriksaan klinis yang baik dan lengkap, diagnosis Demam Berdarah Dengue serta pemeriksaan penunjang (Laboratorium) dapat membantu

terutama bila gejala klinik kurang memadai. Manifestasi laboratorium dapat dilihat dari beberapa parameter seperti

terjadinya leukopenia (neutrofil menonjol), limfosit atipikal (15%), trombositopenia (∑ trombosit ≤ 100.000/mm3) Hemokonsentrasi, abnormalitas pembekuan darah, hiponatremia, hipoalbuminemia dan peningkatan kadar SGOT/SGPT (Hadinegoro, et

II.5. Menegakkan Diagnosis

Untuk menegakkan diagnosis digunakan kriteria WHO 1997 yaitu dijumpainya demam tinggi dengan onset akut, hemokonsentrasi (>20%), manifestasi

hemoragis, hepatomegali, hipotensi dan syok. Diagnosis klinis Demam Berdarah Dengue dilakukan berdasarkan penetapan

derajat tingkat keparahan penderita secara klinis dengan menggunakan kriteria WHO 1997 yang terbagi atas 4 tingkatan, yaitu:

Derajat 1 : Ditandai dengan adanya demam mendadak, keluhan yang tidak spesifik

dan uji tourniquet positif. Derajat 2: Terdapat seluruh manifestasi Demam Berdarah Dengue derajat 1 disertai

perdarahan spontan pada kulit atau tempat lain. Derajat 3 : Terdapat seluruh manifestasi Demam Berdarah Dengue derajat 2 disertai

kegagalan sistem sirkulasi yaitu; frekwensi nadi cepat, lemah, pulse pressure sempit (<20mmHg) atau hipotensi. Kulit teraba lembab, dingin

dan penderita gelisah. Derajat 4 : Terdapat seluruh manifestasi Demam Berdarah Dengue derajat 3 disertai

manifestasi syok, di mana tensi tidak terukur dan nadi tidak teraba (Hadinegoro, et al, 2006; Darmowandowo, 2006).

II.6. Pengertian RT-PCR Secara Umum

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu tekhnik yang dipakai secara

luas dalam biologi molekuler, DNA polymerase dipakai untuk memperkuat tanpa menggunakan organisme hidup (Sudjadi, 2008).

II.6.1. Sejarah RT-PCR

Dengan penemuan PCR oleh Kary Mullis, yang mendapat hadiah nobel dalam bidang kimia pada tahun 1993, setelah 7 tahun penemuan ini, untuk penemuan ini pertama kali dia mempublikasikan idenya. Ide tersebut adalah untuk mengembangkan proses multiplikasi DNA secara artifisial melalui pengulangan siklus duplikasi yang dikendalikan oleh enzim yang disebut dengan: DNA polymerase.

DNA polymerase terbentuk secara alamiah dalam organisme hidup, yang

mana fungsinya untuk duplikasi DNA ketika sel membelah. Kerja enzim ini mengikat rantai tunggal DNA dan membuat rantai komplemennya. Dalam proses PCR asli Mullis, enzim yang digunakan in vitro (dalam lingkungan luar organisme). Rantai ganda DNA dipisahkan menjadi 2 rantai tunggal dengan pemanasan 96oC. Pada temperatur ini, DNA polymerase akan rusak, sehingga enzim harus ditambahkan lagi setelah stadium pemanasan pada setiap siklus. Proses PCR asli Mullis ini sangat tidak efisien karena menghabiskan banyak waktu dan enzim DNA polymerase.

Kemudian proses PCR berkembang dengan menggunakan enzim DNA

polymerase yang diambil dari bakteri thermophilic (suka panas) yang tumbuh dalam

geiser pada temperatur di atas 110oC. DNA polymerase diambil dari bakteri ini bersifat termostabil (stabil pada suhu tinggi) sehingga ketika digunakan pada PCR,

tidak rusak waktu pemanasan untuk memisahkan rantai DNA. Sehingga tidak perlu menambahkan DNA polymerase baru untuk setiap siklus, proses PCR menjadi lebih sederhana dan efisien.

Salah satu dari DNA polymerase yang termostabil diambil dari bakteri

Thermus aquaticus dan disebut Taq. Taq polymerase di gunakan secara luas pada

praktek PCR dewasa ini. Satu kekurangan Taq adalah kadang-kadang membuat kesalahan ketika mengkopi DNA, menyebabkan terjadi mutasi (kesalahan) pada susunan DNA.

Polymerase lain, yang disebut Pwo atau Pfu, diambil dari Archaea,

mempunyai mekanisme koreksi pada kesalahan dan dapat mengurangi secara signifikan jumlah mutasi yang terjadi dalam proses mengkopi susunan DNA. Kombinasi Taq dan Pfu sekarang ini terbukti lebih teliti dan akurat dalam amplifikasi DNA (Sudjadi, 2008).

II.6.2. Penggunaan PCR

PCR digunakan untuk mengamplifati rantai pendek pada bagian tertentu dari rantai DNA. Proses PCR biasanya hanya dapat mengkopi hingga 10 Kb (kb=kilobase

pairs=1000 base pairs). Metode PCR tertentu dapat mengkopi hingga 40 Kb, yang

mana masih sangat kurang dibandingkan dengan kromosom DNA sel eukaryotic, contohnya sel manusia berisi kira-kira 3 milyar pasang basa.

Dalam prakteknya, PCR membutuhkan beberapa komponen, yaitu:

2. Two primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri

fragmen yang akan diamplifikasi.

3. DNA polymerase, merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA.

4. Nukleotida, di mana DNA polymerase membangun DNA baru.

5. Buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polymerase.

Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, di mana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi (Sopian, 2006; Sudjadi, 2008).

II.6.3. Primers

Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ditentukan oleh primers yang dipilih.

Primers adalah potongan rantai DNA artifisial, tidak lebih dari 50 nukleotid. Oleh

karena DNA biasanya mempunyai rantai ganda, panjangnya diukur dalam pasang basa. Panjang rantai tunggal DNA diukur dalam basa atau nukleotid, yang mana merupakan pasangan yang tepat dari bagian awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Primers melekat pada DNA template dibagian awal dan akhir, dimana DNA polymerase mengikat dan memulai sintesis rantai DNA baru (Sudjadi, 2008). II.6.4. Prosedur

Proses PCR berisi satu seri yang terdiri dari 20-30 siklus. Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96oC untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting: di mana ikatan hydrogen yang

menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa template DNA dan primers telah terpisah sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal.

Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primers dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primers dan biasanya 5oC di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat menyebabkan primers tidak semuanya terikat pada template DNA atau terikat tidak teratur.

Akhirnya DNA polymerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada

primers dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantung DNA polymerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polymerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi

Proses PCR terdiri dari langkah-langkah berikut: Langkah 1 : Initialization

Pemanasan campuran pada temperatur 92oC selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polymerase dapat diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya.

Langkah 2 : Melting

Pemanasan pada temperatur 92oC selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.

Langkah 3 : Annealing

Pemanasan pada temperatur 53oC selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation

Pemanasan pada temperatur 72oC selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali.

Langkah 6 : Pertahankan campuran pada suhu 72oC selama 5 menit

Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses sepanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 72oC setelah semalaman.

Hasil PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan agarose gel

electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari

pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian menghubungkan arus listrik pada gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui gel menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam gel (Sudjadi, 2008).

II.6.5. Reverse Transcriptase

Reverse transcriptase adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA

komplemennya. Proses ini membutuhkan suatu enzim yang disebut: reverse

transcriptase, yang diambil dari suatu retrovirus seperti: AMV (Avian Myeloblastosis Virus). Enzim yang biasanya secara bersama berhubungan dengan enzim reverse transcriptase adalah enzim RNA-dependent DNA polymerase dan enzim

DNA-dependent DNA polymerase, yang bekerja bersama membentuk transcriptase dengan

arah yang berlawanan dengan arah standar. Reverse transcriptase adalah enzim yang dihasilkan oleh semua retrovirus untuk mentranskrip informasi genetik virus dari RNA menjadi DNA, sehingga dapat berintegrasi ke dalam genom host (Sudjadi, 2008).

Dalam penelitian, reverse transcriptase menyebabkan data yang di kode pada rantai RNA dapat diubah menjadi bentuk DNA dan digunakan dalam PCR, sebab PCR tidak dapat mereplikasi molekul RNA secara langsung. Kombinasi proses

reverse transcriptase dan PCR disebut RT-PCR (Sudjadi, 2008).

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1. Rancangan Penelitian

Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan menggunakan teknik Reverse

Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

III.2. Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Klinik Mikrobiologi Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai bulan Januari 2009.

III.3. Bahan dan Cara Kerja

Bahan penelitian adalah serum penderita Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit Pirngadi, dan Rumah Sakit Herna Medan. Darah penderita diambil dengan menggunakan syringe 3 ml. Pengambilan sampel serum penderita DD/DBD dengan gejala klinis lima hari pertama demam (Singh K, et al, 2006) dan konfirmasi diagnosis DD/DBD sesuai dengan kriteria WHO. Setelah itu, data masing-masing sampel dimasukkan ke dalam lembar check list yang berisi mengenai informasi demografi pasien seperti nama, umur, jenis kelamin, alamat, dan pekerjaan, serta hasil pemeriksaan laboratorium.

Mengingat sampel yang kami ambil 100 (seratus) serum penderita yang kemudian akan dihitung dengan rumus:

n

≥

Z

2

(0,5

–

á

/

₂

).

ñ

.q

e

2

n = jumlah sampel

Z = nilai normal dari tabel Z yang besarnya tergantung dari nilai á yang ditentukan, untuk á = 0,05; Zc = 1,96

p = proporsi penderita DD/DBD di Sumatera Utara 2007 = 0,32 q = 1 – p

e = tingkat ketepatan yang diinginkan = 10% p = 0,32

p = 1 – q = 1 – 0,32 = 0,68

n = 1,96 – 0,68 . 0,32 (10/100)2 = 85

III.3.1. Kerangka Operasional

Pasien

Kriteria DD/DBD (+) Kriteria DD/DBD (-)

Data (Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab) Serum Penderita 0,5 cc

Ekstraksi

RT-PCR (menggunakan primers universal dan TS 3) ANALISIS Elektroforesis

Gel Imaging (visualisasi)

Serotipe Virus Dengue

III.3.2. Ekstraksi RNA

Serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue dan diletakkan dalam tabung eppendorf dengan 1,5 growth medium. Diputar dengan kecepatan 14.000 rpm per menit pada suhu 4oC dan supernatannya akan digunakan untuk isolasi virus.

Virus RNA diekstraksi dari 200µl aliquots yang berasal dari supernatant sel

yang terinfeksi dengan menggunakan QIAamp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen

dengan mengikuti protokolnya. Untuk memeriksa sampel, diperlukan 140µl homogenat dari setiap sampel. Untuk kontrol positif digunakan RNA virus yang

mengandung DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4 dalam jumlah volume yang sama. Untuk kontrol negatif digunakan RNA virus tanpa virus Dengue.

III.3.2.1.Peralatan dan bahan

1. QIAamp MinElute Virus Spint Kit, terdiri dari:

QIAamp MinElute Columns, Collection Tubes, Buffer AL, Buffer AW1 (concentrate), Buffer AW2 (concentrate), Buffer AVE, Protease Resuspension Buffer, Carrier RNA, QIAGEN® Protease.

2. Pipet tips 25 µl (kuning). 3. Pipet tips 200 µl (biru). 4. Mikropipet.

5. Tabung eppendorf. 6. Vortexer (Maxi mix II).

7. Block heater (Barnstead International).

8. Microcentrifuge (Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge). 9. Etanol (96-100%).

10. Kulkas 4o C (Sanyo).

11. Freezer -20oC dan -70oC (Sanyo). 12. Alat elektroforesis.

13. Gel imaging (Bio Red). 14. Mesin PCR (Bio Red). 15. Homogeniger.

17. Agarosa.

18. SYBER safe-TM. 19. IX TAE buffer. 20. Primers DEN 3.

21. Aquades. 22. Blue juice 2X.

III.3.2.2.Persiapan

1. Mempersiapkan Qiagen protease

1,4 buffer AVE di tambahkan ke dalam Qiagen protease, dicampur dan dipisahkan ke dalam 5-6 tabung eppendrof, masing-masing 250 µl (untuk 10 reaksi), lalu disimpan pada suhu -200 C.

2. Mempersiapkan buffer AL- RNA Carrier

310 µl buffer AVE ditambahkan ke dalam tabung berisi carrier RNA. Dicampurkan dan dipisahkan ke dalam 5 tabung eppendrof masing-masing berisi 62 µl (untuk 10 reaksi), lalu disimpan pada suhu -20C.

3. Mempersiapkan Buffer AW-1

25 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam buffer AW-1 dan disimpan pada suhu ruangan.

4. Mempersiapkan Buffer AW-2

30 ml etanol 96-100% ditambahkan ke dalam buffer AW-2 dan disimpan pada suhu ruangan.

III.3.2.3.Ekstraksi

Serum penderita diambil dalam tabung eppendorf dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC. Lalu 200 µl supernatant hasil sentrifuse diambil dengan menggunakan

mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 25 µl

Qiagen protease.

Setelah itu ditambahkan 200 µl buffer AL + Carrier RNA dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 56oC. Lalu tabung eppendorf dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250 µl etanol ke dalam tabung eppendorf tersebut, ditutup dan

dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah di vortex, diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan, lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari sentrifuse, campuran tersebut dimasukkan ke dalam column dengan menggunakan mikropipet dan tutup capnya. Lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, collection tube yang mengandung filtrate dibuang dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru.

Kemudian ditambahkan 500 µl buffer AW-1, lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan

buffer AW-2. Lalu dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Buang collection tube yang mengandung filtrat, masukkan

column ke dalam collection tube baru. Kemudian ditambahkan 500 µl etanol. Lalu dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru.

Kemudian dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan putar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan (dry spin). Setelah

column dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate

dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru, tutupnya dibuka dan diinkubasi dalam 56oC selama 3 menit. Kemudian masukkan column ke dalam tabung

microcentrifuge 1,5 ml, dimasukkan 100 µl buffer AVE atau RNA se-free water ke tengah-tengah membrane, lalu ditutup dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan. Kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu column di buang, dan tabung microcentrifuge yang mengandung RNA yang telah di ekstraksi disimpan dalam suhu -70oC.

III.3.3. RT-PCR

Master mix dibuat dengan mencampurkan 25µl dari 2x reaksi mix (buffer yang terdiri dari 0.4 mM dari dNTP, 3.2 mM MgSO4), 1 µl dari 10 µM primers

universal, 1 µl dari 10 µM primers D3, 2 µl superscript III RT, 4 µl MGSO4

ditambahkan aquades sampai 20 µl (Haris, et al, 1998). Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan di spin down.

RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65oC selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam Es selama mempersiapkan master mix. Kemudian 5 µl RNA hasil ekstraksi ditambahkan ke dalam master mix, kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Langkah Reverse Transcriptase (RT) dilakukan selama 30 menit untuk menghasilkan DNA, kemudian diamplikasi dengan langkah Polymerase Chain

Reaction (PCR) berikut: 92oC selama 3 menit untuk initial denaturation, 82oC selama 30 detik untuk denaturation, 53oC selama 30 detik untuk annealing dan 72oC selama 1 menit untuk extension. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final extension 72oC selama 5 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4oC sebelum digunakan. III.3.4. Elektroforesis

Mula-mula dibuat agarose 1% dengan cara: 10 ml 1X TAE buffer dicampur dengan 100 ml aquades (pengenceran 10x), lalu 50 ml larutan 1X TAE buffer tersebut dicampurkan dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskan dalam microwave sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safe-TM dan tuang dalam

cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran (well) sesuai kebutuhan.

Setelah agarose gel mengeras, dimasukkan ke dalam tangki (chamber)

elektroforesis yang berisi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10µl hasil PCR, yang telah dicampur dengan 1 µl blue juice 2X, dimasukkan ke dalam sumur pada pada agarose gel, lalu masukkan pula 10 µl Marker pada sumur terakhir.

Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 80-100V, DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Elektroforesis dihentikan jika tanda biru mencapai ¼ bagian bawah (jangan sampai tanda biru hilang, karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas dari gel).

III.3.5. Gel Imaging

Buka file: gel doc, masukkan gel ke dalam alat foto. Kemudian tekan tombol: epi-white, sampai muncul di layar computer, kemudian matikan epi-white. Lalu tekan: auto focus, lalu tekan tombol UV, setelah muncul gambaran band pada gel di layar computer, tekan: freezer, lalu tekan: analyze, tekan: transform, buka file image, crop, save dan print.

BAB IV

HASIL PENELITIAN

Dari penelitian ini sebanyak 100 serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang berasal dari beberapa Rumah Sakit di Kota Medan yang diperiksa untuk mendapatkan deteksi dan penentuan virus Dengue tipe 3 yang menggunakan Metode Reverse Transcriptase PCR, serum tersebut satu per satu diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue yang ada dalam serum tersebut. Setelah itu RNA hasil ekstraksi tersebut di RT-PCR dengan menggunakan primers DEN 3. Hasil RT-PCR kemudian di elektroforesis dan divisualisasi, DEN 3 dikatakan positif bila ditemukan pita ukuran 290 pasangan basa. Pita yang didapat dibandingkan dengan marker pita yang berukuran 300 pasangan basa.

Tabel 1. Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang Dikumpulkan

Asal Serum Jumlah

RS HAM RS PIRNGADI

RS HERNA

40 37 23

Gambar di bawah ini menunjukkan hasil RT-PCR kontrol positif dari masing-masing DEN dibandingkan dengan marker yang digunakan.

Gambar 2. Hasil RT-PCR Kontrol Positif Keterangan:

1. Kontrol positif DEN 2 : 119 bp 2. Kontrol positif DEN 3 : 290 bp 3. Kontrol positif DEN 4 : 398 bp 4. Kontrol positif DEN 1 : 482 bp 5. Market 100 bp DNA Ladder

500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

Hasil RT-PCR virus Dengue DEN 3 yang didapat dari 100 serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan dari beberapa Rumah Sakit di Kota Medan, adalah sebagai berikut:

Gambar 3. Hasil RT-PCR Sampel 1 Sampai 100 Keterangan:

1. Marker

2. Kontrol negatif

3. Kontrol positif DEN 3 4. Sampel 1 : -

5. Sampel 2 : - 6. Sampel 3 : - 7. Sampel 4 : - 8. Sampel 5 : - 9. Sampel 6 : - 10. Sampel 7 : - 11. Sampel 8 : - 12. Sampel 9 : - 13. Sampel 10 : - 14. Sampel 11 : - 15. Sampel 12 : - 16. Sampel 13 : - 17. Sampel 14 : - 18. Sampel 15 : - 19. Sampel 16 : -

52. Sampel 49 : - 53. Sampel 50 : - 54. Sampel 51 : - 55. Sampel 52 : - 56. Sampel 53 : - 57. Sampel 54 : - 58. Sampel 55 : - 59. Sampel 56 : - 60. Sampel 57 : - 61. Sampel 58 : - 62. Sampel 59 : - 63. Sampel 60 : - 64. Sampel 61 : - 65. Sampel 62 : - 66. Sampel 63 : - 67. Sampel 64 : - 68. Sampel 65 : - 69. Sampel 66 : - 70. Sampel 67 : -

20. Sampel 17 : - 21. Sampel 18 : - 22. Sampel 19 : - 23. Sampel 20 : - 24. Sampel 21 : - 25. Sampel 22 : - 26. Sampel 23 : - 27. Sampel 24 : - 28. Sampel 25 : - 29. Sampel 26 : - 30. Sampel 27 : - 31. Sampel 28 : - 32. Sampel 29 : - 33. Sampel 30 : - 34. Sampel 31 : - 35. Sampel 32 : - 36. Sampel 33 : - 37. Sampel 34 : - 38. Sampel 35 : - 39. Sampel 36 : - 40. Sampel 37 : - 41. Sampel 38 : - 42. Sampel 39 : - 43. Sampel 40 : - 44. Sampel 41 : - 45. Sampel 42 : - 46. Sampel 43 : - 47. Sampel 44 : - 48. Sampel 45 : - 49. Sampel 46 : - 50. Sampel 47 : - 51. Sampel 48 : -

71. Sampel 68 : - 72. Sampel 69 : - 73. Sampel 70 : - 74. Sampel 71 : - 75. Sampel 72 : - 76. Sampel 73 : - 77. Sampel 74 : - 78. Sampel 75 : - 79. Sampel 76 : - 80. Sampel 77 : - 81. Sampel 78 : - 82. Sampel 79 : - 83. Sampel 80 : - 84. Sampel 81 : - 85. Sampel 82 : - 86. Sampel 83 : - 87. Sampel 84 : - 88. Sampel 85 : - 89. Sampel 86 : - 90. Sampel 87 : - 91. Sampel 88 : - 92. Sampel 89 : - 93. Sampel 90 : - 94. Sampel 91 : - 95. Sampel 92 : - 96. Sampel 93 : - 97. Sampel 94 : - 98. Sampel 95 : - 99. Sampel 96 : - 100. Sampel 97 : - 101. Sampel 98 : - 102. Sampel 99 : - 103. Sampel 100 : -

Hasil RT-PCR pada sampel 1 sampai 100 tidak menunjukkan adanya virus Dengue serotipe 3 (DEN 3).

Persentase serum pederita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang mengandung virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) dapat dilihat pada tabel berikut:

Tabel 2. Gambaran Serum Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang Mengandung DEN 3 Berdasarkan Asal Rumah Sakit

Jumlah Pasien Asal Rumah Sakit

LK PR JLH

Jumlah Serum yang Mengandung DEN 3 Persentase (%) RS H. ADAM MALIK

RS PIRNGADI RS HERNA 22 19 12 18 18 11 40 37 23 - - - - - -

Total 53 47 100 - 0 %

Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa pada 100 sampel serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang diperoleh dari beberapa Rumah Sakit di Kota Medan tidak ditemukan adanya virus dengue serotipe 3 (DEN 3).

Tabel 3. Gambaran Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Berdasarkan Umur dan Jenis Kelamin

Jenis Kelamin Umur

Laki-Laki Perempuan

Persentase

(%) Jumlah

< 5 5 – 9 10 - 14 15 – 45 > 45 2 7 11 30 3 1 10 5 30 1 3,0 % 17,0 % 16,0 % 60,0 % 4,0 % 3 17 16 60 4

Jumlah 53 47 100% 100

Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa dari 100 sampel yang dianalisa sesuai dengan kelompok umur maka jumlah sampel serum penderita Demam Dengue/ Demam Berdarah Dengue terbanyak terdapat pada rentang usia 15-45 tahun yaitu 60 orang (60,0%).

BAB V PEMBAHASAN

Infeksi virus Dengue masih tetap menjadi masalah kesehatan yang serius dibanyak daerah tropis dan subtropis di dunia. Kasus Demam Dengue (DD) dan Demam Berdarah Dengue (DBD) selalu berulang dibanyak kawasan di Indonesia. Pada penelitian ini dikumpulkan 100 serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang masuk atau dirawat di bagian penyakit anak dan bagian penyakit dalam dari 3 Rumah Sakit Umum di Kota Medan yaitu Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit Pirngadi, dan Rumah Sakit Herna Medan yang menjadi pusat rujukan bagi penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue di Kota Medan dan Kabupaten sekitarnya. Kriteria klinik dan cara pengambilan serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue dilakukan dengan menggunakan kriteria WHO Test dipakai sebagai konfirmasi diagnosis klinik. Serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang telah dikumpulkan satu persatu serum diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue yang ada pada serum tersebut. RNA hasil ekstraksi kemudian di RT-PCR dengan menggunakan primers DEN 3. Hasil RT-PCR kemudian dielektroforesis dan visualisasi. Virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) dikatakan positif bila ditemukan pita ukuran 290 pasangan basa, yang dibandingkan dengan pita yang berukuran 300 pasangan basa pada marker.

Dari hasil penelitian 100 serum penderita Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue yang telah diperiksa tidak satupun didapatkan serum yang positif mengandung virus Dengue serotipe 3 (DEN 3). Dengan tidak ditemukannya virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) pada penelitian ini dapat dipertahankan hasil yang negatif merupakan hasil yang sangat menggembirakan bagi masyarakat Sumatera Utara khususnya masyarakat Kota Medan, sebab serotipe Virus Dengue yang bersirkulasi di Bangkok, Thailand ternyata berbeda pada kurun waktu yang berbeda pula. Den-1 prodominan pada tahun 1990-1992, Den-2 pada tahun 1973-1986 dan 1988-1989, Den-3 pada 1987 dan 1995-1999, Den-4 pada tahun 1993-1994. Hanya Den-3 yang berkaitan dengan terjadinya wabah (Nisalak A, 2003; Hariadhi, 2004). Sebab banyak kepustakaan yang mengatakan virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) merupakan serotipe yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB di banyak daerah di Indonesia, diikuti DEN 2, DEN 1, dan DEN 4. Virus Dengue DEN 3 juga merupakan serotipe yang paling dominan yang berhubungan dengan tingkat keparahan penyakit, diikuti DEN 2 (Suroso, 1999; Hariadhi, 2004).

Pada penelitian ini tidak didapatkan gambaran karakteristik penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue anak dan dewasa virus Dengue serotipe 3 (DEN 3) berdasarkan jenis kelamin dan umur tidak dapat diukur, karena pada penelitian ini tidak dijumpai virus DEN 3.

Hasil penelitian ini berbeda dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Depkes tahun 2003-2005, di mana pada penelitian tersebut ditemukan virus Dengue serotipe 2, 3 dan 4 (DEN 2, DEN 3, dan DEN 4) di Sumatera Utara. Hasil penelitian Depkes tersebut dapat dilihat pada gambar peta penyebaran serotipe virus Dengue di Indonesia yang ditemukan di 19 kota di bawah ini.

Penelitian yang dilakukan oleh Depkes tersebut juga menggunakan sampel penelitian dari serum penderita DD/DBD. Sama dengan sampel penelitian yang dilakukan oleh peneliti. Perbedaan hasil yang didapat dari penelitian tentunya menimbulkan berbagai pertanyaan, apakah karena waktu penelitian yang berbeda, sampel yang berbeda atau keparahan penyakit yang ditimbulkan oleh masing-masing serotipe berbeda sehingga pada penelitian ini tidak terdeteksi adanya infeksi virus Dengue serotipe 3 dari serum penderita.

Banyak faktor yang mempengaruhi kejadian DD/DBD, antara lain faktor hospes, lingkungan dan faktor virus sendiri. Faktor hospes adalah kerentanan dan respon imun, faktor lingkungan yaitu kondisi geografis (ketinggian dari permukaan laut, curah hujan, angin, kelembaban, musim), kondisi demografis (kepadatan, mobilitas, perilaku, adat istiadat, sosial ekonomi penduduk), serta jenis dan kepadatan nyamuk sebagai vektor penular penyakit (Hariadhi, 2004). Kondisi demografis berhubungan dengan mobilitas dan perilaku penduduk. Penelitian yang dilakukan oleh Setya B, dari Universitas Airlangga mendapatkan bahwa kota-kota besar seperti Jakarta, Surabaya, Medan, Makassar, dan Manado di mana mobilitas penduduk tinggi lebih sering dijumpai adanya infeksi sekunder virus Dengue. Adanya infeksi sekunder menunjukkan adanya serotipe virus baru yang menginfeksi orang yang sama (Setya B, 2007).

Hal ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut apakah ada hubungan keberadaan infeksi sekunder di suatu daerah tertentu berpengaruh terhadap munculnya serotipe virus tipe yang baru di daerah tersebut.

Data dari berbagai penelitian dibeberapa negara menggambarkan suatu keunikan, di mana masing-masing serotipe virus Dengue akan memicu terjadinya wabah atau KLB berdasarkan kondisi geografis dan periode waktu yang berbeda (Hariadhi, 2004).

Hasil penelitian yang negatif, bukan berarti serum-serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan tidak mengandung virus Dengue, akan tetapi karena primers yang digunakan hanya primers untuk DEN 3,

maka yang terdeteksi hanya virus Dengue serotipe 3 (DEN 3), tidak menutup kemungkinan adanya virus Dengue tipe yang lain apabila dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan primers untuk DEN virus yang lainnya.

Diperkirakan lebih kurang 100 juta kasus Demam Dengue dan 500 ribu kasus Demam Berdarah Dengue terjadi setiap tahunnya di seluruh dunia, di mana 90% dari kasus-kasus tersebut menyerang anak-anak di bawah umur 15 tahun (Hadinegoro, et al, 2006). Berbeda dengan penelitian ini karena di sini dijumpai dari serum penderita dengan kelompok umur Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue terbanyak pada rentang usia 15-45 tahun yaitu 60 orang (60,0 %).

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

VI.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian pada 100 serum penderita Demam Dengue dan Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan dari beberapa Rumah Sakit di Kota Medan yaitu Rumah Sakit Pirngadi, Rumah Sakit H. Adam Malik, dan Rumah Sakit Herna, Setelah diekstraksi dan di RT-PCR tidak ada dijumpai (negatif) serum yang mengandung virus serotipe 3 (DEN 3).

VI.2 Saran

Berdasarkan kesimpulan yang telah diuraikan, maka dapat diusulkan saran-saran sebagai berikut:

1. Perlu dilakukan penelitian untuk mendeteksi virus Dengue lainnya seperti DEN 1, DEN 2, dan DEN 4).

2. Perlu penentuan virus Dengue dalam manajemen pasien Demam Dengue/Demam Beradarah Dengue untuk mempermudah pencapaian program pemberantasan penyakit Deman Dengue/Deman Berdarah Dengue.

DAFTAR PUSTAKA

Chow, V. T, Chan, Y. C, Yong, R. et al, (1998). Monitoring of Dengue Viruses in Field Cought Aedes Aegypti and Aedes Albopictus by A Type-Specific PCR and Cycle Squencing, American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 58(5): 578-586.

Darmowandowo,W. (2006). Kuliah Infeksi Virus Dengue. Naskah lengkap disajikan dalam Continuing Education Ilmu Kesehatan Anak XXXVI. Fakultas Kedokteran Unair. Surabaya. 29–30 Juli 2006.

Hadinegoro, S et al, (2006). Tata Laksana Demam Berdarah Dengue di Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Hal. 2 – 19.

Halstead, S. B. & Deen, J. (1969). The Future of Dengue Vaccines. Lancet 360, 1243-1245.

Handrawan N, (2007). Cara Mudah Mengalahkan Demam Berdarah. Kompas. Jakarta. Hal. 17-18.

Hariadhi, S, Soegijanto, S. (2004). Pola Distribusi Serotipe Virus Dengue pada

Beberapa Daerah Endemik di Jawa Timur dengan Kondisi Geografis Berbeda, Hal. 11-19.

Harris, E; Robert, T. G; Smith, L; Selle, J et al. (1998). Typing of Dengue Viruses in Clinical Specimen and Mosquitoes by Single-Tube Multiplex Reverse

Transcriptase PCR. Journal of Clinical Microbiology. Sept. 1998. p. 2634 –

9.

Kristina,Isminah,Wulandari L. (2004) Kasus Demam Berdarah Dengue (DBD)

di Indonesia. Wahono TD (Ed). Buletin Harian. Tim Penanggulangan DBD

Departemen Kesehatan RI, 2004.

Kusumawati, Lia. (2005) Teori Sequential Infection dari Halstead (online). http://www.library.usu.ac.id/download/fk/mikrobiologi/pdf.

Massi, M. N; Sabran, A. (2006). Teknik Identifikasi Serotipe Virus Dengue (DEN 1 -

4) dengan Uji Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).

Miagostovich, M.P.et al, (2001). Genetic characterization of Dengue virus type 3 isolate in the state of Rio de Janeiro. Brazillian journal of medical and

Biological Research (2002) 35 : 869-872.

Nisalak A, Endy TP, Nimmannitya S, Kalayanarooy S, Thisayakorn U, Scott RM, Burke DS, Hoke CH, InnisBL, Vaughn DW, (2003), Serotype-spesific Dengue Virus Circulation and Dengue Disease in Bangkok, Thailand from 1973 to 1999. Am J Trop Med Hyg; 68 (2) : 191-202.

Setya, B. (2007). Profil Serologis Infeksi Primer dan Sekunder Virus Dengue dari

Berbagai Daerah di Jawa Timur. Post Graduate Airlangga University

(E-mail: http://library@lib.unair.ac.id; library@unair.ac.id).

Singh Kamaljit, et al, (2006). A prospective Clinical study on the use of reverse

transcription polymerase chain reaction for the early diagnosis of Dengue

Fever, The Journal of Molecular Diagnostics. Vol 6 No 5.

Siregar, A. F, (2004). Epidemiologi dan Pemberantasan Demam Berdarah Dengue

di Indonesia. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sumatera Utara.

Sopian, T, (2006). Aplikasi Teknologi PCR mendeteksi Flu Burung

(http://64.203.71.11/kompas-cetak), 17 Mei 2008.

Suroso, (1999). Epidemiological situation of Dengue Haemorrhagic Fever and its Control Indonesia. Proceeding InternationalSeminar on Dengue Fever/

Dengue Haemorrhagic. TDC- Airlangga University, Surabaya.p. 11-4.

Sudjadi, (2008). Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Hal. 94 –

99 dan 131 - 43.

World Health Organization Regional Office for South-East Asia, (1997).

Management of Dengue Epidemic. Report of A Technical Meeting, SEARO,

New Delhi, 28 – 30 November 1996.

Yulfi. H, (2006). Persistency of Transsovarian Dengue Virus in Aedes Aegypti (on

line) (http : // library.usu.ac.id/down load/fk/pdf).

Yuwono, D. (2001). Hubungan Antara Genotup Virus Dengue dengan Severity

Penyakit Berdasarkan Respon Imun Selularnya. Pusat Penelitian Penyakit

Menular, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI. Jakarta.

Lampiran 1. Contoh Formulir Data Pasien Formulir Pemeriksaan Kasus DD/DBD

I. Informasi Umum

Nama Lengkap : Umur :

Jenis Kelamin : pria wanita Alamat :

Pekerjaan :

II. Hasil Laboratorium 1. Laboratorium Rutin

- Leukosit < 5.000 sel/ml3 ya tidak - Trombosit < 100.000 sel ya tidak - Hemokonsentrasi > 20% ya tidak

2. Laboratorium Penunjang - Rapid Test IgM ya tidak

Lampiran 2. Deteksi dan penentuan virus Dengue serotipe 3 dari spesimen klinik di Rumah Sakit Kota Medan dengan menggunakan Metode RT-PCR

SAMPEL RUMAH SAKIT UMUR JNS KEL DEN 3 (+) DEN 3 (-)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS HAM RS HAM RS H RS H RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS PR RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS H RS H RS H RS PR RS H RS PR 6 11 9 8 11 18 58 18 14 16 17 20 20 15 12 38 1,5 24 29 45 11 9 13 5 9 21 44 23 22 39 17 9 18 19 21 25 28 LK PR LK PR PR LK LK LK LK PR LK LK PR LK LK PR LK PR PR PR LK LK PR PR PR PR LK PR PR LK LK PR PR PR LK LK LK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS HAM RS H RS PR RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS HAM RS PR RS PR RS H RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS H RS HAM RS H RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS H RS HAM 32 25 19 29 31 41 21 49 21 21 30 41 3 14 15 40 9 16 19 30 9 30 41 9 21 21 22 11 44 12 44 16 6 10 8 4 6 5 43 25 16 7 LK LK LK LK LK PR PR LK PR PR PR LK PR LK PR LK PR PR LK PR PR LK LK PR PR PR PR LK PR PR PR LK PR PR LK LK PR LK LK LK LK LK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 RS HAM RS HAM RS HAM RS H RS PR RS H RS H RS H RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM 8 11 6 44 82 29 24 44 39 10 21 10 11 12 16 17 20 23 17 30 11 LK LK PR LK LK LK PR LK PR PR PR LK LK PR PR PR LK LK LK PR LK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Lampiran 3. Rencana Kegiatan Penelitian

September Oktober Nopember Desember Januari

No Kegiatan

I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV

1 Pengumpulan

Serum penderita.

2 Ekstraksi.

3 RT-PCR

dengan menggunakan

PrimersDEN 3.

4 Elektroforesis

dan Visualisasi.

Miagostovich, M.P.et al, (2001). Genetic characterization of Dengue virus type 3 isolate in the state of Rio de Janeiro. Brazillian journal of medical and

Biological Research (2002) 35 : 869-872.

Nisalak A, Endy TP, Nimmannitya S, Kalayanarooy S, Thisayakorn U, Scott RM, Burke DS, Hoke CH, InnisBL, Vaughn DW, (2003), Serotype-spesific Dengue Virus Circulation and Dengue Disease in Bangkok, Thailand from 1973 to 1999. Am J Trop Med Hyg; 68 (2) : 191-202.

Setya, B. (2007). Profil Serologis Infeksi Primer dan Sekunder Virus Dengue dari

Berbagai Daerah di Jawa Timur. Post Graduate Airlangga University

(E-mail: http://library@lib.unair.ac.id; library@unair.ac.id).

Singh Kamaljit, et al, (2006). A prospective Clinical study on the use of reverse

transcription polymerase chain reaction for the early diagnosis of Dengue

Fever, The Journal of Molecular Diagnostics. Vol 6 No 5.

Siregar, A. F, (2004). Epidemiologi dan Pemberantasan Demam Berdarah Dengue

di Indonesia. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Sumatera Utara.

Sopian, T, (2006). Aplikasi Teknologi PCR mendeteksi Flu Burung

(http://64.203.71.11/kompas-cetak), 17 Mei 2008.

Suroso, (1999). Epidemiological situation of Dengue Haemorrhagic Fever and its Control Indonesia. Proceeding InternationalSeminar on Dengue Fever/

Dengue Haemorrhagic. TDC- Airlangga University, Surabaya.p. 11-4.

Sudjadi, (2008). Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Hal. 94 – 99 dan 131 - 43.

World Health Organization Regional Office for South-East Asia, (1997).

Management of Dengue Epidemic. Report of A Technical Meeting, SEARO,

New Delhi, 28 – 30 November 1996.

Yulfi. H, (2006). Persistency of Transsovarian Dengue Virus in Aedes Aegypti (on

line) (http : // library.usu.ac.id/down load/fk/pdf).

Yuwono, D. (2001). Hubungan Antara Genotup Virus Dengue dengan Severity

Penyakit Berdasarkan Respon Imun Selularnya. Pusat Penelitian Penyakit

Menular, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI. Jakarta.

p d fMachine

A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease!

Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the

“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it! Get yours now!

Lampiran 1. Contoh Formulir Data Pasien Formulir Pemeriksaan Kasus DD/DBD

I. Informasi Umum Nama Lengkap :

Umur :

Jenis Kelamin : pria wanita Alamat :

Pekerjaan :

II. Hasil Laboratorium 1. Laboratorium Rutin

- Leukosit < 5.000 sel/ml3 ya tidak - Trombosit < 100.000 sel ya tidak - Hemokonsentrasi > 20% ya tidak

2. Laboratorium Penunjang - Rapid Test IgM ya tidak

Lampiran 2. Deteksi dan penentuan virus Dengue serotipe 3 dari spesimen klinik di Rumah Sakit Kota Medan dengan menggunakan Metode RT-PCR

SAMPEL RUMAH SAKIT UMUR JNS KEL DEN 3 (+) DEN 3 (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS HAM RS HAM RS H RS H RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS PR RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS H RS H RS H RS PR RS H RS PR 6 11 9 8 11 18 58 18 14 16 17 20 20 15 12 38 1,5 24 29 45 11 9 13 5 9 21 44 23 22 39 17 9 18 19 21 25 28 LK PR LK PR PR LK LK LK LK PR LK LK PR LK LK PR LK PR PR PR LK LK PR PR PR PR LK PR PR LK LK PR PR PR LK LK LK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

p d fMachine

A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease!

Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the

“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it! Get yours now!

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 RS PR RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS PR RS H RS HAM RS H RS PR RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS HAM RS PR RS PR RS H RS H RS H RS PR RS PR RS PR RS H RS HAM RS H RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS H RS HAM 32 25 19 29 31 41 21 49 21 21 30 41 3 14 15 40 9 16 19 30 9 30 41 9 21 21 22 11 44 12 44 16 6 10 8 4 6 5 43 25 16 7 LK LK LK LK LK PR PR LK PR PR PR LK PR LK PR LK PR PR LK PR PR LK LK PR PR PR PR LK PR PR PR LK PR PR LK LK PR LK LK LK LK LK - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100

RS HAM RS HAM RS HAM RS H RS PR RS H RS H RS H RS PR RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM RS HAM

8 11

6 44 82 29 24 44 39 10 21 10 11 12 16 17 20 23 17 30 11

LK LK PR LK LK LK PR LK PR PR PR LK LK PR PR PR LK LK LK PR LK

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

p d fMachine

A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease!

Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the

“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it! Get yours now!

Lampiran 3. Rencana Kegiatan Penelitian

September Oktober Nopember Desember Januari

No Kegiatan

I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV

1 Pengumpulan

Serum penderita.

2 Ekstraksi.

3 RT-PCR

dengan menggunakan

PrimersDEN 3.

4 Elektroforesis

dan Visualisasi.