Deteksi Dan Penentuan Virus Gengue Serotpe 1 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Shain Reaction

(1)

DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS GENGUE SEROTPE 1

DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM

BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN

MENGGUNAKAN REVERSE TRANSCRIPTASE

POLYMERASE SHAIN REACTION

TESIS

Oleh

RONALD TAMBUNAN

067027008/IKT

K O L A H

P A

S C

A S A R JA NA

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009

(2)

DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS GENGUE SEROTPE 1

DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM

BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN

MENGGUNAKAN REVERSE TRANSCRIPTASE

POLYMERASE SHAIN REACTION

TESIS

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Magister Kedokteran Tropis dalam

Program Studi Ilmu Kedokteran Tropis pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

RONALD TAMBUNAN

067027008/IKT

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2009

(3)

Judul Tesis : DETEKSI DAN PENENTUAN VIRUS GENGUE SEROTPE 1 DARI SERUM PENDERITA DEMAM DENGUE/DEMAM BERDARAH DENGUE DI RUMAH SAKIT KOTA MEDAN MENGGUNAKAN

REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE SHAIN REACTION

Nama Mahasiswa : Ronald Tambunan

Nomor Pokok : 067027008

Program Studi : Ilmu Kedokteran Tropis

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Prof.dr. Herman Hariman, Ph.D,SpPk,(K)KH) Ketua

(dr.R.Lia Kusumawati, MS,SpMK) (Drs. Abdul Jalil Amri Arma,M.Kes)

Anggota Anggota

Ketua Program Studi Direktur

(Prof.Dr.Ir.Syahril Pasaribu,DTM&H,M.Sc,(CTM,SpA(K) (Prof.Dr.Ir.T.Chairun Nisa B., M.Sc)

(4)

Telah diuji pada

Tanggal : 17 Februari 20009

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. dr. Herman Hariman,Ph.D,Sp.Pk(K) KH

Anggota : 1. dr.R. Lia Kusumawati, MS,Ps.MK

2. Drs. Abdul Jalil Amri Arma, M.Kes

3. Dr.dr.Rosihan Anwar, DMM,MS,Sp.MK,M.Pd,DK 4. dr. Yosia Ginting, Sp.PD(K)KPTI

(5)

ABSTRAK

Infeksi virus Dengue masih merupakan masalah kesehatan yang serius di banyak daerah tropis dan subtropis, di seluruh dunia. Penyakit yang masih menjadi masalah oleh karena hiperendemisitasnya di Wilayah Asia Tenggara. Virus Dengue, berdasarkan antigennya, virus Dengue dibagi menjadi empat serotipe: DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4. Semua serotipe ini dapat ditemukan di Indonesia. Di kota Medan, Propinsi Sumatera Utara, penyakit ini masih merupakan masalah kesehatan yang sulit untuk ditangani, karena sampai hari ini, frekuensi serotipe – serotipe virus ini, masih belum diketahui. Penelitian ini ditujukan untuk menggambarkan frekuensi virus Dengue serotipe 1 di kota Medan, untuk membantu mendiagnosis dari penyakit tersebut. Seratus buah sampel plasma penderita DF/DHF diambil, kemudian diperiksa dengan teknik molekuler Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR), guna menentukan serotipe virus secara cepat, akurat, dan spesifik. Hasilnya, dari 100 buah sampel yang diperiksa, 2% positif virus Dengue serotipe 1 (DEN 1). Penelitian yang dilakukan oleh Departemen Kesehatan (2003-2005) menghasilkan identifikasi DEN 2, 3, dan 4 di Sumatera Utara, tapi tidak ada DEN1, maka penelitian ini dapat menjadi sebuah pengetahuan baru mengenai peta penyebaran virus Dengue serotipe 1, khususnya di kota Medan. Sebagai saran, masih diperlukan penyelidikan lebih lanjut dan lebih dalam mengenai virus DEN 1, mengingat masih sedikitnya informasi mengenai virus ini di Indonesia, supaya dapat membantu masyarakat dalam menekan morbiditas dan mortalitas penyakit tersebut di masa yang akan datang.

(6)

ABSTRACT

Dengue virus infection is still a serious health problem in many tropical and subtropical regions worldwide. The mainstay problem is that is hyperendemic in South-East Asian Region. Dengue virus based on is antigens, can be dividend into four serotypes DEN 1, DEN 2, DEN 3, and DEN 4. All of these serotype can be found in Indonesia. In the city of Medan, North Sumatera Provinsi, this disease is still a health problem that is difficult to be dealt, because until today the frequency of the virus serotype remains unknown. The reseach is aimed to describe the frequency of serotypes 1 dengue virus in Medan, especially for helping in diagnosing of this disease. One hundred samples of DF/DHF human plasma were taken, the measured with molecular technique Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) in order to defemine the virus serotype, rapidly, accurately, and specifically, the result is, from 100 samples, that had undergone the test, 2% are positive Dengue virus serotype 1 (DEN 1). The research conducted by health department (2003-2005) resulting inDEN 2, 3 and 4 identification in North Sumatera, but zero finding of DEN 1 thus, this research can be a new archive in the Dengue virus serotype I spreading map in Indonesia, especially in Medan. For recommendation there is a need for further and deep investigation about DEN 1 virus, consider minimal information in Indonesia, thus all of those studies, can help everyone to decrease morbidity and mortality rate of this disease in the future.

Key words: DEN 1 virus, Human plsma, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

(7)

KATA PENGANTAR

Puji Tuhan atas segala rahmatNya sehingga penulis dapat menyelesaikan Tesis ini dengan baik.

Dalam proses penyelesaian Tesis ini sepenuhnya penulis menyadari telah banyak mendapat dukungan dan bimbingan dari banyak pihak, untuk itu dalam kesempatan ini penulis tak lupa mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Prof. Dr. A.A.P. Depari,DTM&HSp.ParK dan dr. Endang Haryati Gani yang dengan kebaikan hari mereka bersedia merekomendasikan saya agar dapat diterima sebagai Mahasiswa di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

2. Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof.Chairuddin P.Lubis, DTM&H, Sp.A(K) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada kami untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan Program Magister.

3. Direktur Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang dijabat oleh Prof.Dr. Ir. T. Chairun Nisa B., M.Sc atas kesempatan yang diberikan menjadi Mahasiswa Program Magister Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.

4. Ketua Program Studi Magister Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara yang dijabat oleh Prof. Dr.dr.H.Syahril Pasaribu, DTM&H, M.Sc(CTM) Sp.A(K) beserta jajarannya, atas kesempatan, bimbingan serta petunjuk salam saya menjadi Mahasiswa.

5. Prof. Dr. Herman Hariman, Ph.D, Sp.PK (K) KH selaku pembimbing utama yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran ditengah-tengah kesibukan beliau yang padat.

6. dr.R.Lia Kusumawati, MS, SpMK selaku pembimbing dan Sekretaris Program Studi Ilmu Kedokteran Tropis, yang dengan sabar dan tulus telah mendukung penulis untuk dapat melewati masa-masa sulit dalam penelitian.

(8)

7. Drs. Abdul Jalil Amri Arma, M.Kes selaku pembimbing dan konsultan statistic deimana dalam kesibukan yang luar biasa padatnya sempat memberikan bantuan secara serius santai sehingga Tesis dapat terselesaikan. 8. Dr. dr. Rosihan Anwar, DMM, MS, M.Pd, DK selaku Dosen Pembanding dan

penguji Tesis ini, sangat banyak memberi masukan dan selalu menjadi teladan bagi penulis.

9. dr. Yosia Ginting, Sp.PD (K) KPTI selaku dosen pembanding saat seminar proposal. Beliau memberi ilmu dengan tulus dan tak kenal lelah. Semoga ilmu yang telah diberikannya dapat bermanfaat bagi penulis dan beliau mendapat pahala atas ilmunya.

10. Rekan seperjuangan di Program Studi Ilmu Kedokteran Tropis Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara, angkatan III yang telah bersama-sama selama 2 tahun lebih, membagi informasi, berbagi suka duka dalam kebersamaan dan persahatan.

11. Terima kasih dan saying kepada Ayahanda Semi Ramot Tambunan dan Ibunda Ratna Pardede yang selalu mendokan dan mendukung penulis dengan penuh kasih saying. Buat saudar/I ku Vivanda Kristina Mawan, Rose Meity Dame Grace, Dumasih Romauli Evelina, dan Andriani Nehemia , semoga kita selalu menghargai ilmu pengetahuan dan menjadikan ilmu sebagai landasan dalam bersikap dan berbuat. Menjadi manusia yang cinta ilmu dan mulia karena memiliki ilmu.

12. Teima kasih buat semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu. Semoga kebaikan yang anda perbuat mendapat imbalan di kemudian hari kelak.

Semoga Tesis ini bermanfaat bagi yang memerlukan.

Medan, Februari 2009

(9)

RIWAYAT HIDUP

Nama Lengkap : Ronald Tunggal Hotmarojahan Tambunan Tempat/Tanggal Lahir : Jakarta, 06 September 1978

Sebagai anak kelima dari Semi Ramot Tambunan dan Ratna Pardede

Alamat : Jl. Rajawali Timur III Rt. 001/008, Kelurahan Rajawali Kecamatan Pancoran, Kalibata No. 1, Jakarta Selatan

Riwayat Pendidikan

1. Tahun 1985 – 1991 : SD Tarakanita II, Kebayoran Baru, Jakarta Selatan 2. Tahun 1991 – 1994 : SMP Tarakanita I, Kebayoran Baru, Jakarta Selatan 3. Tahun 1994 – 1997 : SMU Santo Antonius, Jakarta Timur

4. Tahun 1997 – 2004 : Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Indonesia, Cawang, Jakarta Timur.

Riwayat Pekerjaan

1. Tahun 2004 – 2005 Dokter asisten bagian Ilmu Penyakit Dalam di Rumah Sakit Umum Fakultas Kedokteran Kristen Indonesia, Cawang, Jakarta Timur. 2. Tahun 2005 sampai sekarang sebagai dosen tetap Yayasan Pendidikan Gereja

Methodist Indonesia di bagian neorologi Fakultas Kedokteran Universitas Methodist Indonesia, Medan, Sumatera Utara

3. Bulan Agustus 2006 mengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara Program Studi Magister Ilmu Kedokteran Tropis

(10)

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ……… i

ABSTRACT ……….. ii

KATA PENGANTAR ……….. iii

RIWAYAT HIDUP ……… v

DAFTAR ISI ………. vi

DAFTAR TABEL ……… viii

DAFTAR GAMBAR ……… ix

DAFTAR LAMPIRAN ……… x

DAFTAR SINGKATAN ……….. xi

BAB I PENDAHULUAN ……… 1

I.1 Latar Belakang ……… 1

I.2 Perumusan Masalah ……… 4

I.3 Tujuan Penelitian ………. 4

I.3.1 Tujuan Umum ……… 4

I.3.2 Tujuan Khusus ……… 4

I.4 Manfaat ……… 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ……… 6

II.1 Virus Dengue ………. 6

II.2 Vektor Penyakit ………. 7

II.3 Manifestasi Klinik Infeksi Virus Dengue ………... 8

II.3.1 Demam Dengue ……… 9

II.3.2 Demam Berdarah Dengue ……… 9

II.3.3 Sindrom Syol Dengue ……… 10

II.4 Diagnosis DD dan DBD ………. 11

(11)

II.4.2 Uji ELISA anti Dengue ……… 12

II5 RT-PCR ………... 13

II.5.1 Sejarah RT-PCR ………... 13

II.5.2 Penggunaan PCR ………. 14

II.5.3 Prosedur ……… 14

II.5.4 Reverse Transcription ………... 16

BAB III METODE PENELITIAN ……….. 18

III.1 Rancangan Penelitian ……… 18

III.2 Tempat dan Waktu ……… 18

III.3 Bahan dan Cara Kerja ……….. 18

III.3.1 Kerangka Operasional ……….. 20

III.3.2 Ekstraksi RNA ……….. 20

III.3.2.A Peralatan ……….. 21

III.3.2.B Ekstraksi Virus RNA ……….. 22

III.3.2.C Ekstraksi ………. 23

III.3.3 RT-PCR ……….. 24

III.3.4 Elektroforesis ………. 25

III.3.5 Gel Imaging ……… 26

BAB IV HASIL PENELITIAN ……… 27

BAB V PEMBAHASAN ……… 33

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ……… 38

V.1 Kesimpulan ……… 38

V.2 Saran ………... 38

(12)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1. Serum Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan ……… 27 2. Gambaran serum Demam Berdarah Dengue yang mengandung DEN 1

berdasarkan asal Rumah Sakit ……… 31 3. Gambaran Serum Demam Berdarah Dengue yang mengandung DEN 1

(13)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Hasil RT-PCR control positif ……… 28 2. Hasil RT-PCR 1 sampai 100 ………. 29 3. Peta Penyebaran Serotipe Virus Dengue di 19 kota di Indonesia ………. 37

(14)

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Contoh Formulir Data Pasien ……….. 41 2. Hasil RT-PCR Virus dengue tipe 1 (DEN 1) dari specimen klinik di

Rumah Sakit Kota Medan ……… 42 3. Rencana Kegiatan Penelitian ……… 45

(15)

DAFTAR SINGKATAN

AMV : Avian Myloblastosis Virus Arborvirus : Arthropodborne Virus Bp : Base pairs

DBD : Demam Berdarah Dengue DD : Demam Dengue

DKI : Daerah Khusus Ibukota

DEN : Dengue

DENV : Dengue Virus

DEPKER RI : Dapertemen Kesehatan Republik Indonesia cDNA : complement DNA

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

ELISA : Enzym Linked Imunosorbent Assay

EWORS : Early Warning Outbreak Recognition System HI : Hemaglutinasi Inhibisi

Ig : Immunoglobulin

IR : Incidence Rate

Kb : Kilo Basa kDa : kilo Dalton

KLB : Kejadian Luar Biasa

Lab : Laboratorium

Ml : Mililiter

Protein C : Protein Core Protein E : Protein Envelope Protein – M : Protein Membrane RNA : Ribo Necleic Acid

RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SGOT : Serum Glutamat Oxalat Transiminase

SGPT : Serum Glutamat Piruvat \Transiminase SSD : Sindrom Syok Dengue

TDC : Tropical Desease Center WHO : World Health Organization

(16)

ABSTRAK

(17)

ABSTRACT

Key words: DEN 1 virus, Human plsma, Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

(18)

BAB I PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Infeksi oleh virus Dengue (DENV) masih tetap menjadi masalah kesehatan yang serius di banyak daerah tropis dan subtropics di dunia. Penyakit yang dalam penyebarannya diperantari oleh faktor nyamuk Aedes aegypty dan Aedes albopictus betina ini, merupakan hiperendemis di Asia Tenggara, dengan manifestasi Demam Dengue (DD) dan bentuk yang paling berbahaya berupa Deman Berdarah Dengue (DBD) dan Sindrom Syok Dengue (SSD) yang biasanya bersifat fatal, terutama pada anak-anak. Diperkirakan lebih kurang 100 juta kasus deman Dengue dan 500 ribu kasus DBD terjadi tiap tahunnya diseluruh dunia, 90% dari kasus-kasus tersebut menyerang anak-anak di bawah 15 tahun (Yulfi,2006).

Virus dengue termasuk kelompok B arghopod borne virus (arbovirus). Sekarang dikenal sebagai genus Flavivirus, famili Flaviviridae, dan sampai saat ini virus dengue berdasarkan berpedaan antigennya dibagi menjadi empat serotype, yaitu: DEN 1, DEN 2, Denn 3, DEN 4 (DEPKES RI, 2004) Virus yang banyak berkembang di masyarakat adalah serotype 1 dan tipe 3 (Handinegoro, 2004)

Infeksi virus Dengue telah ada di Indonesia sejak abad ke 18, seperti yang dilaporkan oleh David Bylon (1779), seorang dokter berkebangsaan Belanda, yang menyatakan bahwa infeksi virus ini merupakan penyakit ringan yang dulunya disebut sebagai penyakit demam lima hari (viif daage korts) atau kadangkala disebut knokkel

(19)

koortz (knee trouble/masalah lutut) yang tidak menimbulkan kematian. Pertama kali ditemukan oleh Quointos di Filifina tahun 1953, kemudian disusul Negara – Negara lain seperti Thailand dan Vietnam (Suroso, 2004). Di Indonesia, kasus DBD pertama kali dilaporkan pada tahun 1968 di Surabaya, yang kemudian menyebar ke Jakarta (1969), Bandung dan Yogyakarta serta Sumatera Barat dan Lampung (1972), Riau, Sulawesi Utara, dan Bali (1973), Kalimantan Selatan dan Nusa Tenggara Barat (1974). Angka kesakitan rata-rata terus meningkat dari 0,05 pada tahun 1968 sampai 27,09 per 100.000 penduduk pada tahun 1988 (Sudarmo, 2004) Kasus DD dan DBD selalu berulang setiap tahun. Profil Indonesia pada tahun 2001, Incidence Rate (IR) dari penyakit ini sebesar 17,2 kasus per 100.000 penduduk setiap tahunnya. Pada bulan Januari sampai dengan Maret 2004, total kasus DBD di seluruh Indonesia adalah 26.015 (1,53%) (Hadinegoro, 2004).

Petogenesis DBD dan SSD hingga kini masih belum diketahui pasti, teori yang banyak dianut adalah Secondry Heterologous Infection Hyphotesis dari Halstead (1969), dimana dinyatakan bahwa pasien yang mengalami infeksi kedua kalinya dengan serotype virus yang berbeda mempunyai resiko yang lebih besar menderita DBD. Hal ini disebabkan karena adanya antibody heterolog yang telah ada sebelumnya akan membentuk kompleks antigen antibody, selanjutnya akan mengaktifkan sistem komplemen yang menyebabkan peningkatan permeablitas dinding pembuluh darah dan menyebabkan terjadinya ekstravasasi dari intravascular ke ekstravaskular (Sutaryo, 2004).

(20)

Sangat penting untuk menentukan virus dengue serotype apa yang berkembang di suatu tempat dan pada waktu tertentu, karena satu dari empat serotype virus dengue tersebut dapat menjadi factor resiko penting untuk berkembang menjadi DBD dan SSD bila terjadi infeksi dari virus dengan serotipe berbeda (Haris,et al, 1998). Pengawasan terhadap virus (virolugic surveillance) telah digunakan sebagai peringatan dini (Early Warning Outbreak Recognition System (EWORS) untuk memperkirakan timbulnya epidemic (DEPKES RI, 2004).

Di Indonesia, kasus DD dan DBD selalu berulang setiap tahun. Di kota Medan, penyakit ini juga masih merupakan masalah kesehatan yang sukar diatasi karena penderita selalu ditemukan sepanjang tahun serta belum diketahui serotype apa yang berkembang di masyarakat kota Medan. Untuk membantu mendiagnosis penyakit ini, maka digunakan teknik molekuler Reverse Transcriptase, PCR (RT-PCR) yang dapat menentukan serotype virus dengue secara cepat, tepat, dan spesifik. Penelitian serveilans epidemiologi di seluruh Indonesia untuk kempat serotipe virus Dengue dengan penggunakan RT-PCR, pernah dilakukan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia (DEPKES RI) dari tahun 2003-2005. Akan tetapi, penelitian tentang serotipe virus Dengue, khusunya virus Dengue tipe 1 (DEN 1) di kota Medan sendiri belum pernah dilakukan. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini dengan bahan penelitian diambil dari serum penderita DD dan DBD, dengan harapan peneliti yang lain melanjutkan penelitian ini dengan mencari serotipe virus Dengue lainnya.

(21)

I.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang diatas, maka dapat dirumuskan masalah sebagai berikut: Belum diketahuinya Frekuensi virus Dengue serotipe 1 DEN 1) pada serum penderita DD dan DBD di kota Medan.

I.3 Tujuan Peleitian I.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui frekuensi virus Dengue serotipe 1 (DEN 1) pada serum penderita Demam Berdarah di kota Medan

I.3.2 Tujuan Khusus

1. Untuk mengetahui frekuensi penderita DD/DBD anak dan dewasa virus Dengue serotipe 1 (DEN 1) berdasarkan jenis kelamin dan umur.

2. Mengetahui keberadaan virus Dengue serotipe 1 (DEN 1) di kota Medan berdasarkan umur dan jenis kelamin.

I.4 Manfaat

1. Dengan ini diharapkan peneliti mendapatkan data base frekuensi virus Dengue serotipe 1 (DEN 1) dari serum penderita DD/DBD di kota Medan 2. Menambah informasi tentang penderita DD/DBD virus Dengue serotipe 1

(22)

BAB II

TINJUAN PUSTAKA

II.1 Virus Dengue

Virus Dengue merupakan salah satu virus yang termasuk dalam famili Flavividae. Virion Dengue merupakan partikel sferis dengan diameter nukleokapsid 30nm dan ketebalan selubung 10 mm, sehingga diameter virion kira-kira 50 nm. Genon virus Dengue terdiri dari asam ribonuleat berserat tunggal , panjangnya kira-kira 11 kilibasa. Genon terdiri dari protein structural dan protein non structural, yaitu gen C mengkode sintesa nukleokapsid (Capsid), gen M mengkode sintesa protein M (Membran) dangan E mengkode sentesa glikoprotein selubung (Envelope) (Levinson, 2000).

Virus Dengue adalah virus dengan untaian tunggal, virus RNA (famili Flaviviridae) yang muncul dengan empat serotype antigen yang berbeda. Setiap serotype secara genetik memiliki perbedaan. Meskipun infeksi secara umum (terutama infeksi primer) simtomatik sama, seluruh tipe virus ini berhubungan dengan demam Dengue, dan demam adalah gejala minor. Infeksi primer menghasilkan imunitas jangka panjang terhadap infeksi sekunder dengan serotype lainnya. Hal ini meningkatkan dalam resiko kebanyakan hasil dari reaksi silang antibodi dan sel T yang meningkatkan tingkat infeksi dan secara langsung melibatkan patifisiologi demam berdarah Dengue (Carrington et al., 2005).

(23)

Genus Flavivirus (famili Flaviviridae) terdiri dari lebih kurang mendekati 70 untaian tunggal, virus RNA. Virion berukuran mendekati 50nm dan memiliki 3 struktur protein, yang lebih besar berukuran 49 dan 16,5 kDa protein yang mengalami glikosidasi dan berhubungan dangan envelop, di mana yang lebih kecil berukuran 13 kDa protein yang berukuran 16,5 kDa lebih besar dari yang terlihat secara khusus pada Flavivirus (Carrington et al., 2006).

ІІ.2. Vektor Pnyakit

Infeksi DD/DBD dapat ditularkan pada manusia melalui gigitan vector nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus betina (Husaini, 2003).

Di Indonesia, nyamuk ini tersebar di seluruh Indonesia (terutama pada musim penghujan), kecuali di daerah pada ketinggian di atas 1000m dari permukaan laut. Nyamuk betina mengisap darah vertebrata sedangkan nyamuk jantan menghisap air madu atau air gula. Bila sudah dewasa, nyamuk mempunyai sayap berwarna hitam, badan dan kaki berbercak putih, lalu bertelur di mana saja di wadah-wadah penampungan air. Nyamuk ini mempunyai jarak terbang kira-kira 50 m dan menggigit terutama siang hari, di dalam rumah atau tempat-tempat yang tidak diterangi sinar matahari (DEPKES RI, 2004).

(24)

ΙΙ.3. Manifestasi Klinis Infeksi Virus Dengue

Infeksi virus Dengue sering salah diagnosa dengan penyakit lain seperti flu atau tifoid. Hal ini disebabkan karena infeksi virus Dengue biasa bersifat asimptomatik atau tidak jelas segalanya, dari tanpa gejala, demam ringan yang tidak spesifik, DD, atau bentuk yang lebih berat yaitu DBD dan SSD (Tumbelaka, 2004). BILA dibuat diagram, tampak sebagai berikut:

Infeksi virus Dengue

Asimptomatik Simptomatik

Undifferentiated fever Demam dengue: Tanpa perdarahan

Dengan perdarahan

Demam berdarah dengue : Tanpa Syok Dengue shock Syndrome

II 3.1 Demam Dengue

Demam dengue adalah pnyakit akut yang ditandai oleh panas 2-7 hari, disertai 2 atau lebih gejala klinik nerikut:

1) Sakit kepala 2) Nyeri retro orbital 3) Myalgia atau atralgia 4) Ruam

5) Manifestasi perdarahan, tourniquet test + dan petechiae 6) Leucopenia

(25)

Pada penderita anak-anak, demam dengue biasanya bermanifestasi ringan, sedang pada orang dewasa dapat disertai nyari berat pada tulang, persendian dan otot, serta pada masa konvalesens melalui priode prolonged fatique, kadang-kadang disertai depresi (Hadinegoro, 2004).

II.3.2. Demam Berdarah Dengue

Demam berdarah dengue adalah infeksi virus dengue dengan gejala seperti di atas, disertai:

a. Manifestasi perdarahan yang lebih nyata, seperti: 1) Uji tourniquet positif

2) Petchiae, echimosis atau purpura

3) Perdarahan mukosa, epistaktis atau perdarahan gusi b.Trombositopenia (≤100.000/mm3)

c. Kebocoran plasma disebabkan karena meningkatnya permeabilitas kapiler, dengan ditandai oleh:

1) Meningkatnya hematokrit ≤ 20%

2) Efusi pleura atau asites ( Hadinegoro, 2004).

II.3.3. Sindrom Syok Dengue

Sindrom Syok Dengue adalah manifestasi klinis demam berdarah dengue yang disertai tanda-tanda kegagalan sirkulasi berupa:

(26)

1. Penyempitan tekanan nadi (≤20mmHg) 2. Frekuensi nadi cepat dan kecil

3. Hipotensi 4. Akral dingin

Beberapa karakteristik manifestasi klinis infeksi Dengue sacara umum berupa: nyeri kepala 98%, lemah badan 88%, maul-muntah 84%, nyeri epigastrium 78%, nyeri sendi/otot 69%, petechie 64%, epistaktis/perdarahan gusi 36%, bercak darah (rash) 22%, nyeri retro orbital 17%, hepatomegali 14%, hematemesis/melena 14%, faringitis 12%, dan limfadenopati 12%,(Hadinegoro, 2004).

II.4. Diagnosa DD dan DBD

Untuk menegakkan diagnosa klinis infeksi virus dengue digunakan kriteria WHO 1997 yaitu dijumpainya demam tinggi dengan onset yang akut, hemokonsentrasi (>20%), manifestasi perdarahan, hepatomegali, hipotensi dan syok. Diagnosaklinis DBD ditetapkan berdasarkan penetapan derajat tingkat keparahan penderita secara klinis dengan menggunakan kriteria WHO 1997 yang terbagi atas 4 tingkatan:

Derajat 1: Ditandai dengan adanya demam mendadak 2-7 hari, keluhan yang tidak spesifik dan uji tourniquet positif.

Derajat 2: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 1 disertai perdarahan spontan pada kulit atau tempat lain.

(27)

Derajat 3: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 2 disertai kegagalan sistem sirkulasi yaitu: frekuensi nadi cepat, lemah, tekanan nadi sempit (≤20mmHg) atau hipotensi,kulit teraba lembab, dingin dan penderita gelisah.

Derajat 4: Terdapat seluruh manifestasi DBD derajat 3disertai manifestasi syok, dimana tekanan darah tidak terukur dan nadi tidak teraba.

Manifestasi laboratorium dapat dilihat dari beberapa parameter seperti terjadinya leukopenia dengan jumlah neutrofil menonjol, limfosit atipikal(15%),

trombositopenia (∑ trombosit ≤ 100.00/mm3), homokonsentrasi, abnormalitas, pembekuan darah, hiponetremia, hipoalbuminemia dan peningkat kadar SGOT/SGPT (Hadinegoro, 2004).

Pemeriksaan serologi adalah salah satu alat untuk membantu membuat konfirmasi diagnosa infeksi virus Dengue. Pemeriksaan yang banyak dipakai dalam praktek adalah hemaglutinasi inibisi dan dengan menggunakan Enzime-linked Immunosorbent Assay (ELISA)(DEPKES RI, 2004).

II.4.1. Hemaglutinasi Inhibisi

Sampai saat ini uji hemaglutinasi inhibihi (HI) masih menjadi patokan baku WHO untuk mengkonfirmasi dan klarifikasi jenis virus Dengue. Pemeriksaan ini dilakukan berdasarkan cara Clark & Cassal, dimana menemukan sepasang serum yang diambil saat akut (pada waktu penderita datang) dan saat konvalesens (2-3

(28)

minggu dari saat sakit), dengan interval minimal 1 minggu dari pengambilan pertama. Prinsip metode ini adalah mengukur kadar Immunuglobulin(Ig), yaitu IgM dan IgG melalui prinsip adanya kemampuan antibodi antidengue menghambat reaksi hemaglutinasi darah angsa. Pemeriksaan IgM dan IgG dapat untuk menetukan jenis infeksi virus dengue apakah primer atau sekunder. Pada anak diatas 1 tahun infeksi primer biasanya terkait dengan penampilan klinis ringan, sedang infeksi sekunder dapat tampil dengan penampilan klinis berat.

II.4.2. Uji ELISA anti Dengue

Dikatakan uji Enzime-linked immunusorbent Assay (ELISA) anti dengue ini mempunyai sensivitas yang sama dengan uji hemaglutinasi inhibit. Prinsip mtode ini adalah mendeteksi adanya IgM dan IgG dalam serum penderita dengan cara menangkap antibodi yang beredar dalam darah penderita. Uji ELISA ini tidak mengadakan reaksi silang dengan golongan flavivirus lain, sehingga metode ini lebih spesifik dibandingkan metode hemaglutinasi inhibit.

II.5. RT-PCR

Polymerase Chain Reaction (RCI)adalah suatu metode biologi molekuler untuk mengamplifikasi (membuat banyak kopian) Deoxyribo Nucleic Acid (DNA) tanpa menggunakan organisme hidup. PCR biasanya digunakan dalam penelitian di laboratorium biologi dan kedokteran, seperti mendeteksi penyakit herediter, dignosis penyakit infeksi, cloning jen dan uji paternitas.

(29)

II.5.1. Sejarah RT-PCR

PCR ditemukan pertama kali oleh Kary Mulis pada tahun 1985, suatu

prosedur yang efektif untuk pelipatgandaan sekuen DNA target dan dapat memperoleh 106 - 10 9 kali jumlah DNA target awal. Proses pelipatgandaan ini dikenal dalam istilah biologi molekuler sebagai amplifikasi DNA.

RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR , dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Mula-mula RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunakan reverse trnscriptase yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA dan menghasilkan DNA yang dikenal dengan nama Cdna (Complement DNA). Hanya enzim jenis ini yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA karena polymerase DNA hanya dapat mensistensi dengan menggunakan cetakan DNA. Setelah DNA terbentuk, maka DNA itu dapat diamplifikasi seperti umumnya proses pada PCR. Jadi, RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi RNA yang kestabilannya jauh lebih rendah dibandingkan DNA (Sudjadi, 2008).

II.5.2. Pengunaan PCR

PCR digunakan untuk mengamplifikasi ranati pendek pada bagian tertentu dari rantai DNA. Proses PCR biasanya hanya dapat mengkopi hingga 10 kb (kb = kilo basa, 1 kb = 1000 pasang basa). Metode PCR tertentu dapat meng-copy hingga 40 kb,yang mana masih sangat kurang dibandingkan dengan kromosom DNA sel eukariotik, contohnya sel manusia berisi kira-kira 3 milyar pasang basa.

(30)

1) DNA cetakan, merupakan bagian fragmen DNA yang akan diamplifikasi. 2) Primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri fragmen

yang akan diamplifikasi.

3) DNA polimerase merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA. 4) Nukleotida dimana DNA polimerase membangun DNA baru.

5) Buffer, yang membarikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polimerase. Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, dimana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi.

II.5.3. Prosedur

Proses PCR berisi satu sel yang terdir 20-30 siklus.Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96°C untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting : dimana ikatan hidrogen yang menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa DNA cetakan dan primer telah terpisa sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal.

Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primer dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primer dan biasanya 5°C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat

(31)

menyebabkan primer tidak semuanya terikat pada DNA cetakan atau terikat tidak teratur.

Akhirnya DNA polimerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada primer dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantun DNA polimerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polimerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi.

Proses PCR terdiri dari langkah-kangkah berikut: Langkah 1 : Initialization

Pemanasan campuran pada temperatur 92°C selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polimerase dapat diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya.

Langkah 2 : Melting

Pemanasan pada temperatur 92°C selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.

Langkah 3 : Annealing

Pemanasan pada temperatur 53°C selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation

Pemanasan pada temperatur 72°C selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali.

(32)

Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses spanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 7°C setelah semalaman.

Hasil PCR dapat diidentifikasikan dengan menggunakan agarose gel electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agar agarose dan kemudian menghubungkan arus listrik pada agar terrsebut. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui agar menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu “ tangga DNA” yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam agar.

II.5.4. Reverse Transcription

Reverse transcription adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA komlementnya. Proses ini membutuhkan suatu enzim yang disebut : reverse transcriptase, yang diambil dari suatu retrovirus seperti : AMV (Avian Myeloblastosis Virus). Enzim yang biasanya secara bersama berhubungan dengan enzim reverse transciptase adalah enzim RNA-dependent DNA polymerase dan enzim DNA-dependent DNA polrmerase, yang bekerja sama membentuk transcriptase dengan arah yang berlawanan dengan arah stndar. Reverse transciptase adalh enzim yang dihasilkan oleh semua retrovirus untk mentranskrip informasi genetik virus dari RNA menjadi DNA, sehingga dapat berintegrasi ked alam genom host. (Sopian, 2006)

(33)

Dalam penelitian, reverse transcriptase menyebabkan data yang dikode pada rantai RNA dapat diubah menjadi bentuk DNA dan digunakan dalam PCR, sebab PCR tidak dapat mereplikasi molekul RNA secara langsung. Kombinasi proses reverse transcriptase dan PCR disebut RT-PCR (Sudjadi,2008).

(34)

BAB ІІІ

METODE PENELITIAN

III.1. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian adalah observasional dengan pendekatan potong lintang (cross sectional).

III.2. Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di instalasi Mikrobiologi Klinik Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan, dari bulan September 2008 sampai dengan bulan Januari 2009.

III.3. Bahan dan Cara Kerja

Bahan penelitian adalah serum penderita Demam Dengue/Demam Berdarah.

Dengue yang dirawat di Rumah Sakit Haji Adam Malik (RS. HAM), Rumah Sakit DR. pringadi, dan Rumah Sakit Herna di kota Medan. Darah penderita diambil dengan menggunakan semprit (syringe) 3 ml. pengambilan sampel serum penderita DD/DBD dengan gejala klinis lima hari pertama demam ( Singh K et al,2006) dan konfirmasi diagnosi DD/DBD sesuai dengan criteria WHO.

Pada penelitian ini, digunakan specimen darah akut. Setelah specimen diambil secara asepsis dengan menggunakan semprit, kemudian specimen disimpan dan dikirim dalam keadaan beku ( dry ice). Untuk mendapatkan serum, darah diputar 1500-2000 rpm selama 10-15 menit (Wuryadi, 2004) Setelah itu data masing-masin

(35)

sampel dimasukkan dalam lembar check list yang berisi mengenai informasi demografi pasien seperti nama, umur, jenis kelamin, alamat, dan pekerjaan, serta hasil pemeriksaan laboratorium. Untuk penelitian ini digunakan seratus sample serum penderita.

n≥ Z2 (0,5-α/2) .ρq e2

n = jumlah sampel

Z = nilai nol dari table Z yang besarnya tergantung dari nilai α yang ditentukan untuk α = 0,05; Zc = 1,96

p = proporsi penderita DD/DBD di Sumatera Utara = 0,32 q = 1-p

e = tingkat ketepatan n = 85

(36)

III.3.1. Kerangka Operasional

Pasien

Kriteria (+) Kriteria (-)

Data (Nama, Umur, Jenis Kelamin, Pekerjaan, Hasil Lab) Serum Penderita 0,5 cc

Ekstraksi

RT-PCR (menggunakan primers universal dan TS1) ANALISIS Elekroforesis

Gel Imanging (visualisasi) Tiep Virus Dengue

III.3.2. Ekstraksi RNA

Virus RNA diestrak 200µl aliquost yang berasal dari supernatan sel yang terinfeksi dengan menggunakan QIAαmp® Viral RNA Mini Kit dari Qiagen dengan mengikuti protokolnya. Untuk memeriksa sampel, diperlukan 140µl homogenate dari setiap sample. Untuk kontrol positif digunakan kultur sel yang mengandunng DEN 1, DEN 2, DEN 3, dan DEN 4 dalam jumlah volume yang sama. Untuk kontrol sel tanpa virus Dengue.

Ш.3.2.A. Peralatan

a. QIAamp MinElute Virus Spint Kit, terdiri dari: a) QIAamp MinElute Columns b) Collection Tubes

(37)

c) Buffer AL

d) Buffer AW1 (concentrate) e) Buffer AW2 (concentrate) f) Buffer AVE

g) Protease Resuspension Buffer h) Carrier RNA

i) QIAGEN®Protease b. Pipet tips 25µl (kuning)

c. Pipet tips 200µl (biru) d. Mikropipet

e. Tabung eppendorf f. Vortexer

g. Block heater h. Microcentrifuge i. Etanol (96-100%) j. Kulkas 4ºC

k. Freezer-20ºC dan -70ºC l. Alat elektroforesis m. Gel imaging n. Mesin PCR o. Homogeniger p. Disposable gloves

(38)

Ш.3.2.B. Ekstraksi Virus RNA

Langkah pertama adalah mempersiapkan Qiagen Protease dengan

menyampurkannya dengan 1,4µL buffer AVE, dicampur dan dipisahkan ke dalam lima sampai enam tabung eppendorf, masing-masing 250µL (untuk sepuluh reaksi), lalu disimpan pada suhu -20ºC.

Kemudian 310µL buffer AV ditmbahkan ke dalam tabung berisi RNA carrier, dicampurkan dan dipisahkan ke dalam lima tabung eppendorf masing-masing 62µL ( untuk 10 reaksi), lalu disimpan pada suhu -20ºC.

Langkah ketiga adalh mempersiapkan buffer AW-1, dengan menambahkan 25Ml etanol 96%-100%, dan kemudian disimpan di dalam suhu ruangan.

Terakhir adalah mempersiapkan buffer AW-2, dengan menambahkan 30Ml etanol 96%-100%, dan kemudian disimpan pada suhu ruangan.

Ш.3.2.C. Ekstraksi

Serumpenderita di masukkan ke dalam tabung eppendorf, lalu ditambahkan 300µl medium FBS. Kemudian, tabung eppendorf dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4°C.

Lalu 200µl supernatant hasil sentrifugasi diambil dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml yang berisi 25µl Qiagen protease.

Setelah itu ditambahkan 200µl buffer AL + Carrier RNA dan diinkubasi selama 15 menit dalm suhu 56°C. Lalu tabung eppendorf dimasukkan ke dalam

(39)

sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 250µl etanol ke dalam tabung eppendorf tersebut, ditutup dan dicampurkan dengan menggunakan vortexer selama 15 detik. Setelah divortex, diikunbasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit.

Setelah tabung eppendorf dikeluarkan dari sentrifuse, masukkan campuran dengan mikropipet ke dalam column, lalu tutup cap. Campuran kembali disentrifuse dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah selesai, keluarkan column, lalu buang collection tube dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru. Tambahkan 500µl buffer AW-1, lalu dimasukkan lagi ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah column kembali dikeluarkan dari sentrifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru dan tambahkan 500µl buffer AW-2. Columndisentrifuse kagi dan diputa dengan kecepatan 8000rpm selama 1 meit. Buang collection tube yang mengandung filtrate, masukkan column ke dalam collection tube baru. Kmudian ditambahkan 500µl etanol. Setelah itu, campuran dimasukkan kembali ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit. Setelah column dikeluarkan dari sentifuse, buang collection tube yang mengandung filtrate dan column dimasukkan ke dalam collection tube baru, buka tutupnya dan diinkubasi dalam 56°C selama 3 menit. Kemudian column dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge 1,5ml, dimasukkan 100µl buffer AVE atau RNAse-free water ke tengah-tengahmembran, ditutup, dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruangan.

(40)

Kemudian dimasukkan ke dalam sentrifuse dan diputar dengan kecepatan 14.000rpm selama 1 menit. Setelah itu column dibuang dan tabung microcentrifuge yang m mengandung RNA yang telah diekstraksi disimpan dalam suhu -70°C.

Ш.3.3. RT-PCR

Master mix dibuat dengan mencampurkan 25µl dari 2x reaksi mix (buffer yang terdiri dari 0,4 Mm dari dNTP, 3.2 Mm MgSO4),1 µl dari 10µM primer universal, 1µl dari 10µM primer D1, 1µl dari 10µM primer D2, 1µl dari 10µM primer D3, 1µl dari 10µM primer D4, 2µl superscript Ш RT, 4µl MGSO4 ditambahkan aquades sampai 20µl (Harris et al,1998). Master mix ini dicampurkan dengan pipeting dan di spin down.

RNA hasil ekstraksi dipersiapkan dengan memanaskan tabung pada 65°C selama 5 menit dengan menggunakan block heater, kemudian ditempatkan di dalam es selama mempersiapkan master mix. Kemudian 5µl RNA hasil ekstraksi ditambahkan ke dalam maxter mix, kemudian disentrifuse danagn kecepatan 8000rpm selama 1 menit.

Langkah Reverse Transcriptase (RT) dilakukan selama 30 menit untuk menghasilkan Cdna, kemudian diamplikasi dengan langkah Polimerase Chain Reaction (PCR) berikut : 94°C selama 2 menit untuk initial denaturation, 94°C selama 45 menit untuk denaturation, 51° selama 1 menit untuk anneling dan 68°C selama 1 menit untuk extension. Siklus ini diulangi sebanyak 40 kali sebelum final

(41)

extension 68°C selama 7 menit. Produk PCR ini disimpan pada suhu 4°C sebelum digunakan.

III.3.4 Elektroforesis

Mula-mula dibuat agarose 1% dengan cara : 10 ml 1XTAE buffer dicampur dengan 100 ml aquades (pengenceran 10x), lalu 50 ml larutan 1XTAE buffer tersebut dicampur dengan 1 gram agarose. Lalu dipanaskna dalam microwave sampai mendidih, kemudian ditambahkan 1:1000 SYBER safeTM dan tuang dalam cetakan agarose gel yang telah disediakan dengan jumlah sumuran (well) sesuai kebutuhan. Setelah gel agarose mengeras, dimaksukan ke dalam tangki (chamber) elektroforesis yang bersi 1X TAE buffer. Kemudian 5-10µ1 hasil PCR, yang telah dicampur dengan 1µ1 blue juice 2x, dimasukkan ke dalam sumur pada gel agarose, lalu masukkan pula 10µ1 Marker pada sumur terakhir.

Power supply kemudian dinyalakan pada posisi 80-100 V, DNA akan bergerak dari kutub negative ke kutub positif. Elektroforesisi dihentikan jika tanda biru mencapai ¼ bagian bawah (jangan sampai tanda biru hilang, karena kemungkinan hasil PCR ikut terlepas gari gel).

III.3.5. Gel Imaging

Setelah dielektroforesisi, gel agarosa dimasukkan ke dalam alat gel imaging untuk melihat hasil amplikasi RNA virus Dengue yang dilakukan dengan teknik RT-PCR. Pita molekul yang terlihat pada gel agarosa menandakan adanya segmen DNA, kemudian pita molekul tersebut dibandingkan dengan control positif dan market.

(42)

Buka file : gel doc, masukkan gel ke dalam alat foto. Kemudian tekan tombol : epi-white, sampai muncul di layer computer, kemudian matikan epi-white. Lalu tekan : autofocus, lalu tekan tombol UV, setelah muncul gambaran band pada gel di layer computer, tekan : freeze, lalu tekan : analyze, tekan : transform, buka file image, crop, save dan print.

(43)

BAB IV

HASIL PENELITIAN

Sampel penenilitian berupa 100 serum penderita DD dan DBD yang dikumpulkan dari tiga Rumah Sakit, yaitu Rumah Sakit Haji Adam Malik (RS.HAM), Rumah Sakit Dr. Pirngadi dan Rumah Sakit Herna di Kota Medan, Sumatera Utara, asl serum-serum yang diperoleh dapat dilihat dari table berikut:

Tabel 1. Serum Demam Berdarah Dengue yang dikumpulkan

Asal serum Jumlah

RS HAM 40

RS Pirngadi 37

RS Herna 23

Jumlah 100

Sampel – sampel tersebut kemudian diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus Dengue yang ada dalam serum penderita, setelah itu, hasil ekstraksi tersebut di RT-PCR menggunakan DEN 1. Hail dari RT-PCR ini kemudian dielektroforesa dan divisualisasi. Dapat disebut positif DEN 1 bila ditemukan pita ukuran 482 bp (base pairs). Pita tersebut dapat dibandingkan dengan pita penanda (marker) yang berukuran 500 bp. Gambar berikut menunjukkan hasil RT-PCR control positif dari masing –masing DEN dibandingkan dengan pita penanda yang digunakan.

(44)

Gambar 1. Hail RT-PCR control positif

Keterangan:

1. control positif DEN 1 : 119 bp 2. Kontrol positif DEN 3 : 290 bp 3. Kontrol positif DEN 4 : 398 bp 4. control positif DEN 1 : 482 bp 5. Marker 100 bp DNA ladder

(45)

Hasil RT-PCR virus DEN 1 yang didapat dari 100 sample serum penderita DD dan DBD adalah sebagai berikut:

Gambar 2. Hasil RT-PCR 1 sampai 100

Keterangan:

1. Pita Penanda 52. Sampel 49 : - 2. Kontrol negative 53. Sampel 50 : - 3. Kontol positif DEN 1 54. Sampel 51 : - 4. Sampel 1 : - 55. Sampel 52 : - 5. Sampel 2 : - 56. Sampel 53 : - 6. Sampel 3 : - 57. Sampel 54 : - 7. Sampel 4 : - 58. Sampel 55 : - 8. Sampel 5 : - 59. Sampel 56 : - 9. Sampel 6 : - 60. Sampel 57 : - 10. Sampel 7 : - 61. Sampel 58 : - 11. Sampel 8 : - 62. Sampel 59 : - 12. Sampel 9 : - 63. Sampel 60 : - 13. Sampel 10 : - 64. Sampel 61 : - 14. Sampel 11: - 65. Sampel 62 : - 15. Sampel 12 : - 66. Sampel 63 : - 16. Sampel 13 : - 67. Sampel 64 : - 17. Sampel 14 : - 68. Sampel 65 : - 18. Sampel 15 : - 69. Sampel 66 : - 19. Sampel 16 : - 70. Sampel 67 : - 20. Sampel 17 : - 71. Sampel 68 : -

(46)

21. Sampel 18: - 72. Sampel 69 : - 22. Sampel 19: - 73. Sampel 70 : - 23. Sampel 20: - 74. Sampel 71 : - 24. Sampel 21: - 75. Sampel 72 : - 25. Sampel 22: - 76. Sampel 73 : - 26. Sampel 23: - 77. Sampel 74 : - 27. Sampel 24: - 78. Sampel 75 : - 28. Sampel 25: - 79. Sampel 76 : - 29. Sampel 26: - 80. Sampel 77 : - 30. Sampel 27: - 81. Sampel 78 : - 31. Sampel 28: - 82. Sampel 79 : DEN 1 32. Sampel 29: - 83. Sampel 80 : - 33. Sampel 30: - 84. Sampel 81 : - 34. Sampel 31: - 85. Sampel 82 : - 35. Sampel 32: - 86. Sampel 83 : - 36. Sampel 33: - 87. Sampel 84 : - 37. Sampel 34: - 88. Sampel 85 : - 38. Sampel 35: - 89. Sampel 86 : - 39. Sampel 36: - 90. Sampel 87 : - 40. Sampel 37: - 91. Sampel 88 : - 41. Sampel 38: - 92. Sampel 89 : - 42. Sampel 39: - 93. Sampel 90 : - 43. Sampel 40: DEN 1 94. Sampel 91 : - 44. Sampel 41: - 95. Sampel 92 : - 45. Sampel 42: - 96. Sampel 93 : - 46. Sampel 43: - 97. Sampel 94 : - 47. Sampel 44: - 98. Sampel 95 : - 48. Sampel 45: - 99. Sampel 96 : - 49. Sampel 46: - 100. Sampel 97 : - 50. Sampel 47: - 101. Sampel 98 : - 51. Sampel 48: - 102. Sampel 99 : - 103. Sampel 100:

(47)

-Sampel nomor 1 sampai 100 didapat dari serum penderita DD dan DBD. Hasil RT-PCR menunjukkan pada sample 40 dan 79 ditemukan virus DEN 1.

Tabel 2. Gambaran serum Deman Berdarah Dengue yang mengandung DEN 1 berdasarkan asal Rumah Sakit

Jumlah pasien

Laki-laki Perempuan Asal Rumah Sakit

DEN 1 (+) DEN 1 (-) DEN 1 (+) DEN 1 (-)

Persentase serum DEN 3

RS H.Adam Malik 1 21 - 18 1%

RS Pirngadi 1 18 - 18 1%

RS Herna - 12 - 11 -

Total 2 51 - 47 2%

pada Tabel diatas sdapat dilihat bahwa serum penderita Demam Berdarah Dengue yang positif mengadung virus tipe 1 (DEN 1) ditemukan pada sample serum yang berasal dari Rumah Sakit Haji Adam Malik 1 orang (1%) dan 1 orang (1%) lagi bersal dari Rumah Sakit Pirngadi. Dari 100 sampel yang diperiksa, didapatkan hasil positif sebanyak 2%, pada kelompok usia 5 – 9 tahun dan kelompok 15 – 44 tahun dan berjenis kelamin laki – laki.

Tabel 3. Gambaran serum Deman Berdarah Dengue yang mengandung DEN 1 berdasarkan umur dan jenis kelamin

Jenis kelamin

Laki – laki Perempuan

Umur (Tahun)

DEN 1 (+) DEN 1 (-) DEN 1 (+) DEN 1 (-)

Persentase serum DEN 1

< 5 - 2 - 1 -

5 – 9 1 12 - 17 1%

10 – 14 - 6 - 4 -

15 – 44 1 25 - 23 1%

> 45 - 5 - 3 -

(48)

Sehingga, estimasi populasi virus DEN 1 pada populasi adalah di antar 1,946% - 1,974%.

Dari tabel diatas dapat dilihat bahwa dari 100 sampel serum penderita Demam Berdarah Dengue sesuai dengan kelompok umur dan jenis kelamin maka jumlah sample serum yang positif mengandung virus DEN 1 terdapat pada rentang usia 5 -9 tahun 1 orang (1%) dengan jenis kelamin laki-laki dan pada rentang usia 15 – 44 tahun 1 orang (1%) laki-laki.

(49)

BAB V PEMBAHASAN

Demam Dengue (DD) dan Demam Berdarah Dengue(DBD) adalah penyakit yang masih merupakan masalah kesehatan di seluruh dunia, trutama pada daerah tropis dan subtropics. Pada penelitian ini, dikumpulkan 100 sampel serum penderita DD dan DBD dari beberapa Rumah Sakit Umum di Kota Medan, yaitu Rumah Sakit Haji Adam Malik, Rumah Sakit Umum Dr. Pirngadi dan Rumah Sakit Herna. Masing-masing sample serum yang sudah diperoleh selanjutnya akan diekstraksi untuk mendapatkan RNA virus dari serum tersebut. RNA hasil ekstraksi kemudian di RT-PCR dengan primer DEN 1, yang kemudian hasilnya dielektroforesa dan divisualisasi. Virus Dengue tipe 1 (DEN 1) dikatakan positif bila diteumkan pita ukuran 482 BP, yang dibandingkan dengan pita penanda berukuran 500 bp.

Haisl penelitian dari 100 penderita Demam Berdarah Dengue diperoleh 2 sampel (2%) serum yang positif mengadung virus dengue tipe 1 (DEN 1). Sampel yang positif pengandung virus DEN 1 ditemukan dari sampel yang berasal dari Rumah Sakit Dr. Pirngadi 1 orang (1%) laki-laki, dan 1 orang lagi (1%) laki-laki berasal dari Rumah Sakit Haji Adam Malik.

Di Indonesia, dari tahun 2003 – 2005 pernah dilakukan penelitian oleh Litbang Jakarta bersama dengan Tropical Desease Center (TDC) Universitas Airlangga dan Namri II Laboratory, US Navy, untuk mencari virus Demam Berdarah Dengue. Hasil penelitian tersebut dipublikasikan DEPKES RI pada tahun 2007

(50)

dengan hasil ditemukan virus dengue tipe 2, 3 dan 4 (DEN 2, DEN 3, DEN 4), dan tidak ditemukan virus Dengue tipe 1 (DEN 1).

Penelitian yang dilakukan oleh Depkes tersebut menggunakan sampel penelitian dari serum penderita Demam BERdarah Dengue, sama dengan sample yang digunakan oleh peneliti, namun diperoleh hasil yang berbeda dimana penelitian yang dilakukan oleh Depkes tidak ditemukan adanya virus dengue tipe 1 (DEN 1) di Medan Sumatera Utara, sedangkan peneliti memperoleh hasil serum (2%) yang positif mengandung Virus Dengue tipe 1 (DEN 1). Hasil dari penelitian ini dapat menambah peta penyebaran virus dengue tipe 1 (DEN 1) di Indonesia.

Dari 100 sampel yang diperiksa, didapatkan hasil yang positif 1 orang (1%) pada kelompok usia 5 – 9 tahun 1 orang (1%) pada kelompok 15 – 44 tahun dan mempunyai jenis kelamin laki – laki. Estimasi populasi virus DEN 1 pada populasi adalah diantara 1,945% - 1,974%. Hasil ini mendukung pernyataan Soedarmo (2002), bahwa telah terjadi pergeseran populasi penderita DBD berdasarkan umur sejak tahun 1984 yaitu pada kelompok umur . 15 tahun. Namun begitu, serangan infeksi virus Dengue terhadap anak – anak harus tetap diwaspadai, mengingat 90% kasus DD/DBD terjadi pada kelompok umu , 15 tahun (Yulfi, 2006).

Pasa dasarnya infeksi virus dengue tipe 1 (DEN 1) tidaklah seberat infeksi virus dengue tipe lainnya, misalnya virus dengue tipe 3 (DEN 3) yang bertanggungjawab terhadap setiap kejadian KLB di Indonesia, sehingga kemungkinan penderita yang mengidap infeksi virus dengue tipe 1 (DEN 1) uuntuk berobat ke Rumah Sakit sangat kecil, selain itu juga dapat dimungkinkan penderita yang

(51)

mengidap infeksivirus dengue tipe (DEN 1) berasal dari luar kota Medan, seperti yang diungkapkan Hariadhi (2004) bahwa interaksi dari faktor hospes (host), lingkungan (environment) dan factor virus itu sendiri (agent) menjadikan prodominasi virus Dengue juga dipengaruhi oleh geografis suatu wilayah. Penemuan ini sangat penting, karena dengan ditemukannya virus dengue tipe (DEN 1) di kota Medan, dikhawatirkan akan menigkatkan kemungkinan terjadinya KLB Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue bila terjadi infeksi skunder dari serotype yang lain (Budhy, 2007).

Perbedaan hasil yang didapat tentunya menimbulkan berbagai pernyataan, apakah karena waktu penelitian yang berbeda, tempat penelitian yang berbeda, atau keparahan yang ditimbulkan oleh masing-masing serotype berbeda sehingga pada penelitian sebelumnya diperoleh hasil yang berbeda dengan penelitian yang dilakukan sekarang.

Serotype virus Dengue yang bersikulasi di Bangkok, Thailand ternyata berbeda pada kurun waktu yang berbeda pula. DEN 1 prodominan pada tahun 1990 – 1992, DEN 2 pada tahun 1973 – 1986 dan 1988 – 1989, DEN 3 pada Tahun 1987 dan 1995 – 1999, DEN 4 pada tahun 1993 – 1994. hanya DEN 3 yang berkaitan dengan terjadinya wabah. (Nisalak, 2003).

Seluruh serotype virus Dengue terdapat di Indonesia. DEN 3 merupakan serotype yang paling sering ditemui selama terjadinya KLB di banyak daerah, diikuti DEN 2, DEN 1, dan DEN 4, DEN 3 juga merupakan serotype yang paling dominant

(52)

yang berhubungan dengan tingkat keparahan penyaktit, diikuti DEN 2. (Suroso, 1999)

Dengan berhasilnya diketahui keberadaan virus DEN 1 di kota Medan, maka perlu ditongkatkan kewaspadaan akan terjadinya KLB dengan manifestasi DBD/SSD. Maka itu, perlu disusun langkah – langkah sistematis di kota Medan dalam melakukan virologic surveillance dalam kepentingan Early Warning Outbreak Recognition System (EWORS).

Banyak faktor mempengaruhi kejadian DBD, antara lain factor hospes, lingkungan dan faktor virus sendiri, factor hospes adalah kerentanan dari faktor imun, faktor lingkungan yaitu kondisi geografis, demografis berhubungan dengan mobilitas dan perilaku pendududk. Budhy Setya dari Universitas Airlangga pernah melakukan penelitian bahwa kota-kota besar seperti Jakarta, Surabaya, Medan, Maksar dan Mando, dimana mobilitas penduduk tinggi lebih sering dijumpai adanya infeksi skunder virus dengue. Adanya infeksi skunder virus dengue menunjukkan adanya serotype virus baru yang menginfeksi orang yang sama (Budhy, 2007).

Hal ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut apakah benar ada hubungan keberadaan virus dengue tipe 1 (DEN 1) yang ditemukan peneliti merupakan hasil infeksi skunder dari penderita Demam Berdarah Dengue sebelumnya. Sesuai dengan pernyataan Halstead bahwa pasien yang mengalami infeksi kedua kalinya dengan virus dengue serotype yang berbeda mempunyai resiko lebih besr menderita DBD dan SSD, sehingga dengan diteumkannya lebih dari 1 serotipe dengue disuatu wilayah memungkinkan makin tinggnya kasus DBD didaerah tersebut.

(53)

(54)

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN V.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian dan pembahasan yang diperoleh dari 100 sampel serum penderita DD/DBD yang diperiksa menggunakan RT-PCR, maka dapat diambil kesimpulan bahwa di Daerah Kota Medan Sumatera Utara masih memungkinkan munculnya kasus penderita DD/DBD, hal ini dibuktikan dengan ditemukan sample serum yang p[ositif mengandung virus tipe (DEN 1) di Rumah Sakit Haji Adam Malik 1 orang (1%) dan di Rumah Sakit Pirngadi 1 orang (1%).

V.2 Saran

1. Untuk mendeteksi pola distribusi penyebaran virus Demam Dengue/ Deman Berdarah Dengue di Kota Medan Sumatera Utara, perlu dilakukan penelitian lanjut untuk mencari serotype virus dengue tipe 2, 3 dan 4 (DEN 2, DEN 3, dan DEN $). Mengingat masih minimnya sumber informasi mengenai virus dengue serotype 1 (DEN 1) di Indoesia, perlu kiranya disarankan untuk dilakukan penkajian lebih mendalam tentang virus DEN 1 tersebut dengan tujuan untuk menghasilkan informasi yang lebih relevan dan berkesinambungan, sehingga hasilnya nanti diharapkan dapat membantu semua pihak guna menurunkan angka kesakitan dan kematian akibat DD/DBD di Indonesia khusunya di Medan Sumatera Utara.

(55)

DAFTAR PUSTAKA

Setya, B. 2007. Profil Serologis Infeksi Primer dan Sekunder Virus Dengue dari Berbagai Daerah di Jawa Timue. Post Graduate Airlangga University (website address: http//library@lib.unair.ac.id;library@unair.ac.id).

Carrington, CVF., Foster, J.E., Pybus, O.G., 2005. Invasion and Maintenace of Dengue Virus Type 2 danType 4 in the Americas. Journal of Virology; 79(23):14680-14687

Halestead, S.B. & Dee J. (2002). The Future of Dengue Vaccines. Lancet 360. p, 1243 -45

Hadinegoro, S.R: Soengeng, S; Suharyono, W; Thomas, S, 2002. Tata Laksana Demam Berdarah Dengue di Indonesia. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta. Hal 80 – 135

Hariadhi, S; Soegijanto, S, 2004. Pola Distribusi Serotipe Virus Dengue Pasa Beberapa Daerah Endimik di Jawa Timur Dengan Kondisi Geografis Berbeda. Hal 11 – 19

Harris, E; Robert, T.G; Smith, L; Selle, J et al. 1998. Typing of Dengue Viruses in Clinical Specimen and Mosquitoes by Single-Tube Multiplex Reverse Transcriptase PCR. Journal of Clinical Microbiology. Sept. 1998. p. 2534 – 9

Husaini, M, 2003. Entomologi Kedokteran. Cetakan Kedua. Hal. 61 – 90. Bagian Parasitologi FKUSU, Medan.

Levinson, W., Jawetz, E., 2000. Medical Microbiology & Immunology. 6th ed.pp 252 – 256. Lange Medical Books/McGraw-Hill.San Francisco

Nisalak A, Endy T.P, Nimmanitya S, Kalayanarooy S, Thisayakorn U, Scott R.M Burke DS, Hoke CH, Innis B. L, Vaughn D.W Serotype-specific Dengue Virus Circulation and Dengue in Bangkok, Thailand form 1973 to 1999. Am J Trop Medn Hyg. 2003; 68 (2) : 1919 -202.

Sing, K, Et Al. A Prospective Clinical Study on the Use of Reverse Transcriptation Polymerase Chain Reaction for the Early Diagnosis of Dengue Fever. 2006. The Journal of Moleculer Diagnostics. Vol 8. no. 5.

(56)

Soedarmo P. S. 2004. Masalah DEmam Berdarah Dengue di Indonesia. Fakultas Kodokteran Univesitas Indonesia. Jakarta. Hal1 – 13

Sopian, T. 2006, Aplikasi Teknologi PCR mendeteksi Flu Burung (http://64.203.71.11/kompas-cetak). 17 Mei 2008.

Sudjadi, 2008. Bioteknologi Kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Hal. 94 – 99 dan hal. 131 – 43

Suroso, Epidemiological situation of Dengue Haemorrhagic Fever and its Control in Indonesia. Proceeding Internasional Seminar on Dengue Fever/Dengue Haeramorrhagic. TDC – Airlangga University, Surabaya 1999.p. 11 – 14 Suroso T, Umar A. I. 2004 Epidemiologi dan Penaggulangan Penyakit Demam

Berdarah Dengue (DBD) di Indonesia saat ini. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. Hal 14 -31

Sutaryo, 2004. Perkembangan Patogenesis Demam Berdarah Dengue. Fakultas Kodonteran Universitas Indonesia. Jakarta. 32 – 43

Tim Penaggulangan DBD Depkes RI, 2004. Kasus Demam Berdarah Dengue (DBD) di Indonesia, Buletin Harian Tim Penanggulangan DBD Depaertemen Kesehatan R.I. Jakarta.

Tumbelaka A. R. 2002. Diagnosis Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue. Fakultas Kodokteran Universitas Indonesia. Jakarta Hal. 73 – 79

Wuryadi S. 2004. Diagnosis Laboratorium Infeksi Virus Dengue. Fakultas Kedokteran Univrsitas Indonesia. Jakarta. Hal. 55 – 62

Yulfi, H., 2006. Persistency of Transovarium Dengue Virus in Aedes aegypti avaible form : http://library_usu.ac.id/download/fk/pdf downloaded on 14 Februari 2008

(57)

Lampiran 1. Contoh Formulir Data Pasien

Formulir Pemeriksaan Kusus DD/DBD a. Informasi Umum

Nama lengkap : Umur :

Jenis Kelamin : pria wanita Alamat :

Pekerjaan :

b. Hasil Laboratorium 1. Laboratorium Rutin

- Leokosit < 5.000 sel/ml3 ya tidak - Trombosit < 100.000 sel/ml3 ya tidak - Hemokonsentrasi > 20% ya tidak

(58)

Lampiran 2. Hasil RT-PCR Virus dengue tipe 1 (DEN 1) dari specimen klinik di Rumah Sakit Kota Medan

SAMPEL RUMAH SAKIT UMUR JNS KEL DEN 3 (+/-)

1 RS PR 6 LK -

2 RS PR 11 PR -

3 RS PR 9 LK -

4 RS PR 8 PR -

5 RS PR 11 PR -

6 RS PR 18 LK -

7 RS HAM 58 LK -

8 RS HAM 18 LK -

9 RS H 14 LK -

10 RS H 16 PR -

11 RS PR 17 LK -

12 RS HAM 20 LK -

13 RS HAM 20 PR -

14 RS HAM 15 LK -

15 RS HAM 12 LK -

16 RS HAM 38 PR -

17 RS HAM 1.5 LK -

18 RS PR 24 PR -

19 RS PR 29 PR -

20 RS HAM 45 PR -

21 RS HAM 11 LK -

22 RS HAM 9 LK -

23 RS HAM 13 PR -

24 RS HAM 5 PR -

25 RS PR 9 PR -

26 RS PR 21 PR -

27 RS PR 44 LK -

28 RS PR 23 PR -

29 RS PR 22 PR -

30 RS PR 39 PR -

31 RS H 17 LK -

32 RS H 9 LK -

33 RS H 18 PR -

34 RS H 19 PR -

35 RS PR 21 PR -

36 RS H 25 LK -

(59)

38 RS PR 32 LK -

39 RS PR 25 LK -

40 RS PR 19 LK +

41 RS PR 29 LK -

42 RS PR 31 LK -

43 RS H 41 PR -

44 RS H 21 PR -

45 RS PR 49 LK -

46 RS PR 21 PR -

47 RS PR 21 PR -

48 RS PR 30 PR -

49 RS H 41 LK -

50 RS HAM 3 PR -

51 RS H 14 LK -

52 RS PR 15 PR -

53 RS H 40 LK -

54 RS H 9 PR -

55 RS PR 16 PR -

56 RS PR 19 LK -

57 RS PR 30 PR -

58 RS HAM 9 PR -

59 RS PR 30 LK -

60 RS PR 41 LK -

61 RS H 9 PR -

62 RS H 21 PR -

63 RS H 21 PR -

64 RS PR 22 PR -

65 RS PR 11 LK -

66 RS PR 66 PR -

67 RS H 12 PR -

68 RS HAM 24 PR -

69 RS H 16 LK -

70 RS HAM 6 PR -

71 RS HAM 9 PR -

72 RS HAM 8 LK -

73 RS HAM 4 LK -

74 RS HAM 6 PR -

75 RS HAM 5 LK -

76 RS HAM 43 LK -

77 RS HAM 25 LK -

(60)

79 RS HAM 7 LK +

80 RS HAM 8 LK -

81 RS HAM 9 LK -

82 RS HAM 6 PR -

83 RS H 52 LK -

84 RS PR 65 LK -

85 RS H 29 LK -

86 RS H 50 LK -

87 RS H 45 LK -

88 RS PR 39 PR -

89 RS HAM 8 PR -

90 RS HAM 5 PR -

91 RS HAM 6 LK -

92 RS HAM 7 LK -

93 RS HAM 8 PR -

94 RS HAM 7 PR -

95 RS HAM 8 PR -

96 RS HAM 5 LK -

97 RS HAM 7 LK -

98 RS HAM 8 PR -

99 RS HAM 6 PR -

(61)

Lampiran 3. Rencana Kegiatan Penelitian

September Oktober Nopember Desember Januari No Kegiatan

I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV 1. Pengumpulan

Serum penderita

2. Ekstrasi

3. RT-PCR dengan menggunakan Primer DEN 2

4 Elektoforesis dan