II.5.1. Sejarah RT-PCR PCR ditemukan pertama kali oleh Kary Mulis pada tahun 1985, suatu
prosedur yang efektif untuk pelipatgandaan sekuen DNA target dan dapat memperoleh 10
6
- 10
9
kali jumlah DNA target awal. Proses pelipatgandaan ini dikenal dalam istilah biologi molekuler sebagai amplifikasi DNA.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR , dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Mula-mula RNA diubah dulu menjadi DNA dengan menggunakan
reverse trnscriptase yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA dan menghasilkan DNA yang dikenal dengan nama Cdna Complement DNA. Hanya
enzim jenis ini yang dapat mensistensis DNA dengan cetakan RNA karena polymerase DNA hanya dapat mensistensi dengan menggunakan cetakan DNA.
Setelah DNA terbentuk, maka DNA itu dapat diamplifikasi seperti umumnya proses pada PCR. Jadi, RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi RNA yang kestabilannya
jauh lebih rendah dibandingkan DNA Sudjadi, 2008.
II.5.2. Pengunaan PCR
PCR digunakan untuk mengamplifikasi ranati pendek pada bagian tertentu dari rantai DNA. Proses PCR biasanya hanya dapat mengkopi hingga 10 kb kb =
kilo basa, 1 kb = 1000 pasang basa. Metode PCR tertentu dapat meng-copy hingga 40 kb,yang mana masih sangat kurang dibandingkan dengan kromosom DNA sel
eukariotik, contohnya sel manusia berisi kira-kira 3 milyar pasang basa. Dalam prakteknya, PCR membutuhkan beberapa komponen, yaitu:
Universitas Sumatera Utara
1 DNA cetakan, merupakan bagian fragmen DNA yang akan diamplifikasi.
2 Primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri fragmen
yang akan diamplifikasi. 3
DNA polimerase merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA. 4
Nukleotida dimana DNA polimerase membangun DNA baru. 5
Buffer, yang membarikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polimerase. Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, dimana mesin PCR
memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi.
II.5.3. Prosedur
Proses PCR berisi satu sel yang terdir 20-30 siklus.Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96°C untuk memisahkan
rantai. Langkah ini disebut melting : dimana ikatan hidrogen yang menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering
diperpanjang untuk memastikan bahwa DNA cetakan dan primer telah terpisa sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal.
Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primer dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing.
Temperatur pada langkah ini tergantung pada primer dan biasanya 5°C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat
Universitas Sumatera Utara
menyebabkan primer tidak semuanya terikat pada DNA cetakan atau terikat tidak teratur.
Akhirnya DNA polimerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada primer dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation.
Temperatur elongation tergantun DNA polimerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polimerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi.
Proses PCR terdiri dari langkah-kangkah berikut: Langkah 1 : Initialization
Pemanasan campuran pada temperatur 92°C selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polimerase dapat
diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya. Langkah 2 : Melting
Pemanasan pada temperatur 92°C selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.
Langkah 3 : Annealing Pemanasan pada temperatur 53°C selama 30 detik.
Langkah 4 : Elongation Pemanasan pada temperatur 72°C selama 1 menit.
Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali. Langkah 6 : Pertahankan campuran pada suhu 72°C selama 5 menit.
Universitas Sumatera Utara
Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses spanjang malam. DNA tidak
akan rusak pada temperatur 7°C setelah semalaman. Hasil PCR dapat diidentifikasikan dengan menggunakan agarose gel
electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agar agarose dan kemudian menghubungkan arus listrik pada
agar terrsebut. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui agar menuju arus positif. Ukuran dari hasil
PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu “ tangga DNA” yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam agar.
II.5.4. Reverse Transcription Reverse transcription adalah mengubah suatu molekul RNA menjadi DNA
Kategori