21 Buffer elektroda dibuat dengan melarutkan 10.5507 g asam sitrat
monohidrat dan 18.1650 g tris hidroksimetil aminometan ke dalam aquadest hingga volume satu liter dan pH akhir diatur sampai pH 6.0.
d. Pembuatan gel pati
Pembuatan gel pati yang mengandung 10 pati kentang dilakukan dengan melarutkan 10 g pati kentang ke dalam 100 ml larutan buffer gel. Diawali dengan
mencampur pati dengan sepertiga bagian buffer gel dan dua pertiga bagian dimasak terlebih dahulu dengan menggunakan hot plate sampai mendidih. Setelah
mendidih diangkat dan dicampurkan dengan campuran sepertiga buffer gel dan pati kemudian dimasak lagi sampai terlihat bening. Gel divakum selama kurang
lebih 30 detik. Setelah itu gel dituangkan ke dalam cetakan yang terlebih dahulu permukaan bagian atas telah diolesi parafin cair dan lubang pada kaki cetakan
telah ditutup dengan selotip. Setelah gel dingin cetakan gel ditutup dengan plastik yang telah diolesi parafin dan disimpan pada suhu kamar.
e. Ekstraksi enzim
Daun jarak pagar yang masih segar ditimbang sebanyak 100 – 200 mg lalu digunting halus dan digerus sampai halus dalam mortar yang telah ditambahkan
dengan 0.5 ml buffer pengekstrak dan pasir kuarsa, untuk mendapatkan ekstrak dari jaringan tanaman. Ekstrak jaringan ini kemudian diserapkan pada kertas
saring yang berukuran ± 0.5 cm x 0.5 cm. Kertas saring kemudian disisipkan ke dalam gel pati sesuai dengan urutan lubangnya. Pada salah satu lubang yang
paling pinggir disisipkan kertas saring yang telah diberi cairan bromophenol blue sebagai indikator mobilitas elektroforesis.
f. Elektroforesis
Selotip pada kaki cetakan gel dilepaskan, kemudian permukaan cetakan gel yang telah disisipi kertas saring ditutup dengan plastik bening yang telah
diolesi parafin cair. Cetakan gel tersebut dimasukkan ke dalam tray yang telah diisi larutan buffer elektroda. Kaki cetakan harus terendam dalam buffer
elektrode. Tray diletakkan dalam ruangan berpendingin atau lemari es pada suhu
22 antara 5-10
o
C. Elektroforesis dilakukan dengan menghubungkan tray dengan bagian anoda dan katoda pada power supply. Elektroforesis awal berlangsung
selama 1 jam pada tegangan listrik 50 volt, setelah 1 jam tegangan listrik dinaikkan menjadi 100 volt selama 4 jam.
g. Pembuatan larutan pewarna, pewarnaan dan pencucian
Setelah selesai elektroforesis, plastik penutup gel dibuka. Kertas saring yang telah disisipkan dikeluarkan dari lubang-lubangnya kemudian gel dibelah
secara horizontal menjadi dua atau tiga lapisan sesuai dengan ketebalannya. Lembaran gel dimasukkan ke dalam nampan kemudian diberi pewarna yang telah
disiapkan. Komposisi larutan pewarna untuk enzim Peroksidase PER, Esterase
EST, Aspartat aminotransferase AAT, Malat dehidrogenase MDH dan Alkohol dehidrogenase ADH disajikan pada Lampiran 2. Selanjutnya nampan
ditutup dengan aluminium foil dan disimpan pada suhu ruang sampai muncul pita- pita pada gel yang cukup jelas. Perendaman dalam larutan pewarna memerlukan
waktu antara satu sampai dua jam atau lebih. Dua jam kemudian gel dicuci dengan air bersih untuk menghilangkan sisa pewarna.
h. Interpretasi pola pita isozim
