20
Percobaan II : Analisis Isozim
Analasis isozim dari delapan genotipe jarak pagar dilakukan di laboratorium Hayati, Pusat Studi Bioteknologi dan Sumberdaya Hayati IPB.
Kegiatan analisis isozim meliputi penyiapan bahan tanaman, pembuatan buffer pengekstrak, buffer gel, buffer elektroda, pembuatan gel pati, ekstraksi enzim,
elektroforesis, pembuatan larutan pewarna, pewarnaan dan pencucian serta pengumpulan data.
a. Persiapan bahan tanaman
Bahan tanaman yang digunakan untuk analisis isozim adalah daun muda yang masih segar daun yang berada di bagian pucuk yang merupakan daun
kedua. Daun tanaman jarak pagar dipetik dari pohon di lokasi dan disusun pada kertas koran basah. Setelah itu masing-masing daun yang telah disusun dengan
koran basah dimasukkan ke dalam kantong plastik dan diberi label. Selanjutnya di laboratorium contoh daun tersebut dipindahkan ke dalam refrigerator untuk
digunakan sebagai bahan ekstraksi enzim.
b. Pembuatan buffer pengekstrak
Jaringan daun dianalisis berupa ekstrak bahan kasar, tanpa pemurnian protein yang rumit atau yang memerlukan tahapan-tahapan konsentrasi tertentu.
Fungsi buffer pengekstrak ini adalah dapat membantu menghancurkan sel dalam suatu jumlah minimum tanpa menimbulkan panas terhadap ekstrak dan perubahan
warna terhadap daun yang diekstrak. Buffer pengekstrak sebanyak 40 ml dibuat dengan melarutkan 0.07045 g L-asam askorbat, 0.1939 g L-sistein, 0.12 ml
Triton-X-100, 0.25 g PVP-40 dan 0.54 g Na
2
HPO
4
.2H
2
O, pH buffer diatur sampai 7.0.
c. Pembuatan buffer gel dan buffer elektroda
Larutan buffer gel dibuat dari L-Histidin monohidrat 1.048 g yang dilarutkan dengan aquadest sampai volume satu liter. Larutan buffer diatur
keasamannya dengan menambahkan Tris hingga pH 6.0.
21 Buffer elektroda dibuat dengan melarutkan 10.5507 g asam sitrat
monohidrat dan 18.1650 g tris hidroksimetil aminometan ke dalam aquadest hingga volume satu liter dan pH akhir diatur sampai pH 6.0.
d. Pembuatan gel pati
Pembuatan gel pati yang mengandung 10 pati kentang dilakukan dengan melarutkan 10 g pati kentang ke dalam 100 ml larutan buffer gel. Diawali dengan
mencampur pati dengan sepertiga bagian buffer gel dan dua pertiga bagian dimasak terlebih dahulu dengan menggunakan hot plate sampai mendidih. Setelah
mendidih diangkat dan dicampurkan dengan campuran sepertiga buffer gel dan pati kemudian dimasak lagi sampai terlihat bening. Gel divakum selama kurang
lebih 30 detik. Setelah itu gel dituangkan ke dalam cetakan yang terlebih dahulu permukaan bagian atas telah diolesi parafin cair dan lubang pada kaki cetakan
telah ditutup dengan selotip. Setelah gel dingin cetakan gel ditutup dengan plastik yang telah diolesi parafin dan disimpan pada suhu kamar.
e. Ekstraksi enzim
