BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor, selama 4 bulan mulai dari bulan Juni hingga
September 2012. Namun, pengamatan secara visual masih dilakukan sampai bulan Desember 2012.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini untuk membuat media adalah timbangan, botol kultur, oven, alumunium foil, karet gelang, pH meter,
timbangan analitik, labu erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, pengaduk, pipet, pipet volumetrik, magnetik stirer, kompor, panci, timmer dan autoclave. Peralatan
yang dibutuhkan untuk subkultur penanaman antara lain pinset, scalpel, laminar air flow cabinet, api spiritus, gunting, handsprayer, tisu kapas, cawan petri, wrap
plastic, jas laboratorium, masker, serta rak-rak untuk menempatkan botol kultur. Selain itu, diperlukan alat selama pengamatan antara lain alat tulis, tally sheet, dan
kamera. Media dasar berfungsi sebagai suplai nutrisi bagi eksplan. Media dasar
yang digunakan adalah Murashige dan Skoog MS Lampiran 3. Bahan yang dibutuhkan untuk membuat media MS adalah unsur makro, mikro dan vitamin.
Jenis media tanam berupa gel padat, menggunakan agar-agar khusus yang tidak berwarna dan bersifat netral gelrite. Gula digunakan sebagai cadangan makanan
dan aquades sebagai pelarut seluruh media. Zat pengatur tumbuh yang digunakan adalah BAP Benzyl Adenin Purin dengan taraf 1 mgl, 2 mgl, dan 3 mgl, serta
NAA Naphtalena Acetic Acid dengan konsentrasi 0.25 mgl, 0.5 mgl, dan 0.75 mgl.
Selain itu, dibutuhkan HCl dan KOH untuk mendapatkan pH yang sesuai dalam pembuatan media. Bahan tanaman yang digunakan adalah kalus suweg JW
383 koleksi Laboratorium Kultur Jaringan PKT Kebun Raya Bogor dalam media MS 0 hasil kultur sebelumnya.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Sterilisasi alat
Alat-alat yang akan digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pipet, pengaduk, gelas piala, labu takar dicuci
bersih menggunakan sabun cair. Kemudian, alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus alat-alat tersebut menggunakan
kertas tebal dan selanjutnya semua alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam oven selama kurang lebih 24 jam.
3.3.2 Sterilisasi lingkungan kerja
Pembersihan laboratorium dilakukan setiap hari dengan membersihkan lantai. Pengepelan dan penyemprotan rak kultur dengan alkohol juga dilakukan
secara berkala. Pembersihan tempat kerja laminar air flow cabinet dapat dilakukan dengan mengelap permukaan atau meja kerja menggunakan kapas atau
tisu yang telah disemprot alkohol 70. Lalu, sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus dinyalakan untuk
menghindari adanya kontaminan yang masuk ke dalam botol kultur ketika penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan maka dilakukan
penyemprotan dengan alkohol 70 terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman.
3.3.3 Pembuatan media tanam
Pembuatan media tanam dilakukan dengan mencampur seluruh bahan yang sudah ditimbang ke dalam satu liter aquades, kemudian diaduk hingga
merata. Langkah selanjutnya mengukur pH menggunakan pH meter, hingga didapatkan pH ±5.7. Kemudian masukkan agar gelrite 2.01 gramliter dan
panaskan hingga mendidih, selama proses pemanasan larutan harus tetap diaduk agar semua bahan tercampur dengan sempurna. Pemberian BAP dan NAA sesuai
dengan taraf yang direncanakan, larutan BAP yang digunakan adalah 0 mgl, 1 mgl, 2 mgl dan 3 mgl, sedangkan NAA yang digunakan adalah 0 mgl, 0.25
mgl, 0.5 mgl, dan 0.75 mgl. Pencampuran antara media dasar dengan hormon
diaduk hingga merata.
Penuangan dilakukan menggunakan wadah tuang yang berujung lancip untuk memudahkan masuknya larutan ke dalam botol. Volume penuangan kurang
lebih 15 ml setiap botol. Botol yang telah terisi media segera ditutup menggunakan alumunium foil dengan ukuran 10 cm x 10 cm kemudian ikat
dengan karet untuk mencegah kontaminasi, pengikatan dengan karet sebaiknya tidak terlalu rapat untuk mencegah pecahnya tutup botol saat proses sterilisasi
dengan tekanan dan suhu tinggi. Proses sterilisasi media dilakukan menggunakan autoclave pada suhu
121 ⁰C -126⁰C dan tekanan 1.5 atm selama 15 menit. Media yang sudah steril
ditempatkan pada ruang media kemudian disimpan selama 3 hari untuk memastikan media tidak mengalami kontaminasi.
3.3.4 Penanaman Subkultur
Penanaman eksplan suweg dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Eksplan berupa kalus kemudian dipotong dan dimasukkan ke dalam botol kuljar
yang sudah terdapat media perlakuan. Setelah selesai penanaman eksplan, botol kultur diletakan pada rak di ruang kultur.
3.4 Rancangan Percobaan
Percobaan ini dilakukan pada tahap subkultur dengan jenis eksplan kalus. Adapun rancangan percobaan ini dirancang dengan menggunakan percobaan
faktorial dua faktor dengan dasar rancangan acak lengkap RAL. Faktor pertama adalah konsentrasi BAP dengan empat taraf yaitu 0 mgl, 1 mgl, 2 mgl, dan 3
mgl. Faktor yang kedua yakni konsentrasi NAA dengan empat taraf yaitu 0 mgl, 0.25 mgl, 0.5 mgl, dan 0.75 mgl. Dengan demikian terdapat 4
2
= 16 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari tiga ulangan sehingga seluruhnya terdapat 240
satuan percobaan. Setiap ulangan terdiri dari lima botol yang berisi satu eksplan. Berikut merupakan gambaran interaksi antar faktor dari percobaan yang
dilaksanakan : Tabel 1 Interaksi faktor jenis zat pengatur tumbuh dengan konsentrasinya
BAP mgl NAA mgl
0.25 0.5
0.75
A1 A2
A3 A4
1
A5 A6
A7 A8
2 A9
A10 A11
A12
3
A13 A14
A15 A16
Keterangan: A1= Kontrol
3.5 Pengambilan Data
Kategori