DEPC-H
2
O dengan volume reaksi 20 µl. Proses sintesis cDNA dilakukan dengan alat PCR MJ Research TM 100 dengan menginkubasi campuran pada suhu 30
o
C selama 10 menit, kemudian inkubasi pada suhu 42
o
C selama 50 menit, inkubasi pada suhu 95
o
C selama 5 menit dan 20
o
C selama 5 menit. Keberhasilan dan kemurnian sintesis cDNA total dan kemurnian cDNA
total dari DNA genom diverifikasi dengan menggunakan PCR menggunakan primer forward ActF dan primer reverse ActR yang spesifik untuk ekson1 –
ekson2 dari aktin. Reaksi PCR yang digunakan adalah 1 µl cDNA total, Taq buffer 1X, dNTP mix 4 mM, ActF 20 pmol dan ActR 20 pmol, enzim Taq DNA
polimerase RBC 0,5 U, DMSO 4 dan dH2O sampai volume akhir 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 94
o
C, 5 menit; denaturasi pada 94
o
C, 30 detik; penempelan primer pada 55
o
C, 30 detik; pemanjangan pada 72
o
C, 1,5 menit; pasca PCR pada 72
o
C, 7 menit; dan pendinginan 20
o
C, 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Amplifikasi gen β actin ekson1-ekson2 dengan
menggunakan DNA genom melastoma sebagai cetakan digunakan sebagai kontrol terjadinya kontaminasi terhadap sintesis cDNA. Keberhasilan sintesis cDNA
diketahui dari terbentuknya pita berukuran 450 pb. Bila terjadi kontaminasi DNA genom pada cDNA, maka akan didapatkan 2 pita yang masing-masing berukuran
450 pb dari cDNA dan 550 pb dari DNA genom.
3.3.4 Analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR
Real Time PCR dilakukan dengan komposisi 5 µl cDNA, Power SYBR
Green PCR master mix 1X, primer MF atau ActF 50 nM, primer MR1 atau ActR2 50 nM dalam total reaksi 50 µL. Reaksi dilakukan untuk dua jenis gen, yaitu
MaMt2 sebagai gen target dan aktin sebagai gen pembaku. Deteksi ekspresi gen
dilakukan dengan menggunakan mesin Real Time PCR ABI Prism 7000 Sequence Detection System Applied Biosystem. Amplifikasi gen target dengan
menggunakan sistem touchdown PCR, yaitu dengan kondisi aktivasi enzim taq pada suhu 95
o
C selama 10 menit, kemudian diikuti dengan touchdown PCR yaitu denaturasi pada suhu 95
o
C selama 15 detik, annealing pada suhu 65
o
C selama 30 detik, dan sintesis DNA pada suhu 72
o
C selama 30 detik, dimana suhu annealing diturunkan 2
o
C setiap 3 siklus dari suhu awal 65
o
C sampai suhu annealing
mancapai 55
o
C. Saat suhu annealing mencapai 55
o
C, proses PCR dilakukan sebanyak 30 siklus.
Hasil dari Real Time PCR berupa kurva amplifikasi dari masing-masing reaksi dianalisa dengan menggunakan program Relative Quantification Study
dengan metode C
T
berdasarkan metode Livak 2001. Dari kurva amplifikasi dapat diperoleh nilai C
T
dari masing-masing reaksi. Nilai C
T
dari masing-masing perlakuan diperoleh dari normalisasi gen target dengan gen pembaku yaitu dengan
cara pengurangan nilai C
T
gen MT2 sebagai gen target dengan nilai C
T
gen aktin sebagai gen referensi, sehingga rumus untuk mendapatkan C
T
adalah : C
T
= C
T MT2
– C
T actin
. Sedangkan nilai C
T
diperoleh dengan cara pengurangan nilai C
T
dari perlakuan dan nilai C
T
dari kalibrator kontrol. Dalam penelitian ini terdapat dua kontrol yaitu pH 6 untuk mengetahui pengaruh perlakuan pH pada
ekspresi gen MT2 dan pH 4 dengan 0 mM Al untuk mengetahui pengaruh cekaman aluminium pada ekspresi gen MT2. Selanjutnya nilai
C
T
tersebut akan digunakan untuk mengetahui ekspresi RQ gen MT2 pada perlakuan relatif
terhadap kontrol dengan memasukkannya dalam rumus aritmatika 2
– CT
. Analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR ini diulang 2 kali dan
nilai RQ antar perlakuan dianalisis dengan menggunakan program Statistical Product and Service Solution
SPSS 13.0 for windows. Amplikon hasil dari Real Time PCR
, dicek pada gel agarose untuk mendapatkan ekspresi secara semikuantitatif dan kualitas pita DNA.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi RNA Total
