3.3.1 Perlakuan cekaman pada kultur air
Bahan tanam yang digunakan berasal dari stek pucuk tanaman M. affine L. yang diambil dari Jasinga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat. Pengadaan stek pucuk
dilakukan dengan memotong 4 - 6 ruas dari pucuk tanaman. Pucuk ditanam pada tanah Jasinga dan ditutup dengan plastik selama seminggu untuk mengurangi
penguapan. Setelah itu, tutup plastik dibuka dan dibiarkan selama sebulan sampai tumbuh akar. Selanjutnya pucuk yang mempunyai akar kurang lebih 1 cm ditanam
pada tempat yang berisi larutan nutrisi standar pH 6 dengan komposisi NH
4
NO
3
2,14 mM; NaH
2
PO
4
3,2 µM; K
2
SO
4
: KCl 1:1 0,77 mM; CaCl 1,2 mM; MgSO
4
0,82 mM; FeSO
4
35,8 µM; MnSO
4
9,1 µM; H
3
BO
3
46,3 µM; ZnSO
4
3,1 µM; CuSO
4
0,16 µM; NH
4 6
Mo
7
O
24
0,05 µM Watanabe et al. 1998 dan diberi aerasi, selama seminggu. Setelah satu minggu, tanaman siap untuk diberi perlakuan
cekaman pH dan Al. Percobaan dilakukan dengan dua macam perlakuan dan dua ulangan.
Perlakuan yang diberikan adalah pH dan konsentrasi Al. Perlakuan pH menggunakan 2 tingkat, yaitu pH 6 kontrol dan 4. Sedangkan perlakuan
konsentrasi Al yang diberikan adalah 0 mM kontrol, 0,8 mM dan 3,2 mM yang dilakukan pada pH 4. Sampel berupa daun dan akar diambil 1 minggu setelah
perlakuan untuk isolasi RNA total agar didapatkan ekspresi gen yang sesungguhnya.
3.3.2 Isolasi RNA total dari Melastoma affine L.
RNA total diisolasi dari akar dan daun secara terpisah, dari dua ulangan dan dua macam perlakuan, menggunakan metode CTAB Chang et al. 1993 yang
dimodifikasi. Untuk itu, 1 g bahan tanaman digerus didalam 10 ml buffer ekstraksi CTAB 2; Tris pH 9,5 0,1 M; EDTA 20 mM; NaCl 1,4 M; PVP
25000 2; dan β-mercaptoethanol 1 hangat hingga membentuk suspensi sel. Suspensi sel dimasukkan ke tabung 20 ml dan diinkubasi pada suhu 65
o
C selama 10 menit, kemudian didinginkan, dan ditambah 10 ml kloroform: isoamil alkohol
24 : 1. Setelah dicampur dengan menggunakan vortex, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 42000xg rotor SW11, Sorval Ultra Pro 80 pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 20 ml, ditambahkan ¼
volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada suhu -32
o
C selama 2,5 jam. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 42000xg pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE 1X Tris HCl pH
7,4 10 mM dan EDTA 1 mM kemudian dipindahkan ke tabung 1,5 ml. Suspensi RNA total diekstraksi dengan penambahan 1X volume fenol pH 9, divortex dan
disentrifugasi pada kecepatan 8000xg Jouan BR4i pada suhu 20
o
C selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan
dalam tabung 1,5 ml, dan diekstraksi kembali dengan 1X volume fenol : kloroform : isoamil alkohol 25:24:1, divortex dan disentrifugasi pada kecepatan
8000xg Jouan BR4i pada suhu 20
o
C selama 10 menit. Cairan bagian atas diambil, dimasukkan dalam tabung 1,5 ml, ditambah ¼X volume LiCl 10 M dan
kemudian diinkubasi pada suhu -32
o
C selama 2,5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 8000xg pada suhu 4
o
C selama 15 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total dibilas dengan penambahan 500 µl ethanol 70 dan disentrifugasi
pada kecepatan 5000xg pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan pengering vakum dan disuspensikan dengan 20 µl DEPC
H
2
O. Keutuhan RNA total diuji dengan melakukan elektroforesis RNA total di gel agarose 1 dalam buffer MOPS 1X MOPS 4,2 gl; Na asetat 0,41 gl; Na
2
EDTA 0,37 gl. Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transluminator GelDoc
Labquip setelah diwarnai dengan EtBr 0,5 gml selama 30 menit dan dibilas dengan air.
3.3.3 Pembentukan cDNA total
Kategori