volume LiCl 10 M dan diinkubasi pada suhu -32
o
C selama 2,5 jam. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 42000xg pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 µl TE 1X Tris HCl pH
7,4 10 mM dan EDTA 1 mM kemudian dipindahkan ke tabung 1,5 ml. Suspensi RNA total diekstraksi dengan penambahan 1X volume fenol pH 9, divortex dan
disentrifugasi pada kecepatan 8000xg Jouan BR4i pada suhu 20
o
C selama 10 menit. Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan
dalam tabung 1,5 ml, dan diekstraksi kembali dengan 1X volume fenol : kloroform : isoamil alkohol 25:24:1, divortex dan disentrifugasi pada kecepatan
8000xg Jouan BR4i pada suhu 20
o
C selama 10 menit. Cairan bagian atas diambil, dimasukkan dalam tabung 1,5 ml, ditambah ¼X volume LiCl 10 M dan
kemudian diinkubasi pada suhu -32
o
C selama 2,5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 8000xg pada suhu 4
o
C selama 15 menit. Cairan dibuang dan endapan RNA total dibilas dengan penambahan 500 µl ethanol 70 dan disentrifugasi
pada kecepatan 5000xg pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan pengering vakum dan disuspensikan dengan 20 µl DEPC
H
2
O. Keutuhan RNA total diuji dengan melakukan elektroforesis RNA total di gel agarose 1 dalam buffer MOPS 1X MOPS 4,2 gl; Na asetat 0,41 gl; Na
2
EDTA 0,37 gl. Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transluminator GelDoc
Labquip setelah diwarnai dengan EtBr 0,5 gml selama 30 menit dan dibilas dengan air.
3.3.3 Pembentukan cDNA total
Untuk mendapatkan RNA yang bebas dari DNA genom, suspensi RNA total diberi Dnase sebelum sintesis cDNA dengan mencampur 5 µg RNA total,
buffer Dnase I 1X, Dnase I bebas RNase Fermentas 0,2 U, dan DEPC H
2
O sampai volume total mencapai 10µl. Larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5
menit. Setelah itu ditambahkan EDTA 2,5 mM dan diinkubasi kembali pada suhu 65
o
C selama 10 menit. Sintesis cDNA total dilakukan dengan mencampur 5 g RNA total, First-
Strand Reverse Transcriptase Buffer 1X, oligo dT 20 pmol, dNTP 4 mM, DTT 10 mM, enzim SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 40 U, dan
DEPC-H
2
O dengan volume reaksi 20 µl. Proses sintesis cDNA dilakukan dengan alat PCR MJ Research TM 100 dengan menginkubasi campuran pada suhu 30
o
C selama 10 menit, kemudian inkubasi pada suhu 42
o
C selama 50 menit, inkubasi pada suhu 95
o
C selama 5 menit dan 20
o
C selama 5 menit. Keberhasilan dan kemurnian sintesis cDNA total dan kemurnian cDNA
total dari DNA genom diverifikasi dengan menggunakan PCR menggunakan primer forward ActF dan primer reverse ActR yang spesifik untuk ekson1 –
ekson2 dari aktin. Reaksi PCR yang digunakan adalah 1 µl cDNA total, Taq buffer 1X, dNTP mix 4 mM, ActF 20 pmol dan ActR 20 pmol, enzim Taq DNA
polimerase RBC 0,5 U, DMSO 4 dan dH2O sampai volume akhir 10 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR pada 94
o
C, 5 menit; denaturasi pada 94
o
C, 30 detik; penempelan primer pada 55
o
C, 30 detik; pemanjangan pada 72
o
C, 1,5 menit; pasca PCR pada 72
o
C, 7 menit; dan pendinginan 20
o
C, 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus. Amplifikasi gen β actin ekson1-ekson2 dengan
menggunakan DNA genom melastoma sebagai cetakan digunakan sebagai kontrol terjadinya kontaminasi terhadap sintesis cDNA. Keberhasilan sintesis cDNA
diketahui dari terbentuknya pita berukuran 450 pb. Bila terjadi kontaminasi DNA genom pada cDNA, maka akan didapatkan 2 pita yang masing-masing berukuran
450 pb dari cDNA dan 550 pb dari DNA genom.
3.3.4 Analisis ekspresi gen dengan menggunakan Real Time PCR
