22
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia,
pembuatan ekstrak, analisis fraksi n-heksana yang dilanjutkan dengan isolasi senyawa triterpenoidsteroid mengunakanKLT preparatif.Isolat yang diperoleh
diuji kemurniannya dengan KLT satu arah dan dua arah, karakterisasi isolat dengan spektrofotometri ultraviolet dan inframerah.
3.1. Alat-alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: alat-alat gelas Iwaki Pyrex, blender Philips, mikroskop Olympus, neraca analitik Vibra
AJ, neraca kasar Homeline, oven listrik Memmert, penangas air, penguap vakum putar Stuart, seperangkat alat kromatografi lapis tipis, seperangkat alat
penentu kadar air Pyrex, spektrofotometer UV dan IR Shimadzu dan tanur Nabertherm.
3.1.2 Bahan-bahan
Sampel yang digunakan adalah helaian daun nipah Nypa fruticans Wurmb.. Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas
proanalisa yaitu: amil alkohol, ammonia pekat, asam asetat anhidrida, asam klorida, asam nitrat, asam sulfat,benzena,besi III klorida,bismuth
IIInitrat,etilasetat,etanol,iodium,kaliumiodida,kloroform, metanol,n-
Universitas Sumatera Utara
23 heksana,raksa II klorida, silika gel 60GF
254
, serbuk magnesium, timbal II asetat dan toluen serta air suling.
3.2 Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi meliputi pereaksi Liebermann-Bouchard Wagner, dkk., 1984, asam sulfat 2 N, Molisch, Mayer, besi III klorida 1,
Dragendorff, Bouchardat, natrium hidroksida 2 N, asam nitrat 0,5 N dan timbal II asetat 0,4 M Depkes, RI., 1995.
3.2.1 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrida dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml Wagner, dkk., 1984
3.2.2 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling secukupnya hingga volume 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.3 Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N
hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,359 g raksaII klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Sebanyak 5 g kalium iodida pada wadah lain dilarutkan dalam 10 ml airsuling,
kemudian keduanya campur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.5 Pereaksi besi III klorida 10
Sebanyak 10 g besi III klorida ditimbang, dilarutkan dalam air suling
Universitas Sumatera Utara
24 sehingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,6 g bismuth III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 2 ml asam klorida pekat, lalu ditambahkan 10 ml air suling. Pada wadah lain dilarutkan 6g
kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan dengan 7 ml asam klorida pekat dan 15 ml air suling Depkes, RI., 1995.
3.2.7 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling dan sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodida dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 gkristal natrium hidroksida ditimbang, dilarutkan dalam air suling sehingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.9 Pereaksi asam nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.2.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas CO
2
hingga 100 ml Depkes, RI., 1995.
3.3 Pengambilan Dan Pengolahan Sampel 3.3.1 Pengambilan sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah helaian daun nipah yang diambil dari Jl.Chinghuan, desaPayabakong, Kec. Medan Labuhan,
Universitas Sumatera Utara
25 Sumatera
Utara. Pengambilan sampeldilakukan secara purposif tanpamembandingkan dengan sampel yang sama dari daerah lain.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Jl. Raya Jakarta – Bogor Km. 46 Cibinong 16911 Bogor – Indonesia
Nurani, 2015.
3.3.3 Pembuatan simplisia
Helaian daun nipah dibersihkan daripengotor dan tulang daunnya dibuang,dicucidengan air bersih,ditiriskan lalu ditimbang berat
basahnya.Selanjutnya dikeringkan di lemari pengering pada suhu ± 40°C hingga rapuh.Sampel yang telah kering diserbuk dengan blender dan disimpan dalam
wadah kering tertutup rapat.
3.4 Karakterisasi Simplisia
Karakterisasi simplisia meliputi penetapan kadar air WHO, 1998, penetapan kadarabu, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam, penetapan kadar
sari yang larut dalam air dan penetapan kadar sari yang larut dalam etanol Depkes, RI., 1995.
3.4.1 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alatterdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima 10 ml. a.
Penjenuhan toluen Sebanyak200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan kedalam labu
Universitas Sumatera Utara
26 alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan kedalam labu alas bulat.Kemudian labu dipanaskan selama 15 menit.Setelah
toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan sampai 4
tetes untuk tiap detik.Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung
penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua
volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat di dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen terhadap berat sampel
yang telah dikeringkan.
3.4.2 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselen yang telah terlebih dahulu dipijar dan ditara,
kemudian diratakan.Krus dipijarkan sampai bobot tetap.Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.4.3 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
Universitas Sumatera Utara
27 dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, dicuci dengan air panas.
Residu dankertas saring dipijar sampai bobot tetap.Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.4.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisiadimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1 liter menggunakan labu
bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam
cawan dangkal berdasarkan rata yang telah ditara.Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu 105
o
C hingga bobot tetap.Kadar sari yang larut dalam air dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.4.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 95 menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6
jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring dengan cepat untuk menghindarkan penguapan dari etanol, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai
kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara.Sisa dipanaskan sampai kering pada suhu 105
o
C hinggabobot tetap.Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.
3.5 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa triterpenoidsteroid Harbone, 1966; Farnsworth,
1966, alkaloid,
glikosida,saponin Depkes RI, 1995, flavonoiddan tanin Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
28
3.5.1 Pemeriksaan triterpenoidsteroid
Sebanyak 1 gserbuk simplisiadirendam dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam kemudian disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada
sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-BurchardLB Farnsworth,
1966.Timbulnya warna merah ungu atau hijau biru menunjukkan adanya triterpenoidsteroid.
3.5.2 Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a.
diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
diambil 3 tetes filtrat, lalu ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua
dari tiga percobaan di atas.
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dan 3 bagian air suling, ditambahkan dengan asam
klorida 2 N hingga pH larutan 2, direfluks selama 10 menit, dinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II
asetat 0,4 M dikocok dan didiamkam selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat diekstraksi dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 bagian isopropanol,
ini dilakukan sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C.sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan ini
Universitas Sumatera Utara
29 digunakan untuk percobaan berikut: larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung
reaksi, diuapkan di atas penangas air, sisanya ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui
dinding tabung. Jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya gula.
3.5.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditimbang, ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, didinginkan. Ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan
didiamkan.Lapisan benzena dipisahkan dan disaring.Lapisan benzena dikocok dengan 2 ml natrium hidroksida 2 N dan didiamkan.Jika lapisan air berwarna
merah intensif dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon.
3.5.5 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, kedalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
3.5.6 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, dimasukkan dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik, jika terbentuk buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih
tidak hilang menunjukkan adanya saponin.
Universitas Sumatera Utara
30
3.5.7 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditimbang, disari dengan 10 ml air suling selama 15 menit lalu disaring. Filtratnya diencerkan dengan air suling sampai
tidak berwarna.Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes larutan pereaksi besi III klorida 10 .Apabila terjadi warna biru atau hijau kehitaman
menunjukkan adanya tanin.
3.6 Pembuatan Ekstrak
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut n- heksana.
Cara kerja: Serbuk simplisia sebanyak 400 g dimasukkan ke dalam wadah kaca
berwarna gelap, lalu ditambahkan pelarut n-heksana sampai serbuk simplisia terendam, dibiarkan selama 2 hari sambil sekali-kali diaduk. Pisahkan maserat,
ampas dimaserasi kembali dengan pelarut n-heksanadengan cara yang sama di atas, maserat dipisahkan. Semua maserat yang diperolehdigabung, kemudian
diuapkan dengan alat rotary evaporatordengan suhu ±40
o
C, hasilnya diperoleh ekstrak.
3.7 Analisis Ekstrak n-Heksana Secara KLT
Ekstrak n-heksana dianalisis secara KLT menggunakan plat pra lapis silikal gel 60 GF
254
dan fase gerak n-heksana-etilasetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 sebagai penampak bercak digunakan
pereaksi LB.
Universitas Sumatera Utara
31 Cara kerja:
Ekstrak n-heksana daun nipah ditotolkan pada plat pra lapis silikal gel 60 GF
254
yang sebelumnya telah diaktifkan, kemudian dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap pengembang dan ditutup rapat. Sesudah
pengembangan selesai plat dikeluarkan dan dikeringkan di udara, plat disemprot dengan larutan penampak bercak pereaksi LB. Warna bercak yang terjadi diamati
dan dihitung harga Rf-nya.
3.8 Isolasi Senyawa TriterpenoidSteroid Secara KLT Preparatif