Tujuan Metode Autentikasi Berbasis DNA

yang lebih banyak dan analisisnya lebih cepat dan handal dibandingkan dengan protein Comi et al. 2005; Mackie et al. 1999. Autentikasi spesies berbasis DNA secara teknis dilakukan setelah diamplifikasi melalui proses PCR Polymerase Chain Reaction. DNA tersebut selanjutnya digunakan dalam identifikasi spesies dengan teknik-teknik seperti FINS Forensically Informative Nucleotide Sequencing Espiñeira et al. 2009, RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Rea et al. 2009, SSCP Single Strand Conformation Polymorphisms Colombo et al. 2005, real time PCR Pafundo et al. 2005, RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Martinez Yman 1999 dan DNA barcoding Filonzi et al. 2010. Teknik DNA barcoding merupakan teknik yang mulai banyak dikembangkan untuk mengidentifikasi suatu spesies, karena relatif mudah dilakukan dan murah dibandingkan teknik lainnya Wong Hanner 2008. Teknik ini biasanya dilakukan dengan menjadikan gen cythochrome b cyt b dan cythochrome c oksidase I COI pada DNA mitokondria mtDNA sebagai target Filonzi et al. 2010. Kedua gen tersebut digunakan karena ditemukan dalam jumlah besar di mtDNA dan dapat menjadi penanda spesies pada mahluk hidup eukariot. Selain itu, gen tersebut memiliki tingkat keragaman yang tinggi namun terdapat suatu kecocokan pada ekspresi gen dari perbedaan yang ada sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu spesies. Hasil analisis DNA barcoding dalam proses autentikasi juga tidak dipengaruhi oleh penggunaan bahan-bahan tambahan yang digunakan pada suatu produk, karena setiap spesies memiliki karakteristik genetik yang berbeda-beda, sehingga kesalahan analisis dapat dihindari. Melihat hal tersebut maka pengembangan teknik DNA barcoding dalam penelusuran dan pendeteksian cepat penipuan perdagangan tuna perlu dilakukan, diharapkan nantinya teknik ini dapat dikembangkan secara luas untuk mencegah terjadinya penipuan dengan biaya yang relatif murah.

1.2 Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan optimasi metode DNA barcoding dalam autentikasi aneka produk tuna Thunnus sp, serta mengetahui keaslian bahan baku yang digunakan untuk pembuatan produk dari sampel yang digunakan. 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tuna

2.1.1 Klasifikasi

Ikan tuna merupakan ikan ekonomis penting yang termasuk dalam golongan ikan pelagis. Ikan ini merupakan spesies penting dalam perdagangan perikanan dunia, karena banyak dimanfaatkan sebagai sasimi dan ikan kaleng. Ikan tuna yang termasuk dalam famili Scombridae dan subfamili Thunnini memiliki karakteristik yang mirip dengan spesies lainnya dari famili Scombridae. Ikan tuna dan spesies mirip tuna dalam famili Scombridae dapat diklasifikasikan dalam 4 genus, yaitu Thunnus, Euthynnus, Katsuwonus, dan Auxis, dengan jumlah spesies sebanyak 15 spesies Majkowski 2007. Taksonomi dan klasifikasi ikan tuna menurut Collette Nauen 1983 adalah : Phylum : Chordata Subphylum : Vertebrata Superclass : Gnathostomata Class : Osteichthyes Subclass : Actinopterygii Infraclass : Teleostei Superorder : Acanthopterygii Order : Perciformes Suborder : Scombroidei Family : Scombridae Subfamily : Thunnini Genus : Thunnus 8 species Katsuwonus 1 species Euthynnus 3 species Auxis 2 species Ikan tuna memiliki tubuh berbentuk tegak, memanjang dan fusiform streamline dengan dua buah sirip dorsal terpisah yang memiliki satu jari-jari keras pada jari-jari pertamanya dan sirip kaudal berbentuk bulan sabit. Sirip ventral berukuran lebih kecil atau sama dengan sirip pektoral, serta terletak menjorok kebelakang dari dasar sirip pektoral. Seluruh ikan scombroids memiliki finlet dibelakang sirip dorsal dan sirip anal, serta sepasang caudal peduncle keel di tengah pangkal ekornya. Sirip dorsal pertama dan sirip anal pertama dapat melipat ke dalam lipatan, sedangkan sirip pektoral dan sirip ventral menekan ke dalam tubuh pada saat berenang dengan cepat. Ikan ini memiliki empat lekuklengkung insang pada setiap sisinya dan filamen insangnya mengeras sebagai gill rays Collette Nauen 1983. Ciri morfologi ikan tuna dari genus Thunnus juga berbeda-beda. Ikan tuna sirip biru bluefin tuna merupakan spesies tuna terbesar yang panjangnya dapat mencapai 5 meter dengan berat mencapai 850 kg. Ikan ini tersebar di seluruh perairan hangat dan sejuk, termasuk laut mediterania dan laut hitam, dan sepanjang pantai Atlantik Eropa. Ikan tuna sirip biru merupakan ikan tuna yang paling terancam punah diantara spesies tuna lainnya, akibat kegiatan overfishing. Ikan tuna albakora albacore tuna merupakan ikan tuna yang paling mudah dikenali dengan sirip pektoral yang memanjang, seperti pedang, dengan perpanjangan sirip dorsal kedua hingga undermeath. Persebaran ikan tuna albakora mirip dengan tuna sirip biru, namun dapat berenang lebih jauh ke utara bersamaan dengan arus hangat dan pada musim dingin berenang ke selatan kembali. Ikan ini biasanya berada di Samudera Pasifik dan selalu bermigrasi setiap tahunnya Van Nostrand’s Scientific Encyclopedia 2005. Ikan tuna sirip kuning yellowfin tuna merupakan ikan tuna yang hanya ditemukan di samudera dengan perairan yang hangat. Panjang ikan ini dapat mencapai lebih dari 2,5 meter dengan berat lebih dari 225 kilogram. Ciri khas spesies ini adalah memiliki bentuk sirip lancip, sirip dorsal kedua lancip, dan sirip anal yang mirip. Kedua sirip terdapat tambahan sisik dan di bagian perut depat terlihat warna kuning mengkilap. Dalam satu tahun bobot ikan ini dapat bertambah hingga 27 kg. Ikan tuna mata besar bigeye tuna memiliki karakteristik morfologi yang sangat mirip dengan ikan tuna sirip kuning, tetapi memiliki sirip pektoral yang lebih pendek dan mata yang lebih besar, serta memiliki habitat pada kolom perairan yang lebih dalam Van Nostrand’s Scientific Encyclopedia 2005. Gambar 1. Ikan tuna FAO 2010 Ikan tuna merupakan ikan perenang cepat yang memiliki kebiasaan untuk bermigrasi sepanjang hidupnya sehingga dapat ditemukan di beberapa perairan, bahkan spesies tertentu dapat ditemukan hampir di seluruh perairan dunia. Kebiasaan ikan tuna untuk bermigrasi didukung oleh sistem metabolisme tuna yang dapat mengatur jumlah panas yang ada di dalam tubuh untuk mencapai kondisi biologis yang efektif FAO 2010. Kemampuan metabolisme tuna untuk mengatur jumlah panas didalam tubuhnya dilakukan dengan Rete mirabile yang dapat memindahkan panas dari pembuluh darah vena ke pembuluh darah arteri untuk mengurangi pendinginan permukaan tubuh dan menjaga otot tetap hangat sehingga tuna mampu berenang lebih cepat dengan energi yang lebih sedikit Block Stevens 2001. Selain itu, kandungan mioglobin yang tinggi pada daging ikan tuna juga mendukung kemampuan tuna untuk bermigrasi. Kandungan mioglobin yang tinggi pada daging ikan tuna membuat daging tuna menjadi berwarna merah muda sampai merah tua Knower et al. 1999. Spesies tuna dari genus Thunnus merupakan komoditas utama dalam pasar tuna dunia. Spesies dari genus Thunnus yang banyak diperdagangkan adalah tuna sirip kuning T. albacares, tuna mata besar T. obesus, tuna albakora T. alalunga, tuna sirip biru atlantik T. thynnus, tuna sirip biru pasifik T. orientalis dan tuna sirip biru selatan T. maccoyii. Selain itu, ikan cakalang Katsuwonus pelamis yang termasuk dalam genus Katsuwonus juga menjadi spesies penting dalam perdagangan spesies tuna dunia. Ketujuh spesies tersebut merupakan komoditas utama pada pasar tuna dunia karena menguasai lebih dari 80 dari jumlah ikan tuna di pasar internasional FAO 2010. Penangkapan ikan tuna dapat dilakukan dengan berbagai alat tangkap, seperti rawai tuna, pukat cincin, pancing huhate, dan tombak harpoon. Selain itu, saat ini ikan tuna mulai dibudidayakan di perairan yang tertutup seperti di daerah teluk, karena ketersediaannya di alam semakin sedikit Joseph et al. 2010.

2.1.2 Karakteritik Mutu Perdagangan Tuna

Nilai ekonomis tiap spesies ikan tuna berbeda-beda, tergantung pada permintaan pasar dan ketersediaannya di alam. Ikan tuna sirip biru yang biasa digunakan untuk produk sashimi merupakan spesies yang paling tinggi nilainya mencapai 23,35 dolar AS per kilogram dibandingkan spesies lainnya, seperti tuna sirip kuning 6,23 dolar AS per kilogram dan cakalang 4,20 dolar AS per kilogram Globefish 2011. Selain itu, nilai ekonomis ikan tuna juga dipengaruhi oleh tempat ikan tersebut diperoleh. Ikan tuna sirip biru yang besar di laut yang tertutup budidaya memiliki nilai yang lebih rendah dibandingkan yang ditangkap dari samudera Majkowski 2007. Ikan tuna untuk produk kaleng, spesies albakora memiliki harga yang paling tinggi, yaitu 200-350 yen per kilogram hal ini dikarenakan ikan ini memiliki daging berwarna putih. Kemudian diikuti oleh spesies tuna sirip kuning 180-250 yen per kilogram dan cakalang 110-160 yen per kilogram. Harga yang relatif rendah pada ikan yang digunakan untuk pengalengan merupakan akibat dari sangat besarnya hasil tangkapan ikan tersebut, terutama dalam kasus cakalang dan tuna sirip kuning. Saat ini, ikan tuna dari spesies Thunnus tonggol longtail tuna semakin penting untuk pengalengan dan perdagangan internasional. Konsumsi tuna dan spesies yang mirip tuna dalam bentuk produk selain ikan kaleng dan sashimi meningkat Majkowski 2007.

2.2 Metode Autentikasi Berbasis DNA

Autentikasi dan identifikasi produk merupakan proses yang dilakukan untuk mengetahui komposisi dan kandungan bahan baku yang digunakan untuk membuat suatu produk. Metode autentikasi berbasis DNA merupakan metode yang paling banyak digunakan saat ini, karena memiliki spesifitas dan sensitifitas yang lebih baik dibandingkan metode berbasis protein protein spesifik spesies. Selain itu, metode ini juga sederhana, mudah digunakan dan hasil yang diperoleh dapat diketahui dengan cepat Comi et al. 2005; Lockley Bardsley 2000. Deoxyribose Nukleic Acid DNA merupakan unit terkecil di dalam sel yang berisi sifat keturunan suatu mahluk hidup dan dapat ditemukan pada nukleus DNA inti dan organel-organel dalam sitoplasma DNA mitokondria Schwagele 2005. Penggunaan DNA sebagai ciri suatu spesies memiliki beberapa kelebihan, yaitu lebih termostabil dari pada protein, lebih sensitif, tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan, serta hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai sumber material genetik Teletchea et al. 2005. Sebagai material genetik, DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu spesies dengan mencari gen target yang menjadi ciri khusus dari suatu spesies. Saat ini, penggunaan DNA mitokondria mtDNA sebagai gen target semakin banyak dilakukan Kyle Wilson 2007. Kelebihan yang dimiliki oleh mtDNA sebagai target dalam identifikasi spesies, diantaranya adalah berevolusi lebih cepat dibandingkan DNA inti, berukuran lebih kecil dibandingkan DNA inti, hanya diwariskan induk betina, terdapat beberapa salinan didalam sel dan sekuensi lengkap DNA mitokondria beberapa organisme perairan telah diketahui Teletchea et al. 2005; Lockley Bardsley 2000; Mackie et al. 1999. Perbedaan antara DNA inti dengan DNA mitokondria dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Perbedaan antara DNA mitokondria dengan DNA inti Parameter DNA mitokondria DNA inti Ukuran Kecil Besar Lokasi di dalam sel Mitokondria Inti sel Kecepatan evolusi Lebih cepat dari DNA inti Lebih lambat dari mtDNA Keturunan Hanya diwariskan induk betina Diwariskan oleh induk jantan dan betina Sumber : Teletchea et al. 2005; Mackie et al. 1999 Teknik utama dalam autentikasi berbasis DNA adalah PCR Polymerase Chain Reaction. PCR merupakan teknik yang dilakukan untuk memperbanyak potongan DNA target dengan cepat secara in vitro. Proses PCR memerlukan empat komponen utama, yaitu DNA target, pasangan primer oligonukleotida, enzim DNA polimerase stabil terhadap suhu tinggi dan dNTP deoksiribonukleotida trifosfat Teletchea et al. 2005. Proses dalam PCR merupakan suatu siklus sehingga segmen DNA yang diinginkan dapat digandakan secara eksponensial dengan reaksi rantai polimerase yang berulang-ulang Lockley Bardsley 2000. Siklus yang terjadi dalam PCR adalah denaturasi pita ganda double-stranded DNA target, penempelan annealing primer oligonukleotida pada DNA pita tunggal single-stranded dan ekstensi pemanjangan primer yang dikatalisis oleh DNA polimerase Unseld et al. 1995. Proses yang terjadi dalam proses PCR dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2. Proses dalam teknik PCR Sumber : Anonim 2007 Informasi yang diperoleh dari DNA sebagian besar berasal dari sekuensi produk PCR. Produk PCR dapat juga dilakukan screening tanpa melakukan sekuensi untuk membedakan spesies apabila tidak memiliki akses terhadap fasilitas sekuensi secara langsung. Hal ini dilakukan dengan menjadikan amplicons sebagai subjek untuk inkubasi dengan variasi yang luas dari enzim restriksi dan observasi empiris Lockley Bardsley 2000. Berbagai macam metode autentikasi berbasis DNA yang telah berhasil dilakukan adalah dengan teknik hibridisasi DNA Gil 2007, Species-specific primer Lin Hwang 2008, FINS Wen et al. 2010, PCR-RFLP Wen et al. 2010, PCR-SSCP Rehbein 1999, RAPD Martinez Yman 1999, real-time PCR Pafundo et al. 2009 dan DNA barcoding Wong Hanner 2008. Perbandingan teknik identifikasi spesies berbasis DNA dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Perbandingan teknik identifikasi spesies berbasis DNA Hybridization Species- specific primer RFLP SSCP RAPD Traditional sequencing DNA barcoding Dapat digunakan pada bahan yang sudah terdegradasi X X X X Membutuhkan sedikit sampel DNA X X X X X X Protokol sederhana X X X X X Deteksi bahan campuran X X Efisiensi waktu X X X X X X Tidak membutuhkan pengetahuan sebelumnya X X X Dapat diterapkan antar laboratorium X X X X Standarisasi melalui Taxa yang luas X Keterangan : Teknik yang ditandai dengan ‘X’ menunjukkan keutamaan yang dimiliki setiap teknik Hanya diterapkan pada fragmen kecil dalam beberapa kasus sampel terdegradasi Sumber : Wong Hanner 2008

2.3 DNA Barcoding