3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan bulan Oktober sampai Desember 2010. Bertempat di Laboratorium Bahan Baku Hasil Perairan Depertemen Teknologi
Hasil Perairan dan Laboratorium Genetika Depertemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu, serta Laboratorium Penyakit Hewan Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi sampel produk ikan tuna segar dan produk ikan tuna olahan. Sampel tuna segar merupakan ikan tuna jenis
Thunnus albacares yang diperoleh dari industri pengolahan tuna PT. Perikanan Nusantara, di Benoa, Bali dan dikirim dalam bentuk tuna steak segar dengan
pengiriman langsung. Selanjutnya sampel olahan yang digunakan adalah produk sushi dan sashimi ikan tuna dan tuna steak yang dibeli dari restoran dan
supermarket yang ada di sekitar Bogor. Bahan-bahan lain yang juga digunakan adalah bahan untuk proses ekstraksi
DNA, yaitu berupa nitrogen cair, larutan CTAB cetyltrimethyl ammonium bromide 2, 20,2 mgml proteinase-K Fermentas, 20 µgml RNAase
Fermentas, larutan PCI 25 phenol : 24 chloroform : 1 isoamilalkohol, larutan CIA 24 chloroform : 1 isoamilalkohol, isopropanol, etanol 70 dan buffer TE
pH 8,0. Bahan yang digunakan untuk proses PCR adalah pasangan primer COI1 forward 5’-TTCTCCACCAACCACAARGAYATYGG-3’ dengan reverse 5’-
CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3’ dengan konsentrasi 0,1-1,0 µM, pasangan primer COI3 forward : 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAAT
CATAAAGATATCGGCAC-3’ dengan reverse : 5’-CAGGAAACAGCTATGA CACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3’ dengan konsentrasi 0,1-1,0 µM
dan data urutan basa nukleotida bersumber dari Ward et al. 2005, PCR master mix yang terdiri dari 2X DreamTaq Green buffer™, dNTPs dan 4 mM MgCl
2
Fermentas, serta nuclease free water. Bahan untuk elektroforesis adalah buffer TBE 1X, gel agarosa Fermentas, 100 bp DNA ladder Vivantis, 6x loading dye
dan ethidium bromida Fermentas. Bahan yang digunakan untuk analisis DNA barcoding adalah bahan yang digunakan untuk proses sekuensi dengan metode
Sanger Sanger 1975, yaitu 10x Genetic Analyzer Running Buffer, EDTA, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan terdiri dari alat untuk preparasi sampel produk tuna adalah stearoform berisi es curai untuk pengangkutan sampel, kemasan
plastik, gunting, cutter, pinset, scalpel, mortar, termos, dan tabung eppendorf 1,5 ml. Alat yang digunakan dalam proses ekstraksi DNA sampel adalah
waterbath shaker, sentrifuga dan pipet mikro. Proses amplifikasi DNA target PCR dilakukan dengan menggunakan Applied Biosystem GeneAmp PCR System
9700 96-well aluminum sample block module. Proses elektroforesis dilakukan dengan Bio Rad Mini-Sub
®
Cell GT Cell elektroda platinum, ECX Compact Transilluminators Vielber Lourmart untuk visualisasi dan kamera digital untuk
mendokumentasikan hasil yang diperoleh, pipet mikro, microwave, timbangan digital sensitifitas hingga 1 mg dan gelas ukur. Pengukuran konsentrasi DNA
sampel menggunakan GeneQuant analyzer Applied Biosystem. Analisis DNA barcoding dilakukan menggunakan Applied Biosystem 3730xl Automatic
Squencer 96-kapiler dan piranti lunak Clustal W2 dan TreeView.
3.3 Prosedur Penelitian