21
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian
Pengambilan sampel dilakukan pada 3 titik yang berbeda pada hati dan limpa secara acak. Hal tersebut dianggap sebagai 3 kali ulangan isolasi DNA pada
masing-masing sampel. Sebelum dilakukan amplifikasi DNA dengan nested-PCR, dilakukan pemeriksaan terhadap kandungan DNA genom pada semua sampel hasil
isolasi. Keberadaankandungan isolat DNA kemudian dicek menggunakan elektroforesis gel agaros 2. Elektroferogram hasil isolasi DNA disajikan pada
Gambar 5. Tampak bahwa isolasi DNA menggunakan kit dari hati dan limpa berhasil dengan baik, kecuali H1 Hati 0 Gy Gambar 5a.
a
b
Gambar 5. Elektroforegram genom DNA pada gel agarose 2. H1, Hati 0 Gy; L1, Limpa 0 Gy; H2, Hati 175 Gy dengan booster; L2, Limpa 175 Gy dengan booster;
H3, Hati 175 Gy tanpa booster; dan L3, 175 Gy tanpa booster.
Hasil isolasi DNA dari sampel hati dan limpa kemudian diamplifikasi menggunakan nested-PCR. Metode ini telah banyak digunakan pada penelitian
penyebab penyakit infeksi seperti Plasmodium Sulistyaningsih 2007. Nested- PCR adalah jenis PCR yang menggunakan dua kali proses PCR. Hasil PCR
nested-1 dicek menggunakan elektroforesis gel agaros 2. Hasil amplifikasi pada nested-1 mempunyai ukuran DNA target yang lebih besar dari nested-2 yaitu
sebesar 1640 bp Michael 2005. Gen targetnya adalah 50S ribosomal protein L21. Amplifikasi PCR menggunakan ekstrak DNA P. berghei sebagai kontrol positif.
Salah satu sumur pada gel agaros hanya diisi dengan mix PCR sebagai kontrol negatif yang bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminan selama proses
amplifikasi berlangsung. Elektroforegram hasil PCR nested-1 disajikan pada Gambar 6.
a
b
Gambar 6 Elektroforegram nested-1 pada gel agarose 2. M. Marker, H1. Hati 0Gy, L1. Limpa 0 Gy, H2. Hati 175 Gy dengan booster, L2. Limpa 175
Gy dengan booster, H3. Hati 175 Gy tanpa booster, L3. 175 Gy tanpa booster, K+ kontrol positif, K- kontrol negatif.
Data hasil PCR nested-1Gambar 6 diketahui bahwa tidak ada DNA yang muncul dan terdeteksi pada
gel agarose. Hal ini disebabkan karena terlalu rendahsedikitnya hasil DNA yang diamplifikasi. Ukuran DNA ini sangat besar
yakni 1640 bp base pair.
Hasil amplifikasi DNA yang diperoleh dari nested-1 selanjutnya diamplifikasi dengan PCR nested-2. PCR nested-2 digunakan untuk memfokuskan
wilayah amplifikasi pada nested-1. DNA target pada PCR nested-2 mempunyai ukuran yang lebih kecil daripada nested-1 yaitu sebesar 240 bp Singh et al.1999.
Gen targetnya adalah 50S ribosomal protein L21. PCR nested-1 dan nested-2 mempunyai gen target sama yaitu 50S ribosomal protein L21 karena nested-PCR
adalah PCR bersarang yaitu daerah produk PCR nested-2 berada di dalam produk PCR nested-1. Produk PCR nested-1 merupakan daerah genus Plasmodium
sedangkan produk PCR nested-2 adalah daerah spesies spesifik. Elektroforegram hasil PCR nested-2 menggunakan gel agaros 2 disajikan pada Gambar 7 Tabel
4.
a b
c
Gambar 7 Elektroforegram nested-2 pada gel agaros 2. M. Marker, a H1. Hati 0Gy, L1. Limpa 0 Gy , b H2. Hati 175 Gy dengan booster, L2. Limpa
175 Gy dengan booster, c H3. Hati 175 Gy tanpa booster, L3. 175 Gy tanpa booster, K+ kontrol positif, K- kontrol negatif.
240 bp 240
240 bp
Tabel 4. Data elektroforegram hasil PCR nested-2
Organ yang diambil Kode
Sampel Adatidaknya pita
DNA240bp Adatidaknya
P. berghei Hati 0 Gy
H1 Tidak
- H1
Tidak -
H1 Tidak
- Limpa 0 Gy
L1 Tidak
- L1
Tidak -
L1 Tidak
- Kontrol positif
K+ Ada
+ Kontrol negatif
K- Tidak
- Hati 175 Gy tanpa booster
H2 Tidak
- H2
Tidak -
H2 Tidak
- Limpa 175Gy tanpa booster
L2 Tidak
- L2
Tidak -
L2 Tidak
- Kontrol positif
K+ Ada
+ Kontrol negatif
K- Tidak
- Marker
M Ada
Hati 175 Gy dengan booster H3
Tidak -
H3 Tidak
- H3
Tidak -
Limpa 175 Gy dengan booster L3
Tidak -
L3 Tidak
- L3
Tidak -
Kontrol positif K+
Ada +
Kontrol negatif K-
Tidak -
Keterangan:+ = ada pendaran pita DNA ; - = tidak ada pendaran pita DNA
B. Pembahasan
Kategori